谷會(huì) 賈志偉 侯曉婉 張魯斌

摘? 要? 為了降低采后菠蘿果實(shí)由黑腐病引起的腐爛損失，本文研究了氯化鈣處理對(duì)黑腐病的防控效果及相關(guān)機(jī)制。結(jié)果表明，1%氯化鈣處理對(duì)菠蘿黑腐病有最好的抑制作用和防治效果。1%氯化鈣處理對(duì)病菌菌絲生長影響不大，但可明顯抑制病原菌的產(chǎn)孢;氯化鈣處理明顯降低發(fā)病果實(shí)中多聚半乳糖醛酸甲酯酶（PMG）、纖維素酶（CX）和β-葡萄糖苷酶（CB）的活性，但對(duì)多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性變化沒有明顯影響;氯化鈣處理明顯提高貯藏中后期菠蘿果實(shí)中過氧化氫（H2O2）的含量，明顯提高抗病相關(guān)酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、幾丁質(zhì)酶（CHI）和β-1，3-葡聚糖酶（GLU）的活性。說明氯化鈣處理對(duì)黑腐病有較好的防控效果，一方面是由于其降低了病原菌的致病性，另一方面是誘導(dǎo)菠蘿果實(shí)提高了抗病性。因此，適宜濃度的氯化鈣處理為菠蘿采后黑腐病的綠色防控提供了一條新的途徑。

關(guān)鍵詞? 菠蘿;黑腐病;氯化鈣;防控效果

中圖分類號(hào)? S436? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

Effects and Mechanism of Calcium Chloride Treatment on Reducing Pineapple Black Rot

GU Hui， JIA Zhiwei， HOU Xiaowan， ZHANG Lubin*

South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Key Laboratory for Postharvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract? In order to reduce the loss of pineapple fruit caused by black rot after harvest， the effects of calcium chloride treatment on black rot and related mechanism were studied in this paper. The results showed that 1% calcium chloride treatment had the best inhibitory and control effect. Calcium chloride treatment （1%） had little effect on the growth of mycelial， but could significantly inhibit the sporulation of pathogens. Calcium chloride treatment significantly reduced the enzymatic activities of PMG， CX and CB in the treated fruits， but had no significant effect on the changes of PG activity. Calcium chloride treatment significantly increased the content of H2O2 during the middle and late storage， and significantly increased the activities of resistance-related enzymes such as PAL， PPO， CHI and GLU. These results showed that calcium chloride treatment displayed effects on inhibiting black rot probably due to it reduced the pathogenicity of pathogens and induced disease resistance of treated pineapple fruits. Therefore， the appropriate concentration of calcium chloride treatment would provide a new way for the green control of pineapple black rot after harvest.

Keywords? pineapple; black rot; calcium chloride; control effect

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.023

菠蘿黑腐病是一種真菌性病害，病原菌是奇異根串珠霉（Thielaviopsis paradoxa），黑腐病是采后菠蘿果實(shí)主要的侵染性病害，在國內(nèi)外菠蘿種植地區(qū)均有發(fā)生，國內(nèi)有的產(chǎn)區(qū)發(fā)病率高達(dá)40%，嚴(yán)重影響了菠蘿的市場(chǎng)供應(yīng)及加工生產(chǎn)[1]。前人研究表明[2]，病原真菌通過向果實(shí)內(nèi)分泌細(xì)胞壁降解酶、毒素、病原物激素來降解寄主的細(xì)胞壁和角質(zhì)層，從而使病原真菌的侵入與擴(kuò)展，而細(xì)胞壁降解酶是主要的致病因子。同樣，細(xì)胞壁降解酶在菠蘿黑腐病菌的致病過程中也起著很重要的作用，主要包括多聚半乳糖醛酸酶（PG）、多聚半乳糖醛酸甲酯酶（PMG）、果膠甲酯酶（PME）、纖維素酶（CX）和β-葡萄糖苷酶（CB）等。PG、PMG和PME在侵染前期降解細(xì)胞壁中果膠質(zhì)使果實(shí)軟化，CX和CB在侵染中后期降解細(xì)胞壁中的纖維素使果實(shí)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞，利于黑腐病菌的侵入與擴(kuò)展。

化學(xué)殺菌劑是防治菠蘿采后黑腐病有效措施，目前在生產(chǎn)上常用于防治菠蘿果實(shí)黑腐病的殺菌劑有多菌靈、甲基托布津和苯菌靈等[3]。Wije singhe等[4]研究發(fā)現(xiàn)，用3 g/kg的苯菌靈浸果3 min、或用0.2 g/L的抑霉唑浸果1 min，對(duì)菠蘿黑腐病防效明顯，但長期使用化學(xué)殺菌劑一方面可導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，另一方面也存在食品安全隱患。Wilson等[5]用54 ℃熱水處理菠蘿3 min后，菠蘿在10 ℃貯藏21 d后沒有發(fā)現(xiàn)黑腐病，但由于熱水處理程序繁瑣，容易引起交叉感染，在生產(chǎn)上難以推廣。也有研究者用拮抗木霉（Trichode rma asperellum）[6]來防治菠蘿黑腐病，但由于拮抗菌對(duì)營養(yǎng)和環(huán)境條件的特殊要求以及在菠蘿果實(shí)上難以定植的問題，拮抗菌在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用還有較大困難。

能誘導(dǎo)采后果蔬產(chǎn)生抗病性的因素包括生物激發(fā)子和非生物激發(fā)子，鈣離子作為一種非生物激發(fā)子，對(duì)采后果實(shí)也有一定的誘導(dǎo)抗病效果，比較常見的保鮮劑是氯化鈣。氯化鈣處理成本低，使用安全方便，通過植物體內(nèi)的生理生化反應(yīng)來發(fā)揮作用，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，適合綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展要求和標(biāo)準(zhǔn)[7]。關(guān)于鈣處理在采后果蔬上的抗病性研究已有很多報(bào)道，Conway最早在1983年就研究發(fā)現(xiàn)，采后鈣處理能提高蘋果果實(shí)的誘導(dǎo)抗病性，鈣真空滲透處理對(duì)蘋果灰霉病有較好的防治效果[8]。之后分別在桃[9]、梨[10]、芒果[11]以及蘋果[12-13]上均有報(bào)道。還有研究表明，鈣處理對(duì)蘋果炭疽菌的生長有直接的抑制作用[14-15]。但氯化鈣處理是否可以提高采后菠蘿果實(shí)的抗病性，是否對(duì)菠蘿黑腐病菌生長有抑制作用還未見報(bào)道。所以本研究以此為切入點(diǎn)，研究氯化鈣處理對(duì)菠蘿黑腐病的防治效果，并測(cè)定氯化鈣對(duì)黑腐病菌的抑制作用以及對(duì)其致病性的影響，同時(shí)還研究氯化鈣處理對(duì)菠蘿果實(shí)抗病性的影響，以期為菠蘿黑腐病的綠色防控提供理論依據(jù)和應(yīng)用參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試菠蘿品種? 菠蘿品種為‘巴厘菠蘿（Ananas comosus ‘Comtede Paris），采摘于廣東省湛江市徐聞縣菠蘿實(shí)驗(yàn)基地，采摘時(shí)挑選果眼平整、果皮全綠的七成熟果實(shí)，立即運(yùn)回南亞熱帶作物研究所實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2? 化學(xué)試劑? 無水氯化鈣（分析純），天津市福晨化學(xué)試劑廠;蝸牛酶（分析純），Sigma公司;昆布多糖（分析純），Sigma公司;幾丁質(zhì)（分析純），上海伊卡生物技術(shù)有限公司;N-乙酰氨基葡萄糖，Sigma公司;多聚半乳糖醛酸（分析純），Biosharp公司;果膠質(zhì)（分析純），Biosharp公司;羧甲基纖維素鈉（分析純），天津市福晨化學(xué)試劑廠;D-半乳糖醛酸（分析純），Biosharp公司;3，5-二硝基水楊酸（化學(xué)純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3? 供試菌株? 病原菌株為菠蘿黑腐病菌（Thielaviopsis paradoxa），為南亞熱帶作物研究所采后病理實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.4? 儀器與設(shè)備? UV-2700紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司;Envolution RC型超速離心機(jī)，美國Thermo Fisher公司;MIR-553型低溫恒溫培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司。

1.2? 方法

1.2.1? 氯化鈣處理對(duì)菠蘿黑腐病病斑直徑抑制率的測(cè)定? 氯化鈣是一種無毒的綠色保鮮劑，對(duì)采后蘋果、梨等果蔬有較好的防腐保鮮作用，本實(shí)驗(yàn)以氯化鈣為保鮮防腐劑，開展菠蘿黑腐病防治技術(shù)研究。首先將氯化鈣配制成質(zhì)量濃度分別為0.5%、1%、2%的水溶液，將菠蘿果實(shí)分別在不同濃度的氯化鈣保鮮液中浸泡2 min，取出自然晾干，實(shí)驗(yàn)以清水浸泡為對(duì)照，用PE袋敞口包裝，置于常溫25 ℃下貯藏12 h后，在菠蘿果面中間接種濃度為1×106個(gè)/mL的黑腐病菌孢子懸浮液15 μL，置于低溫15 ℃下貯藏。每個(gè)處理10個(gè)果實(shí)，每隔3 d調(diào)查一次病斑直徑大小，并計(jì)算抑制率，重復(fù)3次。

1.2.2? 氯化鈣處理對(duì)菠蘿黑腐病的防治效果? 將菠蘿果實(shí)在1%的氯化鈣水溶液中浸泡5 min，以清水浸泡為對(duì)照，取出后自然晾干，用PE袋敞口包裝，置于低溫15 ℃下貯藏。每處理60個(gè)果實(shí)，每隔3 d取15個(gè)果實(shí)調(diào)查病情指數(shù)，并計(jì)算防治效果，重復(fù)3次。黑腐病的發(fā)病情況按果實(shí)縱剖面上病害面積大小分為0～5級(jí)，0級(jí)：無病害;1級(jí)：病害面積占剖面面積的10%以下;2級(jí)：病害面積占比11%～25%;3級(jí)：病害面積占比26%～50%;4級(jí)：病害面積占比51%～75%;5級(jí)：病害面積占比超過75%。

病情指數(shù)=Σ[（病害果數(shù)×病害級(jí)值）/總果數(shù)×最高病害級(jí)值]×100

防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)–處理病情指數(shù)） /對(duì)照病情指數(shù)×100%

1.2.3? 氯化鈣對(duì)菠蘿黑腐病菌菌絲生長和產(chǎn)孢影響? 將氯化鈣加入到定量滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中制備成0.5%、1%、2%的氯化鈣含藥PDA平板，從培養(yǎng)48 h的菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌苔，分別接種到上述含藥PDA平板中央，以不含藥PDA平板作為對(duì)照，置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h后測(cè)量菌落的直徑，并用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定每個(gè)培養(yǎng)皿的產(chǎn)孢個(gè)數(shù)，3次重復(fù)。

1.2.4? 菠蘿果實(shí)中細(xì)胞壁降解酶活性的測(cè)定? 挑選無病蟲害、無機(jī)械損傷、大小基本一致的菠蘿果實(shí)，在1%的氯化鈣保鮮液中浸泡5 min，取出自然晾干，清水浸泡作為對(duì)照，在25 ℃下貯藏12 h后，針刺接種菠蘿黑腐病菌，15 ℃下貯藏，每處理25個(gè)果，重復(fù)3次，分別在第0、3、6、9、12 d取5個(gè)果實(shí)進(jìn)行取樣。在果實(shí)病健交界處切取0.5 g果皮組織，用0.05 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮、10 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl）進(jìn)行提取，在4 ℃、10000 r/min下離心25 min，取上清液作為待測(cè)酶液。菠蘿果實(shí)內(nèi)細(xì)胞壁降解酶PG、PMG、CX、CB酶活性的測(cè)定均采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[16]，其中PG和PMG酶活性測(cè)定用D-半乳糖醛酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每小時(shí)催化底物釋放出1 mg D-半乳糖醛酸的量為1個(gè)酶活單位U，酶活性以U/g 計(jì)算;CX和CB酶活性的測(cè)定用葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每小時(shí)催化底物釋放出1 mg葡萄糖的量為1個(gè)酶活單位U，酶活性以U/g計(jì)算，所有酶活性測(cè)定均3次重復(fù)。

1.2.5? 菠蘿果實(shí)過氧化氫含量的測(cè)定? 菠蘿果實(shí)的前處理和取樣方法同1.2.4。取1 g菠蘿果皮，用0.05 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液提取，粗酶液取樣量為0.5 mL，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的過氧化氫試劑盒測(cè)定，過氧化氫含量以μmol/g計(jì)算，3次重復(fù)。

1.2.6? 菠蘿果實(shí)抗病相關(guān)酶活性的測(cè)定? 菠蘿果實(shí)的前處理和取樣方法同1.2.4。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測(cè)定參考吳芳芳等[17]的方法，取病健交界處的菠蘿組織1 g，提取介質(zhì)為0.05 mol/L pH 8.8硼酸緩沖液（內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮、5 mmol/L巰基乙醇、1 mmol/L EDTA），于290 nm波長下測(cè)OD值，每分鐘改變0.01為一個(gè)酶活單位U，以U/g計(jì)算。多酚氧化酶（PPO）活性測(cè)定參考Zhang等[18]的方法，在病健交界處取1 g菠蘿果皮，提取介質(zhì)為0.05 mol/L pH 6.8 磷酸緩沖液，于398 nm波長下測(cè)OD值，每分鐘改變0.01為一個(gè)酶活單位U，以U/g計(jì)算。幾丁質(zhì)酶（CHI）和β-1，3-葡聚糖酶（GLU）粗酶液的制備參考楊冬平等[19]的方法，在病健交界處取0.5 g菠蘿果皮，用0.1 mol/L pH 5.0的乙酸鈉緩沖液（內(nèi)含5 mmol/L巰基乙醇、1 mmol/L EDTA）提取，用提取液在4 ℃下透析過夜，離心取上清液即為粗酶液。CHI酶活性的測(cè)定參照馬桂珍等[20]的方法，用N-乙酰氨基葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每分鐘產(chǎn)生1 μg N-乙酰氨基葡萄糖的量為1個(gè)酶活單位U，以U/g計(jì)算，重復(fù)3次。GLU酶活性的測(cè)定參照李世貴等[21]的方法，用葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，1個(gè)酶活單位U定義為每分鐘從昆布多糖中釋放1 μg葡萄糖所需的酶量，以U/g計(jì)算，重復(fù)3次。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)誤并制圖;數(shù)據(jù)的方差分析（ANOVA）采用SPSS 22.0軟件，利用Duncans多重比較對(duì)數(shù)據(jù)的顯著性差異進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 氯化鈣處理對(duì)菠蘿黑腐病病斑直徑的抑制率

研究結(jié)果表明，菠蘿果實(shí)在15 ℃下貯藏3 d后，氯化鈣處理和對(duì)照的病斑直徑無顯著性差異，但貯藏6、9、12 d后，0.5%、1%、2%氯化鈣處理的病斑直徑明顯小于對(duì)照，表現(xiàn)出較好的抑制作用（圖1）。其中1%的氯化鈣表現(xiàn)出最好的抑制作用，貯藏6、9、12 d后的病斑直徑分別為39.9、69.4、95.0 mm，抑制率分別為17.9%、14.8%、12.3%。

2.2? 氯化鈣處理對(duì)菠蘿黑腐病的防治效果

圖2結(jié)果表明，菠蘿果實(shí)在15 ℃下貯藏3 d后開始發(fā)病，1%氯化鈣處理和對(duì)照的病情指數(shù)無顯著性差異，但貯藏6、9、12 d后，對(duì)照的病情指數(shù)分別為29.3、53.3、86.7，而氯化鈣處理的病情指數(shù)為24.0、44.0、72.0，明顯小于對(duì)照。貯藏6、9、12 d后，1%氯化鈣處理的防治效果分別為18.1%、17.4%、16.9%。

2.3? 氯化鈣對(duì)菠蘿黑腐病菌菌絲生長和產(chǎn)孢影響

從表1可以看出，病菌在含不同濃度氯化鈣的培養(yǎng)基上生長72 h后的菌落直徑和對(duì)照無顯著性差異，表明氯化鈣對(duì)離體菌絲生長沒有明顯的抑制作用;而在含有1%、2%氯化鈣的培養(yǎng)基上生長72 h后的產(chǎn)孢量分別為0.8×106個(gè)/皿、0.7×106個(gè)/皿，明顯小于對(duì)照的產(chǎn)孢量，而且濃度越大產(chǎn)孢越少，說明氯化鈣對(duì)黑腐病菌的產(chǎn)孢有一定的抑制作用。

2.4? 氯化鈣處理對(duì)菠蘿果實(shí)中細(xì)胞壁降解酶活性的影響

從圖3A可以看出，氯化鈣處理對(duì)菠蘿果實(shí)PG酶活性的影響沒有明顯的規(guī)律，對(duì)照菠蘿果實(shí)的PG酶活性在2.0 U/g左右呈上下波動(dòng)趨勢(shì)，在貯藏9 d后達(dá)到最高2.4 U/g，而氯化鈣處理后的PG酶活性也是在2.0 U/g左右呈上下波動(dòng)趨勢(shì)，在貯藏6 d后反而會(huì)提高PG酶的活性，12 d后和對(duì)照沒有顯著性差異。

從圖3B、圖3C和圖3D可以看出，對(duì)照菠蘿果實(shí)中PMG、CX和CB酶活性在貯藏9 d前呈上升趨勢(shì)，在貯藏9 d后達(dá)到最大值2.1、1.5、1.5 U/g，之后緩慢下降，貯藏12 d后的酶活性分別為2.0、1.6、1.3 U/g，明顯高于氯化鈣處理。而氯化鈣處理的菠蘿果實(shí)中PMG、CX和CB酶活性在貯藏6 d前上升不明顯，貯藏6 d后呈快速上升趨勢(shì)，12 d后分別達(dá)到最高1.9、1.4、1.2 U/g。氯化鈣處理明顯降低了發(fā)病菠蘿果實(shí)中PMG、CX和CB的酶活性，其中PMG和CX酶活性的降低程度在貯藏6 d時(shí)達(dá)最大，分別為0.38、0.35 U/g，CB酶活性的降低程度在貯藏9 d時(shí)達(dá)最大0.38 U/g。

2.5? 氯化鈣處理對(duì)菠蘿果實(shí)過氧化氫含量的影響

從圖4可以看出，氯化鈣處理和對(duì)照的菠蘿果實(shí)中過氧化氫含量均呈上升趨勢(shì)，氯化鈣處理的菠蘿在貯藏6 d后過氧化氫含量迅速上升，12 d

時(shí)達(dá)到最高值317.9 μmol/g，對(duì)照菠蘿在貯藏9 d后過氧化氫含量迅速上升，12 d時(shí)達(dá)到最高值245.8 μmol/g。在貯藏3 d前氯化鈣處理和對(duì)照菠蘿果實(shí)中過氧化氫含量基本無顯著性差異，在貯藏6、9、12 d后氯化鈣處理明顯高于對(duì)照。

2.6? 氯化鈣處理對(duì)菠蘿果實(shí)抗病相關(guān)酶活性的影響

從圖5A可知，對(duì)照菠蘿果實(shí)中的PAL酶活性呈先上升后下降趨勢(shì)，貯藏9 d時(shí)達(dá)到最大值25.4 U/g，而氯化鈣處理在貯藏中一直呈上升趨勢(shì)，到21 d時(shí)達(dá)到最大值31.8 U/g。氯化鈣處理和對(duì)照的PAL酶活性在貯藏3 d前無顯著性差異，貯藏6 d后到12 d，PAL酶活性明顯高于對(duì)照，在貯藏12 d時(shí)比對(duì)照高7.3 U/g。從圖5B可以看出，氯化鈣處理和對(duì)照的菠蘿果實(shí)中PPO酶活性均呈上升趨勢(shì)，在貯藏12 d后分別達(dá)到最高值263.3、205.5 U/g。在整個(gè)貯藏過程中，氯化鈣處理的菠蘿果實(shí)中PPO酶活性均明顯高于對(duì)照的酶活性。從圖5C可知，氯化鈣處理和對(duì)照的

菠蘿果實(shí)中CHI酶活性在整個(gè)貯藏期間均呈上升趨勢(shì)，貯藏9 d后上升較快，到12 d時(shí)達(dá)到最大，分別為18.1、14.0 U/g，貯藏9 d后氯化鈣處理的CHI酶活明顯高于對(duì)照。從圖5D可以看出，氯化鈣處理和對(duì)照的菠蘿果實(shí)中GLU酶活性在整個(gè)貯藏期間均呈上升趨勢(shì)，貯藏6 d時(shí)氯化鈣處理和對(duì)照無顯著性差異，貯藏6 d以后，氯化鈣處理的GLU酶活迅速上升，貯藏9、12 d時(shí)的酶活性分別為153.2、167.8 U/g，而對(duì)照分別為140.0、144.7 U/g，氯化鈣處理明顯高于對(duì)照。

3? 討論

不同濃度的氯化鈣處理對(duì)菠蘿黑腐病均有一定的抑制作用，其中1%氯化鈣表現(xiàn)出較好的抑制作用和防治效果，貯藏6、9、12 d后的抑制率分別為17.9%、14.8%、12.3%，防治效果分別為18.1%、17.4%、16.9%。其中貯藏6 d時(shí)的抑制作用和防治效果最好，之后呈下降趨勢(shì)，這與病原菌的致病性以及菠蘿果實(shí)的抗病性都有關(guān)系。貯藏6 d時(shí)防治效果最好，主要是由于氯化鈣處理明顯降低了菠蘿果實(shí)中細(xì)胞壁降解酶的活性，而此階段菠蘿果實(shí)的誘導(dǎo)抗病效果不明顯。而貯藏6 d以后防治效果呈下降趨勢(shì)，主要是由于氯化鈣對(duì)黑腐病菌的抑菌效果減弱，細(xì)胞壁降解酶的含量迅速提高，此階段的防治效果主要來自氯化鈣處理對(duì)菠蘿果實(shí)的誘導(dǎo)抗病性。

氯化鈣處理降低菠蘿果實(shí)中細(xì)胞壁降解酶的活性，主要有兩方面原因：一是由于氯化鈣對(duì)黑腐病菌生長產(chǎn)孢的直接抑制作用，從而降低了病原菌分泌的細(xì)胞壁降解酶。關(guān)于這方面的研究已有相關(guān)報(bào)道，Chardonnet等[22]研究表明，鈣處理可以降低真菌病害的侵染率是由于其對(duì)病原菌的直接抑制作用，包括抑制真菌的菌絲生長，孢子萌發(fā)和芽管伸長等。吳芳芳等[14]研究認(rèn)為，鈣鹽處理可以明顯降低蘋果膠孢炭疽菌菌絲體干重和孢子萌發(fā)率。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯化鈣對(duì)黑腐病菌的菌絲生長快慢雖沒有明顯的抑制作用，但對(duì)黑腐病菌的產(chǎn)孢有較強(qiáng)的抑制作用，由于病原菌的生長一部分是來源于菌絲體營養(yǎng)生長，另一部分是來源于生殖生長，說明氯化鈣可以降低病原菌的生長總量，從而減弱了黑腐病菌的致病性。另一方面，鈣離子不但具有維持果實(shí)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的作用，從而增強(qiáng)細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞壁降解酶的抵抗性;而且，氯化鈣處理還可以降低果實(shí)自身產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性。關(guān)于這方面的報(bào)道也有很多，Ortiz等[23]研究表明，鈣處理可以減少蘋果采后硬度的下降與果實(shí)中PG、PME 和果膠酸裂解酶（PL）活性的下降密切相關(guān)。張強(qiáng)等[24]研究發(fā)現(xiàn)氯化鈣處理可以明顯降低伽師瓜果膠酶PG、PME和PL的活性及其基因表達(dá)，延緩果實(shí)的軟化。Ranjbar等[25]研究表明納米鈣處理可以明顯降低蘋果PG和PME酶的活性。另外，在柑橘[26]、番茄[27]、草莓[28]等其他水果上也有報(bào)道。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯化鈣處理對(duì)于菠蘿PG酶的活性沒有明顯的抑制作用，但可以明顯降低貯藏中后期菠蘿果實(shí)中的PMG、CX和CB酶活性，這是由于氯化鈣降低了病原菌分泌的PMG、CX和CB酶活性，也可能是降低了果實(shí)自身產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶PMG、CX和CB的活性。

可以提高果實(shí)抗病性相關(guān)的酶主要有PAL、PPO、POD、病程相關(guān)蛋白等[29]，PAL是果實(shí)抗病物質(zhì)生成途徑苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，有助于酚類物質(zhì)的聚集，木質(zhì)素的積累，植保素的合成等，PPO可氧化酚類化合物形成對(duì)病原菌更強(qiáng)毒性的醌類衍生物，POD參與抗病相關(guān)物質(zhì)木質(zhì)素與酚類的合成，病程相關(guān)蛋白（PR蛋白）的積累是果實(shí)獲得系統(tǒng)抗性的重要原因，其中CHI和GLU是兩種重要的PR蛋白，由于這兩種酶可以降解病原菌細(xì)胞壁，所以其酶活水平可以直接證明果實(shí)抗病能力。關(guān)于鈣處理可提高采后果蔬抗病相關(guān)酶的報(bào)道已有很多，Zhao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，5%的氯化鈣處理可提高蘋果對(duì)炭疽病的抗性，與提高抗病相關(guān)酶PAL和POD的活性有關(guān)。Yu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，氯化鈣處理能夠誘導(dǎo)梨果實(shí)抗病相關(guān)酶POD活性上升，從而提高梨對(duì)青霉病和灰霉病的抗病性。陳敏等[11]研究發(fā)現(xiàn)，40 g/L氯化鈣與病原菌孢子處理間隔24 h，可顯著提高其對(duì)芒果炭疽病的抑制效果，說明氯化鈣能夠誘導(dǎo)芒果果實(shí)抗病相關(guān)酶PAL、POD和PPO活性的上升，從而使其產(chǎn)生抗病性。同樣，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，氯化鈣處理可以提高菠蘿果實(shí)貯藏中后期的抗病相關(guān)酶PAL、PPO、CHI、GLU的活性，此階段氯化鈣對(duì)黑腐病的防治效果主要來自其對(duì)菠蘿果實(shí)的誘導(dǎo)抗病性。

H2O2是典型的活性氧自由基，病原菌侵染和激發(fā)子均可誘導(dǎo)植物體內(nèi)H2O2的產(chǎn)生，其直接作用就是抑制病原菌孢子萌發(fā)甚至殺死病原物，活性氧爆發(fā)是植物做出的快速防御反應(yīng)之一[30];另一方面，H2O2還是植物防御反應(yīng)中一個(gè)重要的信號(hào)物質(zhì)，可作為植物的第二信使，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中調(diào)控下游信號(hào)，進(jìn)而激活和調(diào)控植物體內(nèi)各種脅迫相關(guān)基因，并將信號(hào)最終放大為蛋白的翻譯表達(dá)，在植物體中即為產(chǎn)生各種抗病相關(guān)物質(zhì)[31]。前人研究表明，不同的非生物激發(fā)子比如β-氨基丁酸[32-33]，苯并噻二唑[34]均可誘導(dǎo)果實(shí)內(nèi)H2O2大量生成，進(jìn)而調(diào)控病程相關(guān)蛋白CHI和GLU的翻譯表達(dá)，提高果實(shí)的抗病性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鈣離子作為一種非生物激發(fā)子，也可誘導(dǎo)菠蘿果實(shí)內(nèi)H2O2大量生成，尤其在貯藏后期產(chǎn)生活性氧爆發(fā)后，氯化鈣處理的H2O2含量明顯高于僅有損傷接種處理的對(duì)照，而在此階段，氯化鈣處理的菠蘿果實(shí)CHI和GLU酶活性也明顯高于對(duì)照。

總之，氯化鈣處理對(duì)菠蘿采后黑腐病有較好的防治效果，其中1%氯化鈣處理的防治效果最好，最高為18.1%。氯化鈣處理對(duì)黑腐病的防治機(jī)制主要有兩方面：其一是氯化鈣對(duì)黑腐病菌的產(chǎn)孢有直接的抑制作用，進(jìn)而降低了菠蘿果實(shí)中細(xì)胞壁降解酶的活性，延緩了果實(shí)的軟化腐爛;其二是氯化鈣處理對(duì)采后菠蘿果實(shí)有一定的誘導(dǎo)抗病效果，主要表現(xiàn)為可以提高果實(shí)抗病性相關(guān)酶PAL、PPO、CHI、GLU的活性，可以提高貯藏后期果實(shí)中H2O2的含量，而H2O2含量的提高可以調(diào)控病程相關(guān)蛋白CHI和GLU的翻譯表達(dá)，進(jìn)而提高果實(shí)的抗病性。而信號(hào)物質(zhì)H2O2如何調(diào)控菠蘿果實(shí)內(nèi)各種抗病基因的表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

谷? 會(huì)， 朱世江， 詹儒林， 等. 菠蘿黑腐病菌（Thielavi opsis paradoxa）生物學(xué)特性及其對(duì)殺菌劑敏感性測(cè)定[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2014， 31（3）： 448-453， 340.

葛永紅， 李燦嬰， 呂靜祎， 等. 果蔬采后病原真菌分泌胞外酶的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）： 265-270.

胡會(huì)剛， 孫光明， 董? 晨， 等. 菠蘿采后主要病害發(fā)生及防治研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 39（24）： 93-96.

Wijesinghe C J， Wilson Wijeratnam R S， Samarasekara J K R R， et al. Biological control of Thielaviopsis paradoxa on pineapple by an isolate of Trichoderma asperellum[J]. Biological Control， 2010， 53（3）： 285-290.

Wilson Wijeratnam R S， Hewajulige I G N， Abeyratne N. Postharvest hot water treatment for the control of Thielaviopsis black rot of pineapple[J]. Postharvest Biology and Technology， 2005， 36（3）： 323-327.

Wijesinghe C J， Wilson Wijeratnam R S， Samarasekara J K R R， et al. Development of a formulation of Trichoderma asperellum to control black rot disease on pineapple caused by （Thielaviopsis paradoxa）[J]. Crop Protection， 2011， 30（3）： 300-306.

剛成誠， 李建龍， 王亦佳， 等. 利用不同化學(xué)方法處理水蜜桃保鮮效果的對(duì)比研究[J]. 食品科學(xué)， 2012， 33（6）： 269-273.

Conway W S， Sams C E. Calcium infiltration of Golden Delicious apples and its effect on decay[J]. Phytopathology， 1983， 73： 1068-1071.

Conway W S， Greene G M， Hickey K D. Effects of preharvest and postharvest calcium treatments of peaches on decay caused by Monilinia fructicola[J]. Plant Disease， 1987， 71（12）： 1084-1086.

Yu T， Yu C， Lu H P， et al. Effect of Cryptococcus laurentii and calcium chloride on control of Penicillium expansum and Botrytis cinerea infections in pear fruit[J]. Biological Control， 2012， 61（2）： 169-175.

陳? 敏， 高云慨， 宋海超， 等. 氯化鈣結(jié)合季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）對(duì)抑制芒果采后炭疽病效果的影響[J]. 食品科學(xué)， 2016， 37（2）： 204-209.

Holb I J， Balla B， Vámos A， et al. Influence of preharvest calcium applications， fruit injury， and storage atmospheres on postharvest brown rot of apple[J]. Postharvest Biology and Technology， 2012， 67： 29-36.

Zhao Y， Wang C. Effect of calcium chloride in combination with salicylic acid on post-harvest freshness of apples[J]. Food Science and Biotechnology， 2015， 24（3）： 1139-1146.

吳芳芳， 鄭有飛， 吳榮軍. 鈣鹽協(xié)同枯草芽孢桿菌對(duì)蘋果采后炭疽病的控制[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2009， 36（3）： 225-228.

趙? 妍， 楊? 超， 王若蘭， 等. CaCl2處理對(duì)蘋果采后品質(zhì)及炭疽病害的影響[J]. 食品與機(jī)械， 2013， 29（6）： 179-182， 186.

張大智， 詹儒林， 柳? 鳳， 等. 杧果細(xì)菌性角斑病菌細(xì)胞壁降解酶的致病作用[J]. 果樹學(xué)報(bào)， 2016， 33（5）： 585-593.

吳芳芳， 鄭有飛， 萬長健， 等. UV-B 輻射增強(qiáng)對(duì)蘋果采后炭疽病發(fā)病情況和抗病相關(guān)酶活性的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境， 2008， 17（3）： 962-965.

Zhang Z Q， Tian S P， Zhu Z， et al. Effects of 1-methylcyclopropene （1-MCP） on ripening and resistance of jujube （Zizyphus jujuba cv. Huping） fruit against postharvest disease[J]. LWT-Food Science and Technology， 2012， 45（1）： 13-19.

楊冬平， 高兆銀， 李? 敏， 等. 水楊酸結(jié)合超聲波處理對(duì)芒果采后抗病性的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（5）： 974-979.

馬桂珍， 高會(huì)蘭， 張擁華， 等. 鏈孢粘帚霉幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)及其抗真菌活性研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2007， 34（5）： 905-908.

李世貴， 顧金剛， 姜瑞波， 等. 生防木霉菌β-1，3-葡聚糖酶活性研究[J]. 微生物學(xué)雜志， 2010， 30（4）： 88-91.

Chardonnet C O， Sams C E， Trigiano R N， et al. Variability of three isolates of Botrytis cinerea affects the inhibitory effects of calcium on this fungus[J]. Phytopathology， 2000， 90（7）： 769-774.

Ortiz A， Graell J， Lara I. Cell wall-modifying enzymes and firmness loss in ripening ‘Golden Reinders apples： A comparison between calcium dips and ULO storage[J]. Food Chemistry， 2011， 128（4）： 1072-1079.

張? 強(qiáng)， 代文婷， 金新文. 氯化鈣與1-甲基環(huán)丙烯對(duì)伽師瓜果實(shí)軟化與果膠酶活性及其基因表達(dá)影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2019， 45（2）： 45-52.

Ranjbar S， Rahemi M， Ramezanian A. Comparison of nano-calcium and calcium chloride spray on postharvest quality and cell wall enzymes activity in apple cv. Red Delicious[J]. Scientia Horticulturae， 2018， 240： 57-64.

畢? 陽， 劉紅霞. 鈣對(duì)果蔬采后腐爛的控制及作用[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2000， 35（1）： 1-5.

Mansourbahmani S， Ghareyazie B， Kalatejari S， et al. Effect of post-harvest UV-C irradiation and calcium chloride on enzymatic activity and decay of tomato （Lycopersicon esculentum L.） fruit during storage[J]. Journal of Integrative Agriculture， 2017， 16（9）： 2093-2100.

Figueroa C R， Opazo M C， Vera P， et al. Effect of postharvest treatment of calcium and auxin on cell wall composition and expression of cell wall-modifying genes in the Chilean strawberry （Fragaria chiloensis） fruit[J]. Food Chemistry， 2012， 132（4）： 2014-2022.

李? 波， 王? 軍， 孫? 思. 植物誘導(dǎo)抗病機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中國植保導(dǎo)刊， 2013， 33（9）： 19-24.

向婧姝. 植物過敏性反應(yīng)分子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2018， 30（12）： 41-46.

Obrien J A， Daudi A， Butt V S， et al. Reactive oxygen species and their role in plant defence and cell wall metabolism[J]. Planta， 2012， 236（3）： 765-779.

汪開拓， 廖云霞， 袁坤明， 等. β-氨基丁酸處理對(duì)桃果實(shí)采后灰霉病的影響及其誘導(dǎo)抗病模式研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2016， 42（2）： 65-71.

廖云霞， 費(fèi)良航， 夏明星， 等. 不同濃度β-氨基丁酸處理對(duì)葡萄果實(shí)抗病性的誘導(dǎo)模式[J]. 食品科學(xué)， 2018， 39（17）： 221-228.

李會(huì)佳， 朱露露， 李? 帥， 等. BABA， BTH 對(duì)番茄白粉病的抗性研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2016， 28（4）： 580-585.