耿皆飛 王 娜 蔣宏寶 劉錄祥 許喜堂 魏紅升王成社 謝彥周

(1西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

1928年美國(guó)科學(xué)家Stadler[1]首次報(bào)道了X射線對(duì)大麥具有誘變效應(yīng)，開(kāi)啟了植物誘發(fā)突變研究。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2017年12月，世界上已有60多個(gè)國(guó)家利用誘發(fā)突變技術(shù)在170多種植物上育成和推廣了3 200個(gè)突變品種，其中包括286個(gè)小麥品種。目前誘發(fā)突變技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物新材料創(chuàng)制和優(yōu)良新品種培育，在解決世界糧食安全與營(yíng)養(yǎng)供給方面發(fā)揮了重要作用，但對(duì)于突變體的真實(shí)來(lái)源和應(yīng)用價(jià)值也引起了越來(lái)越多的質(zhì)疑[2]。如Caldecott等[3]認(rèn)為很多選擇的突變體可能只是田間異源花粉雜交的后代而不是由于輻射誘變產(chǎn)生的真正突變。Knott[4]認(rèn)為突變尤其在數(shù)量性狀方面的突變?cè)谧魑镉N中的價(jià)值并不高。此外，誘發(fā)突變后代的結(jié)實(shí)率通常會(huì)顯著下降，即使像小麥這樣嚴(yán)格的自花授粉作物，也難以避免受串粉造成的天然異交混雜，且誘變后代通常難以做到嚴(yán)格套袋自交，只要能產(chǎn)生優(yōu)良變異，在一定程度上可以不區(qū)分突變體變異的來(lái)源。但對(duì)于遺傳研究而言，必須區(qū)分突變體的變異來(lái)源，因此，對(duì)誘變后代進(jìn)行遺傳變異評(píng)價(jià)，區(qū)分真實(shí)突變體和假突變體，對(duì)于更好地發(fā)揮突變體在遺傳改良和功能基因組研究中的作用具有重要意義。

研究表明，利用表型鑒定通常難以鑒定誘變后代突變體的真實(shí)性，而利用SSR標(biāo)記分析可以有效排除誘發(fā)突變體中的假突變體。如Fu等[5]利用236～340個(gè)SSR位點(diǎn)對(duì)親本材料及γ射線誘變產(chǎn)生的突變體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)親本與突變體之間不存在多態(tài)性。李瑞清等[6]利用分布于水稻12條染色體上的144個(gè)SSR標(biāo)記分析了突變體G9和親本廣占63S，也未發(fā)現(xiàn)二者之間存在差異，說(shuō)明該突變體是由誘發(fā)突變而來(lái)。但SSR標(biāo)記會(huì)受方法和位點(diǎn)數(shù)量的限制，無(wú)法從全基因組水平上對(duì)突變體進(jìn)行高通量的真實(shí)性鑒定[7]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是普遍存在于生物基因組中的一種新型分子標(biāo)記，具有在基因組中數(shù)量最多、分布密度高、無(wú)需電泳、可高通量自動(dòng)化檢測(cè)等特點(diǎn)[8-9]，是繼SSR標(biāo)記之后最有前途的第三代分子標(biāo)記。陳竹鋒等[10]利用Illumina Infinium iSelect SNP(50 K)芯片檢測(cè)技術(shù)比較水稻品種黃華占及其突變體osms55之間的SNP位點(diǎn)差異，發(fā)現(xiàn)突變體與親本黃華占不同的純合位點(diǎn)僅有6個(gè)，由此判斷該突變體的遺傳背景與黃華占一致，突變體材料來(lái)源于黃華占。

小麥(Triticum aestivumL.)是最重要的糧食作物之一，隨著小麥基因組測(cè)序的迅猛發(fā)展[11-13]，誘發(fā)突變技術(shù)制備的突變體在小麥遺傳改良和功能基因組學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用[14-19]。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)構(gòu)建了多個(gè)小麥甲基磺酸乙烷(ethane methyl sulfonate，EMS)突變體庫(kù)。并對(duì)突變體的分子變異進(jìn)行了評(píng)估，但關(guān)于利用分子標(biāo)記對(duì)小麥突變體進(jìn)行真實(shí)性鑒定的報(bào)道并不多見(jiàn)。呂興娜等[7]利用21對(duì)核心SSR標(biāo)記對(duì)小麥品種蘭天15和鄭麥9023的航天誘變后代的抗條銹突變體進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)蘭天15的航天誘變衍生系可能存在異花授粉導(dǎo)致的遺傳重組，鄭麥9023的航天誘變衍生系可能來(lái)自航天誘變。目前，小麥中已經(jīng)開(kāi)發(fā)9 K[20]、90 K[21]、660 K[22]等 SNP 芯片，但利用SNP芯片對(duì)小麥EMS突變體進(jìn)行真實(shí)性鑒定尚未見(jiàn)報(bào)道。西北農(nóng)林大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期利用EMS處理小麥品系H261種子并構(gòu)建了突變體庫(kù)。本研究利用SSR標(biāo)記和90 K SNP芯片對(duì)其中3個(gè)突變體的真實(shí)性進(jìn)行鑒定，以期為更好地發(fā)揮小麥突變體在遺傳改良和功能基因組研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

LF2010、LF2099和 LF2100是小麥品系 H261經(jīng)過(guò)EMS誘變獲得的，經(jīng)過(guò)連續(xù)多代自交后已遺傳穩(wěn)定。其中，LF2010為類病斑突變體，與H261相比，其主要農(nóng)藝性狀嚴(yán)重下降[23]；LF2099為葉片早衰突變體，其主要農(nóng)藝性狀也嚴(yán)重下降；LF2100為無(wú)芒突變體，其主要農(nóng)藝性狀與親本相差不大(圖1)。所有材料均種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)小麥試驗(yàn)田。

1.2 試驗(yàn)方法

圖1 H261及其EMS突變體的表型Fig.1 The phenotype of H261 and EMS mutants

1.2.1 DNA的提取 待植株長(zhǎng)至二葉一心時(shí)，取小麥葉片，按照CTAB法[24]提取基因組DNA，用0.8%瓊脂糖電泳和NanoDrop One分光光度計(jì)(Thermo，USA)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度。

1.2.2 SSR標(biāo)記分析 用小麥染色體上特異性和穩(wěn)定性較好的21對(duì)核心SSR引物[25]對(duì)突變體及其親本進(jìn)行檢測(cè)。SSR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為 10 μL，含 10×PCR buffer 1 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.15 μL，1.25 μmol·L-1引物 2 μL，2 U·μL-1Taq DNA 聚合酶 0.25 μL，10 ng·μL-1模板 DNA 3 μL，超純水 3.6 μL。 其中 10×PCR buffer、dNTP和TaqDNA聚合酶均購(gòu)自上海賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，36個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離，以2 000 V電壓電泳1.0～1.5 h。凝膠染色采用簡(jiǎn)化硝酸銀染色法[26]。

1.2.3 SNP芯片分析 委托北京康普森生物技術(shù)有限公司，利用美國(guó)Illumina公司和美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)共同開(kāi)發(fā)的小麥90 K基因芯片對(duì)突變體及其親本材料進(jìn)行檢測(cè)，其多態(tài)性分析采用Genomestudio v1.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的SSR檢測(cè)

SSR分析結(jié)果表明，H261與CS的差異標(biāo)記為14個(gè)，多態(tài)性比例高達(dá)66.67%。H261與 LF2010和LF2099的差異SSR標(biāo)記均為0個(gè)，但與LF2100的差異SSR標(biāo)記為10個(gè)，多態(tài)性比例為47.62%(表1)。參照小麥純度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[27]，差異標(biāo)記≥3表示與親本遺傳相似性低，存在異花授粉或機(jī)械混雜的可能性。LF2100與親本H261差異標(biāo)記為10個(gè)，由此推測(cè)LF2100是天然異交或機(jī)械混雜產(chǎn)生的假突變體，LF2010和LF2099與親本H261的差異標(biāo)記均為0(圖2)，說(shuō)明LF2010和LF2099 2個(gè)突變體與親本H261的遺傳背景高度一致，是H261經(jīng)過(guò)EMS誘變的后代。

表1 小麥親本材料與突變體之間的21個(gè)SSR標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)Table1 Polymorphism of 21 SSR markers between parent lines of wheat and mutant

2.2 突變體的SNP檢測(cè)

為了進(jìn)一步探究突變體的遺傳背景與親本的關(guān)系，利用90 K基因芯片的81 597個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)H261及其衍生的突變體進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果表明，H261與CS的差異位點(diǎn)僅3 481個(gè)，占總數(shù)的4.266 1%，純合差異 SNP為1 469，占總數(shù)的 1.800 3%；H261與LF2010和LF2099之間的差異位點(diǎn)分別為66和12個(gè)，這些差異SNP隨機(jī)分布于除2D、4D和6D以外的染色體上，分別占總數(shù)的0.080 9%和0.014 7%，2個(gè)突變體與H261的純合差異SNP均為0；而H261與LF2100之間的差異位點(diǎn)為 2 846個(gè)，占總數(shù)的3.487 9%，二者之間純合差異SNP為784，占總數(shù)的0.960 8%(表2)。上述結(jié)果從分子水平上進(jìn)一步證明了突變體 LF2010和 LF2099的真實(shí)性，且說(shuō)明LF2100與親本H261的遺傳背景不一致，不是H261經(jīng)過(guò)EMS誘變的后代。

圖2 部分核心SSR引物在親本材料及其突變體的電泳圖Fig.2 Electrophoretic map of some core SSR primers in parent materials and their mutants

表2 小麥親本材料與突變體之間的SNP標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)Table2 Polymorphism of SNP marker between wheat mutant and parent lines

3 討論

王立新等[25]研究表明，不同的小麥品種之間核心SSR標(biāo)記具有較高的多態(tài)性。本研究結(jié)果表明，在H261和中國(guó)春(CS)之間的多態(tài)性比例高達(dá)66.67%。呂興娜等[7]利用21對(duì)核心SSR引物對(duì)小麥品種蘭天15和鄭麥9023的航天誘變后代中篩選出抗條銹病突變體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明蘭天15的航天誘變衍生系與親本間差異標(biāo)記數(shù)量較多，推測(cè)可能存在異花授粉導(dǎo)致的遺傳重組，而鄭麥9023的航天誘變衍生系與親本差異標(biāo)記數(shù)量均不超過(guò)2個(gè)，推測(cè)成株期抗病性變異可能來(lái)自航天誘變。本研究利用相同的21對(duì)核心SSR引物對(duì)H261及其EMS突變體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)突變體與親本之間，不存在SSR標(biāo)記多態(tài)性，與前人研究并不一致，其原因可能是本研究中的誘發(fā)突變體和親本之間并未檢測(cè)出任何SSR位點(diǎn)的差異，也有可能是所用標(biāo)記數(shù)量較少導(dǎo)致的。但Fu等[5]關(guān)于水稻的研究發(fā)現(xiàn)，利用236～340個(gè)SSR位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，親本材料及γ射線誘變產(chǎn)生的突變體之間未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。因此，本研究利用這21個(gè)核心SSR標(biāo)記可以有效地排除小麥誘變突變體中由于各種原因造成的假突變體。

小麥EMS誘變產(chǎn)生的突變類型主要是點(diǎn)突變和部分缺失突變，Krasilev等[16]研究發(fā)現(xiàn)，六倍體小麥每個(gè)EMS突變系平均含有5 351個(gè)EMS類型突變；而六倍體小麥基因組的大小為17 Gb，即17×109bp，突變頻率為315×10-9。本研究?jī)H采用21對(duì)SSR引物，引物總長(zhǎng)度為879 bp，在任何一個(gè)突變體中檢測(cè)到某一個(gè)突變的概率約為2.77×10-4。此外，根據(jù)SSR標(biāo)記的原理，即使突變位點(diǎn)發(fā)生在SSR引物結(jié)合位點(diǎn)，該突變位點(diǎn)也不一定能被SSR標(biāo)記檢測(cè)出來(lái)。從理論上解釋了本研究未能找到突變體與親本的多態(tài)性的原因。然而，在其他小麥EMS誘變后代的SSR標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果中，親本與突變體之間卻可以輕易檢測(cè)出多態(tài)性[28-30]，這暗示這些突變體可能是由于各種原因產(chǎn)生的假突變體，當(dāng)然，也存在突變位點(diǎn)導(dǎo)致SSR位點(diǎn)變化的可能，但這種可能性較低。

由于利用SSR標(biāo)記難以鑒定突變體和親本材料之間的差異，本研究嘗試?yán)眯←?0 K高通量SNP分析芯片對(duì)H261及其衍生的EMS突變體進(jìn)行分析。結(jié)果表明，突變體LF2010和LF2099與親本H261之間的差異位點(diǎn)極少，多態(tài)性比例分別為0.080 9%和0.014 7%，且純合的差異位點(diǎn)均為0，進(jìn)一步證明了LF2010和LF2099是由H261誘變而來(lái)。SNP芯片克服了SSR無(wú)法從全基因組水平上進(jìn)行高通量分析的缺點(diǎn)，在未來(lái)的研究中可以逐步代替SSR標(biāo)記，用于檢測(cè)小麥突變體的真實(shí)性，尤其是在利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)突變體進(jìn)行深入研究之前，突變體真實(shí)性鑒定顯得尤為重要[7-8]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，LF2010和LF2099突變體與親本H261的遺傳背景高度一致，是H261經(jīng)過(guò)EMS誘變的后代，而LF2100是天然異交或機(jī)械混雜產(chǎn)生的假突變體。SSR標(biāo)記和SNP芯片2種方法均可以有效鑒定EMS突變體的真實(shí)性，SNP芯片由于可以進(jìn)行高通量和全基因組水平的分析，在小麥突變體的真實(shí)性鑒定方面顯示出更大的應(yīng)用潛力。本研究結(jié)果為更好地發(fā)揮小麥突變體在遺傳改良和功能基因組研究中的作用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。