朱春玲,李 梅,劉 麗,劉少龍,夏小靜,王 青,徐彥召,杭柏林,孫亞偉,胡建和,王 磊

(河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

近年來,由于傳統(tǒng)抗生素的濫用,藥物殘留及耐藥性問題日益嚴(yán)重,時刻威脅著人類的健康,尋找新的抗菌藥物迫在眉睫?？咕氖且活惙肿恿肯鄬^小并由基因編碼核糖體合成的生物活性肽[1]。Boman G.等人發(fā)現(xiàn)第1個天然抗菌肽天蠶素以來,便開啟了抗菌肽研究的黃金時代。隨著抗菌肽研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)抗菌肽具有抗菌、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)凋亡以及加快傷口愈合的功能。然而,天然抗菌肽的生產(chǎn)成本高、細胞選擇性差,限制了天然多肽在臨床上的應(yīng)用[2],另外,如何進行規(guī)模化生產(chǎn)和純化仍是限制抗菌肽開發(fā)的技術(shù)瓶頸。為充分提高抗菌肽的利用效率,基因工程技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到抗菌肽的研發(fā)過程中,在本文中,我們將對抗菌肽真核表達系統(tǒng)、原核表達系統(tǒng)和人工設(shè)計化學(xué)合成等進行綜述,以期為抗菌肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 真核表達系統(tǒng)

1.1 酵母表達系統(tǒng) 目前,已有500多種外源蛋白在酵母表達系統(tǒng)中獲得表達,Sang M[3]等為探究ABP-Dhc-cecropin A線性陽離子肽表達的新方法,將ABP-Dhc-cecropin A基因重組到pPICZ αA載體上,通過電擊的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母體內(nèi),在適宜培養(yǎng)條件下成功表達了濃度為48 mg/L的ABPDhc-cecropin A線性陽離子肽。Xing L W[4]研究發(fā)現(xiàn)Fowlicidins是雞體內(nèi)一組重要的抗菌肽,在雞先天免疫中具有防御作用,并廣泛表達在各個組織中。為獲得大量的Fowlicidins,該實驗組人員將畢赤酵母X-33與表達載體pPICZ αA重組,成功構(gòu)建攜帶Fowlicidin-2基因的表達系統(tǒng),在優(yōu)化的發(fā)酵條件下Fowlicidin-2的濃度可達85.6 mg/L,純度大于95%。Lui D P[5]等人完整的設(shè)計了一個抗菌肽Abaecin,并對其密碼子進行優(yōu)化,通過pPic9表達載體,將Abaecin基因亞克隆至畢赤酵母基因組內(nèi),甲醇誘導(dǎo)激活,結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組表達的Abaecin可以有效抑制大腸桿菌的生長。畢赤酵母等真核表達體系具有翻譯后的加工修飾功能,表達的蛋白更接近于天然蛋白,能夠克服原核表達系統(tǒng)低表達包涵體的缺點,目前,利用畢赤酵母表達系統(tǒng)已經(jīng)進行了多種抗菌肽的表達。然而,畢赤酵母等真核表達體系也存在缺陷,比如產(chǎn)物復(fù)雜,不易純化,且表達的成本較高。

1.2 轉(zhuǎn)基因植物表達系統(tǒng) 轉(zhuǎn)基因植物表達系統(tǒng)由于其高效性已被廣泛使用。轉(zhuǎn)基因植物疫苗和藥用蛋白的表達系統(tǒng)有很多,其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物表達系統(tǒng)、植物病毒瞬時表達系統(tǒng)以及葉綠體表達系統(tǒng)最為常用。目前轉(zhuǎn)基因植物在生產(chǎn)經(jīng)濟蛋白質(zhì)方面具有相當(dāng)大的市場潛力,而且轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的藥物在臨床試驗中表現(xiàn)出低免疫原性[6]。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物表達系統(tǒng)是一種利用天然的轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng),具有表達成功率高和產(chǎn)物活性好的優(yōu)點。Lee l H[7]等人將人類的LL-37多功能抗菌肽基因通過pPZP載體引入農(nóng)桿菌基因組中,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)作用將目的抗菌肽基因轉(zhuǎn)入水稻中,結(jié)果表明,LL37能夠在轉(zhuǎn)基因水稻中高效表達,且能夠顯著抑制水稻葉枯病的發(fā)生。Chahardoli M[8]等人將重組的牛乳鐵蛋白通過發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入到煙草毛根部,證實重組牛乳鐵蛋白在發(fā)根中存在,并對大腸桿菌有良好的抑制作用。Song D[9]等人將兔defensin NP-1基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進入萵苣體內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因萵苣能夠?qū)莶菅挎邨U菌和銅綠假單胞菌起到較強抑制作用。另外,在植物中表達宿主病毒的抗體抑制植物其他病原感染的有效手段之一。Jung Y J[10]等人將多肽Hcap18/LL-37基因融合到花椰菜花葉病毒控制的前導(dǎo)序列,借助花椰菜花葉病毒將Hcap18/LL-37基因轉(zhuǎn)入白菜體內(nèi),成功表達人類抗菌肽hCAP/LL-37,轉(zhuǎn)基因白菜具有不同程度的抗細菌及真菌的能力。

Retrocyclin-101(RC101)和Protegrin-1(PG1)是治療細菌或病毒感染的兩種有效抗菌肽,但其化學(xué)合成價格昂貴,Lee S B[11]等人創(chuàng)建了Retrocyclin-101(RC101)和Protegrin-1(PG1)基因編碼的葉綠體轉(zhuǎn)化載體,證實Retrocyclin-101(RC101)穩(wěn)定的整合到煙草葉綠體基因組中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),RC101和PG1基因表達的可溶性蛋白含量分別可達32%～38%、17%～26%,葉綠體表達系統(tǒng)獲取的抗菌肽效率比有機萃取高10倍以上[11]。并且比生物表達系統(tǒng)和化學(xué)合成便宜且收益率更高,隨著技術(shù)的發(fā)展,轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為實驗的常用手段之一。

1.3 昆蟲細胞表達系統(tǒng) 迄今為止,昆蟲是世界上最大的生物種群,超過一半的抗菌肽來自于昆蟲。自20世紀(jì)70年代初,瑞典科學(xué)家Boman等首先從惜古比天蠶中獲得抗菌肽,并確定天蠶素A和B的一級結(jié)構(gòu)順序,昆蟲免疫進入一個嶄新時期。昆蟲細胞是重組桿狀病毒的天然宿主之一,被廣泛用于重組蛋白的表達及人類和獸醫(yī)生物制品的制備,對質(zhì)粒介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)染具有遺傳穩(wěn)定性。桿狀病毒表達載體系統(tǒng)在過去的三十多年里已經(jīng)發(fā)展為表達外源蛋白最廣泛的系統(tǒng)之一。Snakin-1(StSN1)是一種從茄屬植物中提取的一種廣譜性抗菌肽,結(jié)果表明,該抗菌肽在使用細菌及酵母表達系統(tǒng)時均不能有效的解決生產(chǎn)低效的問題。Almasia N I[12]等人將Snakin-1(StSN1)優(yōu)化基因重組到桿狀病毒并感染草地貪夜蛾Sf9細胞,得到重組Snakin-1多肽,將這些蛋白注射到小鼠體內(nèi),小鼠可以產(chǎn)生抗Snakin-1的抗體。鈣轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)肽在鈣的吸收過程中發(fā)揮重要作用,可以有效的控制細菌的生理活動。Phan T C[13]等人將Caltrin基因插入pcDNA3.1 v5/His-TOPO載體上,隨后將Caltrin-his序列連接到轉(zhuǎn)移載體pBacPAK9中,在昆蟲細胞中進行高效表達caltrin(鈣轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)肽),結(jié)果發(fā)現(xiàn),該重組蛋白表達效率高、特異性好。昆蟲細胞表達系統(tǒng)是一種真核表達系統(tǒng),安全性高,能夠容納較大的外源基因,具有完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)和高效表達外源基因的能力。

1.4 動物細胞表達系統(tǒng) 哺乳動物體內(nèi)含多種天然抗菌肽,對多種細菌有較強殺傷作用。哺乳動物是天然的抗菌肽來源庫,大批量誘導(dǎo)合成是實現(xiàn)臨床應(yīng)用的一個有效途徑。試驗結(jié)果表明,抗菌肽Cecropin A-magainin在體外有明顯的殺菌作用,為增強其抗菌能力并減少表達系統(tǒng)的毒副作用,Zhang J[14]等人將該基因通過腺病毒載體轉(zhuǎn)入到小鼠巨噬細胞中,后期動物試驗結(jié)果顯示,重組巨噬細胞能夠明顯抑制細胞內(nèi)細菌的生長,為控制細胞內(nèi)感染提供了新方法。陽離子抗菌肽LL-37在腸黏膜防御方面具有重要作用,通常表達在表面上皮細胞和人類的淺層結(jié)腸上癮窩,很少表達在深處的結(jié)腸隱窩或小腸上皮細胞。Sharma N[15]等人克隆牛的乳鐵蛋白肽基因(Lactoferrin)并轉(zhuǎn)到pIggyBac轉(zhuǎn)座子載體上,在牛乳腺上皮干細胞中表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn),表達產(chǎn)物在對抗奶牛乳房炎病原菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌時效果顯著。研究表明,pIggy-Bac轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)的乳鐵蛋白肽在乳腺上皮干細胞或奶牛乳腺細胞中的表達為奶牛乳腺反應(yīng)器奠定了基礎(chǔ)。與其他的真核表達體系相比,哺乳動物細胞表達的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白,但成本較高。

1.5 衣藻表達載體 單細胞微生物如大腸桿菌、酵母等,都已用作外源基因表達載體,然而素有“綠色酵母”之稱的衣藻在蛋白表達方面卻相對滯后。Dong B[16]等人將3個串聯(lián)Mytichitin-A重復(fù)序列基因轉(zhuǎn)移到衣藻體內(nèi),研究顯示,Mytichitin-A可溶性蛋白收益率達到0.28%且表達水平持續(xù)六個月以上,與天然抗菌肽和酵母表達系統(tǒng)相比,對革蘭陰性菌的抑制效果更好且無細胞毒副作用,可以作為細胞工廠化生產(chǎn)Mytichitin-A。

2 原核表達載體

原核表達載體是基因工程中常用的一種,但由于宿主菌的選擇性導(dǎo)致目的蛋白表達過少或不表達以及細胞毒性都限制了原核表達系統(tǒng)在合成抗菌肽中的使用。常用的抗菌肽原核表達系統(tǒng)如下：

2.1 大腸桿菌表達 大腸桿菌是原核表達最常用的載體之一。殼聚糖酶是一種專門水解殼寡糖的酶,且殼寡糖作為抗菌劑廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、壞境等領(lǐng)域。為提高殼聚糖酶產(chǎn)量,Kilani-Feki O[17]等人將枯草芽孢桿菌的殼聚糖酶相關(guān)基因(Chitosanase CSNV26 of Bacillus subtilis)通過pBAD載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi),這種蛋白在大腸桿菌內(nèi)分泌量高達6.2 mg/L,活性研究發(fā)現(xiàn),該蛋白可以引起真菌菌絲的改變甚至形成原生質(zhì)體?？咕腜GLa-AM1具有較強的抗菌活性,但因產(chǎn)量低,難提純等缺陷,限制了其廣泛應(yīng)用。Zhang X[18]等人將PGLa-AM1基因與家蠶蛋白基因融合,再將一個6×His的標(biāo)簽加到融合蛋白的末端,最后將融合的抗菌肽基因密碼子優(yōu)化克隆到大腸桿菌pET-30a(+)表達載體中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),其表達量高達30 mg/L?？咕氖窍忍煨悦庖呋钚晕镔|(zhì),混合不同的抗菌肽在實際應(yīng)用中具有較好的抗菌效果。WuR[19]等人混合蜂毒肽,將蜂毒肽的疏水性N端與LL37抗菌核心片段連在一起,并將其編碼的DNA序列克隆到pEt-SUMO載體上,最后在大腸桿菌體內(nèi)表達。經(jīng)IPTG誘導(dǎo),Ni-NTA裂解后,上清中SUMO-M-L可溶性蛋白含量約165 mg/L。

大腸桿菌是最早被使用也是研究最透徹的表達體系,目前仍是很多基因表達載體的首選。大腸桿菌生長迅速,易于培養(yǎng),能夠大規(guī)模表達外源基因而且成本較低。但是,其缺乏翻譯后加工修飾功能,表達產(chǎn)物常以包涵體的形式存在,復(fù)性困難。

2.2 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng) 枯草芽孢桿菌也稱枯草桿菌,是一類需氧型桿狀革蘭陽性菌。Abaecin是從蜜蜂體內(nèi)得到的一種抗菌肽,它可以提高其他物種抗菌肽對細菌的殺傷作用。為了大量提取Abaecin,Li L[20]等將Abaecin基因與煙草蝕紋病毒蛋白酶基因重組,然后將優(yōu)化重組的基因?qū)肟莶菅挎邨U菌,最終成功的獲得抗菌肽Abaecin。Ji S[21]等人將 CAM-W 、EDDIE和信號肽SacB融合基因轉(zhuǎn)移到由啟動子Pg/v控制的pDM03載體中,轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌內(nèi),形成高效表達的重組枯草芽孢桿菌WB700表達系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在成功表達的上清發(fā)酵液中Cecropin A-melittin濃度高達159 mg/L?？莶菅挎邨U菌WB700表達系統(tǒng)具有分泌胞外完整生物活性蛋白的功能,而且該系統(tǒng)可以減少分泌蛋白在體外的降解。豬抗菌肽β-defensin-2(pBD-2)和Cecropin P1(CP1)在應(yīng)激和抵御疾病方面發(fā)揮作用,Xu J[22]等人將 β-defensin-2(pBD-2)和 Cecropin P1(CP1)基因融合插入pMK4質(zhì)粒并轉(zhuǎn)移到枯草芽孢桿菌中,生成的枯草芽孢桿菌可以有效的表達融合抗菌肽,且在體外可以抵抗多種細菌的活動?？莶菅挎邨U菌表達系統(tǒng)可在短時間內(nèi)發(fā)酵,同時表達幾種蛋白,且能夠避免形成包涵體。

2.3 乳酸鏈球菌表達系統(tǒng) 乳酸鏈球菌肽也稱乳酸鏈球菌素是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的小分子多肽物質(zhì)。為了提高乳酸桿菌LS01的產(chǎn)量,Ni Z J[23]等人提出將nisRK和nisFEG基因連續(xù)融合成一個由啟動子P32控制的單一穿梭表達載體pMG36e上,用電穿孔法將重組載體導(dǎo)入細胞中。瓊脂擴散法檢測乳酸鏈球菌肽的表達并以16s核糖體RNA為對照進行定量表達分析,結(jié)果表明,在給定條件下重組表達的乳酸鏈球菌肽比原始菌株增加50%以上。

2.4 鏈霉菌表達系統(tǒng) 鏈霉菌屬于革蘭陽性菌,廣泛用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,常見于土壤及腐敗的植物中。鏈霉菌具有高效分泌胞外蛋白的能力,因此鏈霉菌在表達蛋白方面更具有獨特優(yōu)勢。糖肽類抗生素是與D-丙氨酰-D-丙氨酸具有高度親和性的七肽結(jié)構(gòu)抗生素,通過抑制細胞壁的合成而致使細菌死亡,幾乎對所有的革蘭陽性菌均有較好的抗菌活性。為了高效率的表達糖肽類抗生素,Binda E[24]等人借助pIJ86載體將重組的糖肽類抗生素基因(Glycopeptide antibiotic)轉(zhuǎn)入鏈霉菌屬中表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鏈霉菌獲得了更高的糖肽類抗生素表達量,而且與抗生素相比最小抑菌濃度較低,可以有效的抑制耐藥菌株的生長。

2.5 干酪乳桿菌表達系統(tǒng) 干酪乳桿菌是公認(rèn)的保健類腸道益生菌,在腸道內(nèi)可長期存在并誘發(fā)機體的先天性和特異性免疫反應(yīng),研究發(fā)現(xiàn)其具有表達抗菌肽的潛力。Zhang L[25]等人將合成的基因片段PR39插入pPG：612表達載體然后轉(zhuǎn)化到干酪乳桿菌393體內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn),該干酪乳桿菌不僅對大腸桿菌和沙門菌有明顯殺菌作用,且對金黃色葡萄球菌也有輕微的抑制效果。

3 展望

抗菌肽作為最具潛力的抗生素替代藥物之一,由于其商品化產(chǎn)量不能滿足市場需求,利用基因工程方法將有望實現(xiàn)這一目標(biāo)。基因工程技術(shù)表達的抗菌肽雖然在結(jié)構(gòu)上與天然的抗菌肽有所差異,但是其活性相似,甚至抗菌活性更強。但是各個系統(tǒng)又有所缺點,真核表達系統(tǒng)雖然能夠高效表達,但產(chǎn)物較復(fù)雜,不易純化且成本較高;原核表達系統(tǒng)雖然成本低,但缺乏翻譯后的加工修飾,表達產(chǎn)物大多以包涵體的形式存在。隨著抗菌機制及基因表達調(diào)控的不斷深入,相信能夠克服現(xiàn)有系統(tǒng)的種種缺陷,設(shè)計出更加高效的抗菌肽表達系統(tǒng),為畜牧業(yè)的發(fā)展和人們的健康提供更好的保障。