李俊強，晁利芹，張龍現(xiàn)

隱孢子蟲(Cryptosporidium)在分類上屬于原生動物界、頂復(fù)門、真球蟲目、隱孢子蟲科、隱孢子蟲屬，是一種重要的水源性和食源性傳播的機會致病性人獸共患寄生原蟲[1]。Tyzzer于1907年在小鼠的組織切片中首次發(fā)現(xiàn)并命名了隱孢子蟲，迄今已經(jīng)鑒定36個有效種，以及60多個基因型[2]。其中，90%以上的人體隱孢子蟲感染都是由人隱孢子蟲(C.hominis)和微小隱孢子蟲(C.parvum)引起；感染人體的常見種類還包括：火雞隱孢子蟲(C.meleagridis)，貓隱孢子蟲(C.felis)，犬隱孢子蟲(C.canis)，泛在隱孢子蟲(C.ubiquitum)，兔隱孢子蟲(C.cuniculus)，旅者隱孢子蟲(C.viatorum)，鼠隱孢子蟲(C.muris)，隱孢子蟲花栗鼠基因型I(chipmunk genotype I)；以及一些偶爾感染人體的種類：安氏隱孢子蟲(C.andersoni)，豬隱孢子蟲(C.suis)，牛隱孢子蟲(C.bovis)，肖氏隱孢子蟲(C.xiaoi)，刺猬隱孢子蟲(C.erinacei)，費氏隱孢子蟲(C.fayeri)，母豬隱孢子蟲(C.scrofarum)，泰澤隱孢子蟲(C.tyzzeri)，隱孢子蟲臭鼬基因型(skunk genotype)，水貂基因型(mink genotype)，馬基因型(horse genotype)，等[3-4]。

隱孢子蟲病每年導(dǎo)致近840萬傷殘調(diào)整壽命年(DALYs)，對于免疫正常人群的隱孢子蟲病患者臨床癥狀主要以自限性腹瀉為主。然而，對于免疫力低下或功能缺陷的隱孢子蟲感染者，則可引起嚴重的胃腸炎癥狀并伴隨水樣腹瀉，導(dǎo)致體液大量丟失甚至危及生命[1-2]。隱孢子蟲是發(fā)展中國家第2大最為重要的兒童致腹瀉病原體[5]，有研究表明即使治愈之后亦可導(dǎo)致嬰幼兒發(fā)育遲緩。隱孢子蟲病已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為人類最常見的6種腹瀉病之一。世界范圍內(nèi)隱孢子蟲感染常引起大規(guī)模的暴發(fā)和流行，特別是在發(fā)達國家或地區(qū)[4,6]。微小隱孢子蟲可感染人類和多種哺乳動物，是食源性和水源性傳播的主要種類[4]。同時在一些自然水源中亦可檢測到隱孢子蟲卵囊，由于其可能作為生化武器的潛在性，美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)將其列為B類病原。近年來，先后有超過200種化合物被研究用于隱孢子蟲病的治療，然而到目前仍沒有篩選到適合的藥物。本文將近些年來國內(nèi)外有關(guān)抗隱孢子蟲藥物，及新開發(fā)化合物的種類及作用方式的研究進展進行綜述，以期對臨床治療隱孢子蟲病提供幫助。

1 目前臨床治療在用藥物

1.1硝唑尼特 硝唑尼特(nitazoxanide)是一種高效廣譜的抗腸道寄生蟲藥物[7]。2002年，經(jīng)美國FDA批準用于治療隱孢子蟲病的特異性藥物，到目前也是唯一一種被批準藥物。硝唑尼特藥物的作用機制尚不十分明確，有研究表明硝唑尼特口服后的主要活性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物替唑尼特(tizoxanide)進一步與葡萄糖醛酸結(jié)合生成葡萄糖醛酸替唑尼特，能有效抑制隱孢子蟲子孢子和卵囊的生長。硝唑尼特的臨床藥效試驗數(shù)據(jù)來源于HIV呈陰性的隱孢子蟲病參與者的隨機試驗，顯示顯著高的治愈率達到93%(使用安慰劑對照組為30%～40%)[8]。然而，在隨后的臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)硝唑尼特對于HIV呈陽性的兒童和成年人合并隱孢子蟲感染者無顯著作用[9-10]。因此，硝唑尼特主要用于治療免疫正常的成年人群和>1歲的兒童患者[11]。然而，近年來有報道顯示具有腹瀉癥狀的腎移植人群合并隱孢子蟲感染者，硝唑尼特和氟喹諾酮(fluoroquinolone)聯(lián)合使用具有良好的卵囊清除率[12]。

1.2抗生素類藥物 一些抗生素類藥物雖然沒有被批準用于治療隱孢子蟲病，但臨床上亦有作為替代選擇藥物的報道[13]。其中，巴龍霉素(paromomycin)是一種廣譜的氨基糖苷類抗生素，主要作用于核糖體氨酰tRNA。在隱孢子蟲致腹瀉病的治療上，巴龍霉素是第一個臨床受試藥物。在細胞試驗中巴龍霉素表現(xiàn)的抗隱孢子蟲作用較弱，小范圍的臨床試驗表明巴龍霉素有中等活性的抗隱孢子蟲作用，并且對艾滋病人合并隱孢子蟲感染者部分有效[14]。在治療具有慢性腹瀉癥狀的兒童隱孢子蟲感染者時，巴龍霉素在臨床癥狀的改善方面較硝唑尼特療效要高[15]。而在2000年進行的一項雙盲對照試驗顯示巴龍霉素和安慰劑對照組相比并沒有明顯治療優(yōu)勢。

阿奇霉素(azithromycin)是大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，相比其它抗蠕蟲藥物顯示有效的抗隱孢子蟲作用[16]。聯(lián)合用藥比單一藥物具有更好的療效，研究表明在艾滋病人合并隱孢子蟲腹瀉患者的治療試驗中，阿奇霉素聯(lián)合巴龍霉素治療能夠顯著減少卵囊的排泄及改善臨床癥狀[17]。同樣，在實質(zhì)器官移植合并隱孢子蟲感染的人群中，阿奇霉素和硝唑尼特聯(lián)合使用時抗寄生蟲感染的效果明顯增強[18]。

螺旋霉素(spiramycin)是另一種較早用于隱孢子蟲病治療的抗生素。螺旋霉素對于免疫正常兒童由隱孢子蟲所致的急性腹瀉有一定的效果，它能縮短腹瀉時間及糞排隱孢子蟲卵囊時間，該藥也對艾滋病和骨髓移植病人合并隱孢子蟲感染者有一定療效[19]。也有報道顯示，螺旋霉素能夠減少小鼠模型中隱孢子蟲卵囊的排出量[20]。

此外，還有其它一些抗生素類藥物，如拉沙里菌素和西尼霉素也能預(yù)防及清除大鼠腸道內(nèi)隱孢子蟲感染。上述抗生素類治療藥物均呈劑量依賴性，也就是說必須使用大劑量方能有預(yù)防或治療作用，但均只能減少不能清除腸道內(nèi)隱孢子蟲，停藥后容易復(fù)發(fā)，且尚有治療隱孢子蟲病無效的報道，因此這些藥物的臨床治療效果還需進一步研究[13,19]。

1.3中藥成分類藥物 大蒜素(garlicin)是從大蒜中提取的蒜辣素制成，蒜辣素產(chǎn)生的二烯丙基二硫化物、二烯丙基化三硫化物及蒜硫苷等有效活性成分均有較強的殺菌作用。早在1994年就有大蒜素治療172例嬰幼兒隱孢子蟲感染性腹瀉臨床病例的報告[21]，隨后1997年和2010年分別報道采用大蒜素治療合計超過300例嬰幼兒隱孢子蟲致腹瀉的病例，且治療過程中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[22-23]。2015年，Huang等[24]報道在接受康復(fù)治療的吸毒者中測試了乙酰螺旋霉素聯(lián)合或不聯(lián)合大蒜素的抗隱孢子蟲效果，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療的治愈率(92.1%)較單獨用藥治療(72%～76%)和安慰劑組(61.8%)高。這些臨床研究結(jié)果顯示大蒜素是有效的抗隱孢子蟲病的藥物，然而大蒜素抗隱孢子蟲作用機制尚不清楚。2009年張珍等[25]研究大蒜素對隱孢子蟲感染小鼠模型的治療效果發(fā)現(xiàn)治療組小鼠糞便卵囊排出量明顯減少，且大蒜素可以提高免疫抑制小鼠CD4+T細胞水平，促進腸道黏膜slgA的分泌[20]。

常山酮(halofuginone)是中藥有效成分常山堿(febrifugine)的衍生物，主要用于家畜家禽球蟲病及瘧疾的治療和預(yù)防。2007年Linder等[26]通過對常山酮差向異構(gòu)化拆分得到一對對映體，并且對其進行了細胞抗隱孢子蟲活性試驗和小鼠體內(nèi)的急性毒性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外消旋化的常山酮都有很強的抗隱孢子蟲活性。同樣，天然提取物姜黃素(curcumin)主要的生物學(xué)活性包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗多種原蟲等，在體外(HCT-8細胞)以及免疫正常和抑制BALB/c小鼠體內(nèi)均具有清除隱孢子蟲感染的能力[27]。

在治療隱孢子蟲病的臨床實踐研究過程中，苦參合劑、補骨脂、雙氫青蒿素、當(dāng)歸補血湯及其多糖等中藥成分合劑，均有有效治療隱孢子蟲病的報道[19]。然而，作者認為這些中草藥物主要通過對宿主細胞的免疫激發(fā)提高宿主自身免疫力，緩解隱孢子蟲感染所致的腹瀉癥狀，從而達到緩解隱孢子蟲病癥狀的效果。

2 老藥新用類藥物

2.1他汀類藥物 由于臨床上治療隱孢子蟲病的迫切需要，抗隱孢子蟲藥物篩選的努力嘗試從來沒有停止過。目前，他汀類藥物(statins)被廣泛用于心血管疾病的治療，其可抑制3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶，該還原酶能將HMG-CoA轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸(mevalonic acid，MVA)從而阻礙膽固醇的生物合成[28]，甲羥戊酸還參與了蛋白的異戊二烯化修飾。隱孢子蟲具有利用異戊二烯(isoprenoids)的多種代謝途徑，然而缺乏所有已知用來合成異戊二烯前體的酶類。2013年，Bessoff等[29]在細胞模型中篩選鑒定出伊伐他汀(itavastatin)是隱孢子蟲(C.parvum)卵囊生長的有效抑制劑。隨后，Madbouly等[30]研究顯示降膽固醇藥物阿托伐他汀(atorvastatin)單獨或聯(lián)合硝唑尼特使用均可以有效治療免疫抑制小鼠模型中隱孢子蟲(C.parvum)感染，表現(xiàn)為腸內(nèi)容物和糞便中的卵囊數(shù)量降低，與未經(jīng)治療的感染組相比聯(lián)合治療的小腸組織病理學(xué)變化有顯著改善。鑒于阿托伐他汀眾所周知的安全性和治療高膽固醇血癥和心血管疾病的常用方法，聯(lián)合硝唑尼特可能被證明是治療隱孢子蟲病的一種有效的替代療法。

2.2氯苯吩嗪 Love等[31]在體外細胞模型中基于細胞表型對78 942種化合物進行了抗隱孢子蟲療效的篩選，鑒定了12個具有活性且無細胞毒性的抗隱孢子蟲化合物，包括氯苯吩嗪(clofazimine)是一種FDA先前批準用于治療麻瘋病(leprosy)的藥物，并且具有良好的安全性。在體外細胞模型抗隱孢子蟲(C.parvum和C.hominis)試驗中顯示有很強的活性，同樣在小鼠體內(nèi)感染模型中，連續(xù)3次氯苯吩嗪治療后卵囊脫落量已經(jīng)低于流式細胞儀檢測限度，顯示具有顯著的抗隱孢子蟲作用[31]。此外，Zhang等[32]成功開發(fā)了氯苯吩嗪納米粒制劑以改善難溶性問題，并有可能提高其療效。目前，氯苯吩嗪作為抗隱孢子蟲藥物已經(jīng)用于臨床人體試驗[33]。

2.3茚地那韋 有研究顯示茚地那韋(indinavir)作為HIV蛋白酶抑制劑以濃度依賴的方式抑制隱孢子蟲(C.parvum)的細胞入侵，同時加載改良型性納米粒試驗顯示出顯著的抑制隱孢子蟲(C.parvum)感染入侵，降低了茚地那韋的毒副作用[34]。納米顆粒能夠?qū)⑺幬镙斔偷剿拗髂c上皮細胞和納蟲空泡內(nèi)的微小顆粒，可以用來減少臨床可用藥物的劑量和毒副作用。這些被批準用于其它疾病的治療的藥物化合物，通過對抗隱孢子感染效果的研究顯示具有良好治療效果的藥物，還有非吸收性的抗蠕蟲藥物恩波吡維銨恩波維銨(pyrvinium pamoate)，同樣具有可作為治療隱孢子蟲病的潛在候選藥物的報道[35]。

3 潛在療效的先導(dǎo)化合物

3.1激酶抑制劑 隨著隱孢子蟲基因組測序、遺傳操作、分子靶標鑒定等研究的深入，針對這些靶標物質(zhì)的鑒定與優(yōu)化方面已取得了重大進展。與其它真核細胞一樣，原蟲細胞也依賴由蛋白激酶控制的基本途徑，精確地抑制這些蛋白激酶而不影響哺乳動物激酶是藥物開發(fā)的目標。頂復(fù)門原蟲的鈣依賴性蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases，CDPK)在宿主細胞入侵過程中起至關(guān)重要作用[36]，由于其與哺乳動物同系物相比缺少阻止進入活性部位的氨基酸，激酶抑制劑(bumped kinase inhibitors，BKI)被開發(fā)用來抑制隱孢子蟲的CDPK1，并已篩選出一系列抑制劑化合物。Castellanos-Gonzalez等[37]研究了BKI-1517和BKI-1553在HCT-8細胞和小鼠模型中抗隱孢子蟲的活性，發(fā)現(xiàn)83%的小鼠在服用治療劑量后痊愈。同樣，在隱孢子蟲感染犢牛模型體內(nèi)其抑制寄生蟲的脫落和改善腹瀉癥狀的功效也得到了驗證[38]。隨后，觀察到BKI-1294、1369、1534和1649能夠顯著減少細胞(HCT-8)模型和IFN-γ基因敲除小鼠模型中隱孢子蟲卵囊的感染量[39]，并且在犢牛模型中化合物BKI-1294能顯著減少隱孢子蟲卵囊的脫落量[40]。Huang等[41]評價了一系列低納摩爾，以5-氨基吡唑-4-甲酰胺(5-aminopyrazole-4-carboxamide)為支架的CpCDPK1抑制劑，發(fā)現(xiàn)在體外細胞模型中能有效地抑制隱孢子蟲(C.parvum)的生長，并顯著降低新生小鼠的荷蟲量。然而，Kuhlenschmidt等[42]研究顯示吡唑并嘧啶衍生物(pyrazolopyrimidine derivatives)對CDPK1體外細胞模型中隱孢子蟲的抑制作用與酶抑制沒有很好的相關(guān)性。

其它潛在的激酶需要進一步的檢測，以確定其作為治療隱孢子蟲感染靶點的生物學(xué)作用和潛力。例如，假定激酶家族(putative kinases，F(xiàn)IKKs)是一種寄生蟲特異性蛋白激酶，已鑒定出有效的抑制劑，但抑制作用與寄生蟲生長的影響無關(guān)[43]。以隱孢子蟲脂激酶PI(4)K為靶點，通過篩選對隱孢子蟲抑制作用的化合物，鑒定出靶向參與隱孢子蟲蛋白質(zhì)合成的酶也是一種有效的開發(fā)抗隱孢子蟲藥物的新策略。Manjunatha等[44]在體外細胞模型中篩選了6 220種抑制隱孢子蟲(C.parvum)感染的化合物，并鑒定出吡唑并吡啶類化合物(pyrazolopyridines)具有抑制60%以上抗感染能力。對隱孢子蟲脂激酶PI(4)K酶活性靶點的進一步優(yōu)化篩選出了化合物KDU731，能顯著減少IFN-γ基因敲除小鼠模型卵囊的脫落，以及犢牛體內(nèi)卵囊脫落和改善腹瀉癥狀。同時藥物對動物機體的心臟毒性、致突變性、染色體畸形或光毒性試驗顯示沒有內(nèi)在風(fēng)險[44]。因此，KDU731被鑒定為體內(nèi)外抗微小隱孢子蟲的最佳先導(dǎo)化合物，然而其臨床性能有待進一步的研究。

3.2合成酶抑制劑 隱孢子蟲脂肪酰輔酶A結(jié)合蛋白(fatty acyl-CoA binding protein，ACBP)可作為抗隱孢子蟲感染藥物篩選的靶點，通過體外細胞模型初步篩選一些抗隱孢子蟲藥物，有效化合物為溴代喹啉(broxyquinoline)、氯代喹啉(cloxyquin)、氯唑西林鈉(cloxacillin sodium)和脫氫膽酸鈉(sodium dehydrocholate)[45]。脂肪酰輔酶A合成酶(fatty acyl-coenzyme A synthetases，ACS)在脂肪酸代謝中是必需的，存在于各種頂復(fù)門原蟲中，研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)外模型中使用Triacsin C靶向ACS作用于隱孢子蟲，均具有高效的抗隱孢子蟲作用[46]。油酰膽堿Oleylphosphocholine(OlPC)在誘導(dǎo)寄生蟲細胞凋亡的同時，與抗寄生蟲藥物米替福新(miltefosine)的作用類似，它干擾了寄生蟲脂質(zhì)的合成和細胞膜的完整性。在一項非洲贊比亞患有隱孢子蟲病的成年患者中，米替福新治療表現(xiàn)出不良療效和嚴重不良后果。另一方面，OlPC已經(jīng)開發(fā)用于治療利什曼病，并且在小鼠模型中顯示出良好的耐受性。Sonzogni-Desautels等[47]在體內(nèi)和體外對該化合物進行了抗隱孢子蟲試驗，發(fā)現(xiàn)OlPC抑制了HCT-8細胞模型中隱孢子蟲(C.parvum)的感染，能夠治療小鼠模型中隱孢子蟲(C.parvum)的致死性感染，并且30 d內(nèi)沒有復(fù)發(fā)的跡象。OlPC對HCT-8細胞的毒性作用明顯優(yōu)于米替福新，可作為抗微小隱孢子蟲感染一個有效的潛在候選藥物[47]。

半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族K11777(N-methyl piperazine-Phe-homoPhe-vinylsulfone phenyl)以濃度依賴的方式抑制細胞模型中隱孢子蟲(C.parvum)的生長。此外，在免疫缺陷小鼠模型中口服或腹腔注射治療10 d，也顯示對微小隱孢子蟲敏感[48]。tRNA合成酶將特定的tRNA與選定的氨基酸結(jié)合以合成蛋白質(zhì)，在生物體生物過程中至關(guān)重要?；衔顱enzoxaborole對真菌和細菌氨基酰tRNA合成酶具有已知的抑制活性，Palencia等[49]測試了一些抗隱孢子蟲化合物的作用，一種3-氨甲基修飾的benzoxaborole化合物AN6426，被鑒定具有抗隱孢子蟲亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)的活性，通過抑制活性位點的蛋白質(zhì)合成來抑制其在細胞模型中的生長[49]。同樣，Jain等[50]也測試了一系列喹唑啉酮(quinazolinone)為支架通過抑制脯氨酰tRNA合成酶(prolyl-tRNA synthetases)的化合物，驗證了這些分子作為潛在的抗隱孢子蟲候選藥物[50]。Kumar等[51]評價了人隱孢子蟲(C.hominis)具有雙官能團的胸苷酸合成酶二氫葉酸還原酶(thymidylate synthase-dihydrofolate reductase)的一種抑制劑，顯示顯著減少了細胞模型中的寄生蟲感染的作用。Mukerjee等[52]使用針對與納米粒結(jié)合的寄生蛋白CP2的特異性抗體將抑制劑傳遞到吶蟲空泡中，與單獨使用抑制劑或納米粒相比，細胞模型中隱孢子蟲感染顯著減少。這些研究表明藥物輸送到腸細胞的重要性，并可能有助于改善先前確定的療法。

3.3其它抑制劑 最近，Jumani等[53]分析了開放式抗瘧藥箱(open access malaria box)，并確定MMV665917是一種有效的抗隱孢子蟲抑制劑。MMV665917在急性小鼠模型中有效，在慢性小鼠模型中可逐步消除寄生蟲感染，顯示對于體內(nèi)外清除隱孢子蟲的感染是強效的抑制作用[54]。同樣，Eltahan等[55]使用高通量篩選中發(fā)現(xiàn)了一種有機硒藥依布硒林(ebselen)，它是隱孢子蟲(C.parvum)葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(glucose-6-phosphate isomerase，GPI)的選擇性抑制劑，雖然CpGPI沒有完全被抑制，但觀察到體外寄生蟲生長的抑制。

隱孢子蟲的另一個重要代謝途徑是嘌呤的合成，腺苷轉(zhuǎn)化為鳥嘌呤核苷酸需要氧化還原酶肌苷5′-磷酸脫氫酶(inosine 5′-monophosphate Dehydrogenase，IMPDH)。這種酶似乎起源于細菌，因此其結(jié)構(gòu)不同于宿主的直系同源物。CpIMPDH抑制劑對隱孢子蟲具有體外藥效[56]。Gorla等[57]在IL-12敲除小鼠模型中檢測了8種CpIMPDH抑制劑的藥效，其中，P131每日給藥3次，體內(nèi)抗隱孢子蟲(C.parvum)效果優(yōu)于巴龍霉素。靶向糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶乳酸脫氫酶LDH，通過計算生物學(xué)模擬顯示小分子化合物CHEMBL1784973對微小隱孢子蟲具有較強的抑制作用和藥效特性[58]，這種方法對新藥物的篩選起到了重要的推動作用。

4 結(jié) 語

隱孢子蟲是一種在世界范圍內(nèi)廣泛分布的病原體，可造成免疫抑制個體的持續(xù)性腹瀉及兒童的發(fā)育遲緩。硝唑尼特是唯一被FDA批準用于治療隱孢子蟲病的藥物，但對艾滋病人合并隱孢子蟲感染者無效。由于臨床上對治療隱孢子蟲病的迫切需要，抗隱孢子蟲藥物的篩選和研制越來越引起重視。由于隱孢子蟲生物代謝途徑的多樣性(某些生物生物代謝途徑可能完全消失或者高度簡化)及自身藥物外排作用的存在，使得隱孢子蟲體內(nèi)不能達到有效的藥物濃度導(dǎo)致大多數(shù)受試藥物效果不佳，給藥物的研制和開發(fā)帶來較大的困難。雖然目前已報道了一些候選藥物，但還未篩選出治療隱孢子蟲病的特效藥。而且多數(shù)抗隱孢子蟲藥物仍處于動物試驗階段，用于臨床治療的報道較少且結(jié)論尚不一致。隨著新治療靶點的發(fā)現(xiàn)與鑒定，為進一步設(shè)計和篩選選擇性高，抑制性強的抗隱孢子蟲藥物奠定了基礎(chǔ)。另一方面，新化合物或現(xiàn)有化合物的改進，以及現(xiàn)有批準藥物的抗隱孢子蟲活性的鑒定也是在將來研究的方向之一。

利益沖突：無