徐玲玲， 趙明陽(yáng),2， 張 倩， 張 焱

(1.西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院植物微生物協(xié)同研究實(shí)驗(yàn)室，西安 710065；2.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000)

中藥白及(Bletillastriata)為蘭科植物的塊莖，用藥歷史久遠(yuǎn)，主要產(chǎn)地有貴州、廣西、安徽、陜西、甘肅等.白及在臨床和工業(yè)上的廣泛應(yīng)用，使得市場(chǎng)需求量大大增加，但野生白及資源因采挖日趨減少，價(jià)格急劇上漲[1-3].

現(xiàn)代研究表明白及的主要藥用成分為白及膠[4]，又稱為白及多糖，白及膠是評(píng)估白及品質(zhì)的重要參考依據(jù)[5],不同生長(zhǎng)階段和地區(qū)白及球莖白及膠含量不同[6-7].因此，隨著白及產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，提取和測(cè)定白及膠含量是探究白及品質(zhì)的必要技術(shù)，因此建立白及膠提取和測(cè)定方法體系，是白及產(chǎn)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的基礎(chǔ).

白及膠的提取有多種方法，如傳統(tǒng)水提法、超聲波法、堿水提法、纖維素酶解法[8-13].其中超聲波法提取率最高，且用時(shí)最短，是最優(yōu)選[5,8].超聲波提取法與熱水提取法相比，白及膠的得率和純度與熱水提取法相近，但是縮短了提取時(shí)間，減少了提取液的用量，從而降低了成本.而且加大超聲功率更有助于白及膠從細(xì)胞中釋放、溶出.測(cè)定白及膠含量的方法有蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法，蒽酮硫酸法較苯酚硫酸法試劑更加簡(jiǎn)單，所以采用蒽酮硫酸法[14-17].

本研究以非常適合陜西省規(guī)?；N植且價(jià)格高、市場(chǎng)前景好的蘭科中藥白及作為研究對(duì)象，采用超聲波提取的方法，通過(guò)對(duì)栽培一年和兩年的白及塊莖中的白及膠進(jìn)行提取，并用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定其白及膠含量，建立一套完善的白及膠提取和含量測(cè)定方法體系，為白及產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展打下基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

栽培一年和兩年的白及塊莖是2016年10月采集于陜西省安康市旬陽(yáng)縣白及馴化基地內(nèi).

使用的試劑有85%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇、重蒸水、氯仿、正丁醇；D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品、蒽酮、濃硫酸.

2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

2.1 白及塊莖的預(yù)處理

將采集的一年生和兩年生白及塊莖用自來(lái)水沖洗干凈，剪掉多余的根只留下塊莖.將白及塊莖切成厚度約為2～3 mm的薄片，烘箱中烘干至恒重.用研缽分別把烘干的白及碾碎成粉末狀，放入離心管中編號(hào)保存在干燥器中.準(zhǔn)確稱取1.0 g白及粉末，加入85%乙醇進(jìn)行加熱回流，乙醇與白及粉末比例為1∶15，溫度為100 ℃，每次1 h，重復(fù)2次.將加熱回流的混合液置于布氏漏斗進(jìn)行抽濾，棄去提取液，殘?jiān)糜诤嫦渲泻娓蓚溆?目的是除去白及塊莖中的醇溶性雜質(zhì)，降低后續(xù)醇沉過(guò)程中白及膠中的雜質(zhì)的含量.

2.2 超聲波法提取白及膠

將預(yù)處理所得白及粉末置于50 mL錐形瓶中，保鮮膜封口，放入超聲清洗機(jī)中超聲提取.提取溫度為80 ℃，頻率為100 Hz，每次30 min，重復(fù)3次.抽濾，合并抽濾得到的濾液.將上步所得的濾液，放入圓底燒瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā).溫度為80 ℃，轉(zhuǎn)速80 r/min，濃縮至黏稠，得到濃縮液.用Sevag法去除濃縮液中的游離蛋白.加入氯仿-正丁醇混合液(濃縮液∶氯仿∶正丁醇=25∶5∶1)，劇烈震蕩后靜置30 min使反應(yīng)充分，然后6 000 r/min離心5 min，重復(fù)6次，棄沉淀，合并上清液.將上清液置于圓底燒瓶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至黏稠.溫度為40 ℃，轉(zhuǎn)速80 r/min，得到濃縮液.向濃縮液中加入3倍體積的95%乙醇，析出大量白色絮狀沉淀，靜置過(guò)夜，使沉淀完全.抽濾后將沉淀物置于烘干箱60 ℃中真空干燥，即得白及膠.

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蒽酮0.2 g，用濃硫酸溶解并于100 mL容量瓶定容，臨用時(shí)配制.精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品17.5 mg，加水溶解并置于100 mL容量瓶定容，搖勻即得葡萄糖對(duì)照品溶液.分別于10 mL刻度試管中依次加入精密量取的葡萄糖對(duì)照品溶液0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，并加蒸餾水至2 mL.將刻度試管置于冰水浴中，精密加入蒽酮-硫酸試液4.5 mL，混勻后一起置沸水浴中加熱3 min，取出后立即置流水中冷卻10 min，以葡萄糖濃度為零的試液為空白.在625 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.以吸光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.4 白及膠換算因子供試品溶液的制備與吸光度測(cè)定

精密稱取60 ℃干燥至恒重的一年生、兩年生白及膠各21.42 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻.精密量取該液5 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為白及膠供試品溶液.按照2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法進(jìn)行吸光度的測(cè)定.

2.5 白及膠含量測(cè)定供試品溶液的制備與吸光度測(cè)定

精密稱取白及粉末0.2 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加蒸餾水50 mL，稱重，加熱回流1 h.保鮮膜封口，放入超聲清洗機(jī)中超聲提取.提取溫度為80 ℃，頻率為100 Hz，每次30 min，重復(fù)3次.抽濾，合并抽濾得到的濾液.精密量取續(xù)濾液5 mL于50 mL離心管中，加入30 mL無(wú)水乙醇，吸打混勻后靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，留沉淀.揮散殘留乙醇后，沉淀用熱水溶解，置于100 mL容量瓶定容，即得供試品溶液.按照2.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法進(jìn)行吸光度的測(cè)定.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下，每個(gè)梯度所加的標(biāo)準(zhǔn)液毫升數(shù)，計(jì)算出每個(gè)梯度中對(duì)應(yīng)的葡萄糖質(zhì)量數(shù)(mg)作為橫坐標(biāo)，以分光光度計(jì)測(cè)定的吸光度OD值為縱坐標(biāo)，具體數(shù)據(jù)如表1所示，用Excel 2010建立葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，得到線性回歸方程為y=6.737x+0.001 4，R2=0.998接近1，線性關(guān)系良好.

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)測(cè)量

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 供試品溶液吸光度

按照2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法進(jìn)行吸光度的測(cè)定，分別得到一年生、兩年生白及換算因子供試品和含量測(cè)定供試品溶液的吸光度如表2所示.

表2 供試品溶液吸光度

3.3 計(jì)算換算因子f

按照計(jì)算換算因子公式：f=W/C，計(jì)算換算因子.式中：W為白及膠質(zhì)量數(shù)(mg)，C為葡萄糖質(zhì)量數(shù)(mg).從2.4中供試品溶液配制得出W=1.671 mg，按照表2中換算因子供試品溶液測(cè)出的吸光度值，代入回歸方程中的y值，所計(jì)算出的x值即為C；C1=0.09 5，C2=0.060 8(C1為一年生白及，C2為兩年生白及).將W值和C值代入f=W/C，得f1=1.789 0，f2=2.748 4(f1為一年生白及換算因子，f2為兩年生白及換算因子).

3.4 白及中白及膠含量計(jì)算

將表2中的含量測(cè)定供試品溶液測(cè)出的吸光度值代入回歸方程中的y，算出相應(yīng)葡萄糖質(zhì)量數(shù)為：X1=0.061 6，X2=0.050 7(X1為一年生，X2為兩年生).白及膠含量百分比=f×X×100%，一年生白及中白及膠含量為11.02%，兩年生白及中白及膠含量為13.93%.

4 討論

本研究采用超聲波提取的方法，通過(guò)對(duì)一年生，兩年生的白及塊莖中的白及膠進(jìn)行超聲提取，并用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定一年生、兩年生白及塊莖中白及膠含量，其中一年生白及塊莖中白及膠含量為11.02%，兩年生白及塊莖中白及膠含量為13.93%.在一定的生長(zhǎng)年限內(nèi)，隨著白及生長(zhǎng)年限的增加，塊莖中白及膠的含量隨之增加，但是隨著年限不斷增加白及塊莖中白及膠的含量是否增加還有待繼續(xù)研究.

超聲法提取粗白及膠之后，抽濾時(shí)，黏性較大，黏附在濾紙上的提取液較多，可能造成白及膠損失量大，最終測(cè)定白及膠濃度過(guò)小的結(jié)果.為解決這一問(wèn)題，應(yīng)在白及膠含量測(cè)定這一部分進(jìn)行改進(jìn).在超聲提取之前，可以考慮使用果膠酶對(duì)藥材進(jìn)行處理來(lái)降低粘度，再進(jìn)行白及膠的提取.白及膠的含量在不同年限的白及塊莖中含量不同，且三年生白及中白及膠含量最高，按含量大小兩年生次之，一年生再次，四年生最低[6].本研究中，研究對(duì)象白及年限只有一年生和兩年生塊莖.只能證明一定生長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)白及塊莖中白及膠含量的大體趨勢(shì)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可采集三年生、四年生白及塊莖探討白及整個(gè)生長(zhǎng)階段中，白及塊莖中的白及膠含量與生長(zhǎng)時(shí)間的關(guān)系.