李 皓，董建華，袁紫倩，胡俊靖，趙偉明

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山核桃林地土壤真菌群落結(jié)構(gòu)研究

李 皓，董建華，袁紫倩，胡俊靖，趙偉明

（杭州市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310022）

采用16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)分析杭州臨安區(qū)正常生長(zhǎng)和不良生長(zhǎng)狀況2種山核桃林地土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，生長(zhǎng)不良山核桃林地與正常林地真菌優(yōu)勢(shì)類群相同，不同樣地中子囊菌門Ascomycota、接合菌門Zygomycota、擔(dān)子菌門Basidiomycota均為優(yōu)勢(shì)類群，但相對(duì)豐度不同，正常林地土壤中擔(dān)子菌門和接合菌門的相對(duì)豐度高于生長(zhǎng)不良林地。在屬的分類水平上，正常林地土壤中小畫線殼屬、鐮刀霉屬和土赤殼屬的相對(duì)豐度明顯低于生長(zhǎng)不良林地。生長(zhǎng)不良林地土壤真菌多樣性高于正常林地，Shannon-Wiener指數(shù)，ACE指數(shù)，Chao1指數(shù)與土壤pH之間呈顯著負(fù)相關(guān)（<0.05），與有機(jī)質(zhì)、堿解氮和交換性酸顯著正相關(guān)（<0.05）。

山核桃；土壤真菌；群落結(jié)構(gòu)；16S rDNA測(cè)序

山核桃為我國(guó)特有的干果和木本油料樹種，主要分布于浙皖交界的天目山系[1]。浙江省杭州市臨安區(qū)是山核桃主產(chǎn)區(qū)，種植面積和產(chǎn)量都居全國(guó)首位。由于長(zhǎng)期采用高強(qiáng)度的經(jīng)營(yíng)方式，過量施用化肥和化學(xué)除草劑，許多林地土壤環(huán)境急劇惡化[2-3]。土壤環(huán)境的改變，導(dǎo)致山核桃生長(zhǎng)不良，根系枝條死亡，產(chǎn)量大幅下降。要解決這一問題，亟需研究土壤環(huán)境發(fā)生了怎樣的變化，以便提出山核桃林地土壤科學(xué)管理措施。

土壤微生物是土壤環(huán)境的組成部分，其種群結(jié)構(gòu)對(duì)植物健康狀況有影響。土壤微生物中，真菌除了在氨化、硝化、氮轉(zhuǎn)化、纖維素分解過程中發(fā)揮著重要的作用[4-5]之外，還通過與植物相互作用，進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)[6]。近些年，許多植物土壤微生物群落研究都采用高通量測(cè)序技術(shù)[7-8]。該技術(shù)基于16S rDNA測(cè)序，通過對(duì)Reads過濾，OTUs聚類進(jìn)行物種分類和豐度分析，再采用Alpha多樣性分析揭示不同樣品群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性的差異。

本文采用基于16S rDNA的高通量測(cè)序技術(shù)分析正常生長(zhǎng)和不良生長(zhǎng)山核桃林地土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和豐度，為山核桃林地的土壤管理和高效栽培提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于浙江省杭州市臨安區(qū)龍崗鎮(zhèn)林坑村，地理坐標(biāo)119°05′35" ~ 119°06′49" E，30°09′27" ~ 30°10′40" N，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，氣候溫和，年均降水量1 628.6 mm，年平均氣溫15.8℃，年平均日照時(shí)數(shù)為1 939 h，全年無霜期234 d。2016年5月，在研究區(qū)內(nèi)開展山核桃林分生長(zhǎng)狀況調(diào)查。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，研究區(qū)內(nèi)的林分多數(shù)為人工純林，林齡在20 ~ 30 a，株行距5 m×6 m。根據(jù)林分生長(zhǎng)狀況將山核桃林分為2類：（1）正常，山核桃長(zhǎng)勢(shì)良好；（2）生長(zhǎng)不良，多數(shù)植株樹葉稀少，枝條枯死或整株死亡。2016年8月，隨機(jī)選擇3個(gè)正常林地（樣地4，樣地5，樣地6）和3個(gè)生長(zhǎng)不良林地（樣地1，樣地2，樣地3），每個(gè)樣地面積為666.67 m2，海拔187 ~ 230 m，土層厚度90 ~ 100 cm，正常林地內(nèi)近3 a未施化肥，生長(zhǎng)不良林地之前一直施化肥，出現(xiàn)山核桃生長(zhǎng)不良癥狀后停施，近1 a未施化肥。

1.2 試驗(yàn)材料

2016年8月17日，在每個(gè)樣地內(nèi)隨機(jī)設(shè)5個(gè)采樣點(diǎn)，去除表面雜草和浮土，采集0 ~ 20 cm 土層中的土壤，將每個(gè)樣地5個(gè)樣點(diǎn)采樣土壤充分混合后，一部分用聚乙烯袋密封，帶回實(shí)驗(yàn)室置于－80℃冰箱中保存，另一部分樣品自然風(fēng)干，用于測(cè)定土壤化學(xué)性質(zhì)。

1.3 試驗(yàn)方法

土壤化學(xué)性質(zhì)測(cè)定：土壤化學(xué)性質(zhì)包括pH、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、有效磷、速效鉀和交換性酸。其中，土壤pH采用pH計(jì)（土水比1:2.5）電位法測(cè)定；有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀外加熱法；堿解氮采用堿解擴(kuò)散法；有效磷采用Olsen法；有效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法；土壤交換性酸采用氯化鉀交換—中和滴定法[9]。

真菌基因組DNA提取和16S rDNA擴(kuò)增與測(cè)序[10]：所有樣品真菌基因組DNA提取和16S rDNA擴(kuò)增與測(cè)序工作委托生工生物工程（上海）有限公司完成。實(shí)驗(yàn)流程為：對(duì)提取到的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，查看基因組DNA的完整性與濃度。利用Qubit 2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)需加入的DNA量。PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的通用引物。PCR結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，采用生工瓊脂糖回收試劑盒（cat:SK8131）對(duì)DNA進(jìn)行回收。回收產(chǎn)物用Qubit 2.0定量，根據(jù)測(cè)得的DNA濃度，將所有樣品按照1:1的比例進(jìn)行混合；混合后充分震蕩均勻。該混合樣品可用于后續(xù)的樣品建庫(kù)（加測(cè)序標(biāo)簽）與測(cè)序。

測(cè)序分析流程：采用Flash軟件融合雙末端序列，而后通過各樣品barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品，并對(duì)各樣本序列做QC。去除非靶區(qū)域序列及嵌合體，采用RDPclassifier將序列進(jìn)行物種分類，將多條序列根據(jù)其序列之間的距離來對(duì)它們進(jìn)行聚類，以序列之間的相似性97%作為域值分成操作分類單元（OTU）。相同的OTU數(shù)量越多說明樣本間真菌種類越相近。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用不同分類水平的OTU分析，說明山核桃林地土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。采用Alpha多樣性分析，計(jì)算Shannon-Wiener指數(shù)，ACE指數(shù)，Chao1指數(shù)，Coverage等，衡量每個(gè)樣本的物種多樣性[11]。使用SPSS 19.0對(duì)不同樣地土壤化學(xué)性質(zhì)與真菌多樣性指數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析。

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)：

ACE指數(shù)：

式中，i表示含有條序列的OTU數(shù)目，rare表示含有“abund”條序列或者少于“abund”的OTU數(shù)目，abund表示多于“abund”條序列的OTU數(shù)目，“abund”為“優(yōu)勢(shì)”O(jiān)TU的閾值，默認(rèn)為10。

Chao1指數(shù)：

式中，chao1表示估計(jì)的OTU數(shù)，obs表示實(shí)際OTU數(shù)，1表示只有1條序列的OTU數(shù)目，2表示只有2條序列的OTU數(shù)目。

Coverage：

式中，1=只含有1條序列的OTU的數(shù)目，=抽樣中出現(xiàn)的總的序列數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣地的基本化學(xué)性質(zhì)分析

各樣地土壤基本化學(xué)性質(zhì)見表1。

由表1中可以看出，生長(zhǎng)不良的林地（樣地1，樣地2，樣地3）pH均值低于正常林地（樣地4，樣地5，樣地6號(hào)），有機(jī)質(zhì)堿解氮和交換性酸的均值高于正常林地。pH低和交換性酸高說明生長(zhǎng)不良林地酸化嚴(yán)重，堿解氮含量高可能是由于之前施用化肥，導(dǎo)致林地土壤氮素積累較多。

表1 不同樣地土壤基本化學(xué)性質(zhì)

Table 1 Soil chemical properties in 6 sample plots

2.2 不同樣地土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

通過OTU分析得出，在相似水平為97%的條件下，6個(gè)樣地中土壤真菌共有5門19綱74目134科271屬。在門的分類水平上，包括壺菌門Chytridiomycota，聚合菌門Glomeromycota，子囊菌門Ascomycota，接合菌門Zygomycota，擔(dān)子菌門Basidiomycota，其中子囊菌門、接合菌門和擔(dān)子菌門為主要類群。樣地4，樣地5，樣地6土壤中擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度（19.68%，21.36%，26.57%）和接合菌門的相對(duì)豐度（21.73%，30.88%，29.36%）高于樣地1，樣地2，樣地3。

表2 不同樣地土壤真菌優(yōu)勢(shì)門相對(duì)豐度

Table 2 Relative abundance of dominant Phylum in 6 sample plots

在屬的分類水平上，被孢霉屬，小畫線殼屬，鐮刀霉屬和土赤殼屬是優(yōu)勢(shì)屬，樣地4，樣地5，樣地6土壤中被孢霉屬的相對(duì)豐度（12.95%，11.25%，13.44%）高于樣地1、樣地2、樣地3，小畫線殼屬的相對(duì)豐度（1.33%，1.89%，1.97%）、鐮刀霉屬的相對(duì)豐度（1.44%，1.14%，1.22%）和土赤殼屬的相對(duì)豐度（1.03%，1.64%，1.25%）均低于樣地1，樣地2，樣地3。

表3 不同樣地真菌優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度

Table 3 Relative abundance of dominat genera in 6 sample plots

2.3 不同林地土壤真菌Alpha多樣性分析

由表4樣地土壤真菌多樣性分析顯示，6個(gè)樣地Shannon-Wiener多樣性指數(shù)排序?yàn)椋簶拥?>樣地1>樣地3>樣地6>樣地4>樣地5，指數(shù)越大，說明群落多樣性越高；ACE多樣性指數(shù)排序?yàn)闃拥?>樣地2>樣地3>樣地5>樣地6>樣地4；Chao1多樣性指數(shù)排序?yàn)闃拥?>樣地2>樣地3>樣地5>樣地6>樣地4；Chao1和ACE指數(shù)越大，說明群落豐富度越高。綜合3種多樣性指數(shù)，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)不良林地土壤真菌多樣性和豐富度均高于正常林地。

表4 不同樣地土壤真菌多樣性

Table 4 Soil fungi diversity in 6 sample plots

2.4 土壤化學(xué)性質(zhì)與真菌多樣性的相關(guān)分析

由表5相關(guān)分析表明，土壤pH與Shannon-Wiener指數(shù)間呈顯著負(fù)相關(guān)（<0.05），與ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)間呈極顯著負(fù)相關(guān)（<0.01）。有機(jī)質(zhì)、堿解氮和交換性酸均與3種多樣性指數(shù)顯著正相關(guān)（<0.05）。

表5 山核桃林地土壤化學(xué)性質(zhì)與真菌多樣性的相關(guān)分析

Table 5 Correlation analysis on soil chemical properties with fungi species diversity

注：*表示在0.05水平上顯著相關(guān)，**表示在0.01水平上極顯著相關(guān)。

3 討論

本研究確定了臨安山核桃林地土壤的優(yōu)勢(shì)真菌類群，生長(zhǎng)不良林地與正常林地土壤真菌優(yōu)勢(shì)類群基本一致，但相對(duì)豐度有明顯差異，可能是這些差異導(dǎo)致林分生長(zhǎng)狀況不同。在門的分類水平上，正常林地土壤中擔(dān)子菌門和接合菌門的相對(duì)豐度高于生長(zhǎng)不良林地。在屬的分類水平上，正常林地中小畫線殼屬、鐮刀霉屬和土赤殼屬的相對(duì)豐度明顯低于生長(zhǎng)不良林地。兩類林地的種群和豐度差異可能是影響山核桃健康的主要原因。有研究表明，小畫線殼屬、鐮刀霉屬和土赤殼屬的真菌與植物根腐病有關(guān)[12-13]，生長(zhǎng)不良林地中植株根大量死亡可能和這三個(gè)真菌屬的相對(duì)豐度較高有關(guān)。

本研究中山核桃林地土壤真菌多樣性與pH、有機(jī)質(zhì)、堿解氮和交換性酸有關(guān)，pH與林地土壤真菌多樣性之間呈負(fù)相關(guān)，有機(jī)質(zhì)、堿解氮和交換性酸與林地土壤真菌多樣性呈正相關(guān)。pH和交換性酸反映土壤的酸性。生長(zhǎng)不良林地比正常林地土壤酸性強(qiáng)，酸性土壤中真菌多樣性會(huì)更豐富[14]。生長(zhǎng)不良林地中的山核桃植株有大量枝條和根死亡，林地中有機(jī)質(zhì)含量會(huì)高于正常林地，土壤有機(jī)質(zhì)含量高，也會(huì)使土壤真菌數(shù)量和物種多樣性增加[15]。山核桃林生長(zhǎng)不良通常和氮肥施用過多有關(guān)[16]，生長(zhǎng)不良林地之前一直施用化肥，土壤堿解氮普遍高于正常林地，堿解氮含量升高也會(huì)影響土壤真菌多樣性[17]。土壤化學(xué)性質(zhì)對(duì)真菌群落的數(shù)量和組成影響較大，因此不能只根據(jù)真菌多樣性來判斷林地土壤環(huán)境的優(yōu)劣。

4 結(jié)論

（1）6個(gè)樣地中土壤真菌共有5門19綱74目134科271屬。生長(zhǎng)不良林地與正常林地土壤真菌群落結(jié)構(gòu)有明顯差異，在門的分類水平上，正常林地土壤中擔(dān)子菌門和接合菌門的相對(duì)豐度高于生長(zhǎng)不良林地。在屬的分類水平上，正常林地土壤中小畫線殼屬、鐮刀霉屬和土赤殼屬的相對(duì)豐度明顯低于生長(zhǎng)不良林地。

（2）生長(zhǎng)不良林地土壤真菌多樣性和豐富度高于正常林地。Shannon-Weiner指數(shù)，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)與土壤pH之間呈顯著負(fù)相關(guān)（<0.05），與有機(jī)質(zhì)、堿解氮和交換性酸之間呈顯著正相關(guān)（<0.05）。

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Soil Fungi Community Structure inForest

LI Hao，DONG Jian-hua，YUAN Zi-qian，HU Jun-jing，ZHAO Wei-ming

（Hangzhou Forestry Academy, Hangzhou 310022, China）

Soil samples in 0-20 cm layers were collected in August of 2016 from six plots at normal and unhealthy growthstands in Lin’an, Zhejiang province. Determinations on chemical properties were implemented and fungi community structure was analyzed by 16S rDNA sequencing. The results indicated that dominant phylums and genera were similar in the two different kinds of soil, including Ascomycota, Zygomycota and Basidiomycota, but relative abundance was different. Relative abundance of Basidiomycota and Zygomycota in normal growth plots was higher than that in unhealthy ones. Relative abundance of,andin unhealthy plots was higher than that in normal ones. Correlation analysis demonstrated that Shannon-wiener, ACE and Chao1 index had significant negative correlation with pH and positive one with organic matter, alkaline nitrogen and exchangeable acidity.

; fungi; community structure; 16S rDNA sequencing

S664.9

A

1001-3776（2018）05-0067-06

2018-04-02；

2018-08-11

山核桃退化林地修復(fù)技術(shù)應(yīng)用示范與推廣（2016TS10號(hào)）

李皓，工程師，從事經(jīng)濟(jì)林研究；E-mail：38761202@qq.com。

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.05.011