樊 成, 緱敬軒, 劉 義, 董文賓

(1.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院， 陜西 西安 710048； 2.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

近年來，羊乳因其獨(dú)特的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值以及作為牛乳不耐受替代物的功能被人們接受，因而受到消費(fèi)者的青睞.但是由于羊乳的泌乳期受季節(jié)性的波動影響較大，使得產(chǎn)乳量不如牛乳，故價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于牛乳而且供不應(yīng)求[1].為牟取暴利，在羊乳中摻雜使假現(xiàn)象不斷發(fā)生，尤其是在羊乳中摻入牛乳，因兩種乳的成分及形態(tài)相似性大，普通理化分析方法無法發(fā)現(xiàn)其差異，因而是亟待解決的一個質(zhì)量問題[2].

目前常用于定量檢測牛羊乳混合二元乳的方法都是以牛羊乳中蛋白質(zhì)、脂肪、DNA、維生素等為特征指標(biāo)建立的[3]，檢測方法主要有電泳(聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點(diǎn)聚焦電泳和毛細(xì)管電泳等)、高效液相色譜、質(zhì)譜技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)等[2,4-6].但是鮮乳成分較復(fù)雜，由于品種、飼養(yǎng)條件、泌乳期等諸多因素的影響，各種成分的濃度在一定范圍內(nèi)波動，而不是固定不變的[1,7]，故單一乳成分的含量作為定量檢測的依據(jù)具有一定的局限性.因此，有必要建立對乳及乳制品成分進(jìn)行綜合分析評價(jià)快速準(zhǔn)確的檢測方法.

非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)是根據(jù)化學(xué)振蕩這種非平衡非線性化學(xué)現(xiàn)象的原理建立的一種鑒別與評價(jià)復(fù)雜樣品質(zhì)的新技術(shù).化學(xué)振蕩是化學(xué)反應(yīng)系統(tǒng)的狀態(tài)(各組分濃度、電極電勢與擴(kuò)散等)隨時(shí)間周期變化的現(xiàn)象[8].目前在分析檢測中最常用的是以Belousov-Zhabotinsky反應(yīng)(簡稱B-Z反應(yīng))為基礎(chǔ)的振蕩體系[9].

在B-Z反應(yīng)體系中加入樣品后，會引起該體系在反應(yīng)過程中電位和時(shí)間的信號關(guān)系，即E-t曲線的形狀產(chǎn)生不同變化.這種形狀特征不同的E-t曲線即為該樣品的非線性化學(xué)指紋圖譜(圖1).非線性化學(xué)指紋圖譜中不僅有直觀的信息，比如波峰形狀、誘導(dǎo)曲線、波動曲線和停波曲線等，還含有許多特征參數(shù)，包括峰谷時(shí)間(tcan)、峰谷電位(Ecan)、峰頂時(shí)間(tpet)、峰頂電位(Epet)、誘導(dǎo)時(shí)間(tind)、起波電位(Euns)、停波時(shí)間(Tune)、停波電位(Eune)、平衡時(shí)間(tequ)、平衡電位(Eequ)、最大波幅(ΔEmax)、波動周期(Tund)、波動壽命(tund)和波峰數(shù)目(nwav)等[10].依據(jù)這些參數(shù)的改變量與被分析物質(zhì)濃度的關(guān)系，即可實(shí)現(xiàn)對被測物的定性定量分析[11-13].

圖1 非線性化學(xué)指紋圖譜模式圖

對于中藥及食品等成分復(fù)雜的樣品，其非線性化學(xué)指紋圖譜是樣品中所有成分共同作用的結(jié)果，同其他測定樣品中單一成分的檢測方法相比，具有整體、宏觀和模糊分析的特點(diǎn)，適用于鑒別樣品真?zhèn)蝃14,15].而且該方法不需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理和提取純化等步驟，因此該技術(shù)在食品和藥品檢測等領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速[16-21].對乳品行業(yè)長期存在的羊乳中摻雜牛乳或馬乳等其他異源乳這個難題的解決也同樣取得顯著的進(jìn)展.王二丹等[22]發(fā)現(xiàn)牛乳和羊乳的二元混合乳的非線性化學(xué)指紋圖譜參數(shù)之一誘導(dǎo)時(shí)間與二元乳中牛乳的含量呈良好的線性關(guān)系，并建立了兩者之間的線性回歸方程，該方程可用于定量測定牛乳濃度.馬永杰等[23]則利用停波時(shí)間相對于羊乳粉中摻雜牛乳粉之間的一元線性關(guān)系，通過最小二乘法建立了反應(yīng)停波時(shí)間和牛乳粉含量之間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，據(jù)此可定量測定牛羊乳粉中牛乳粉的含量.

但是非線性化學(xué)指紋圖譜中其他參數(shù)是否可用于牛羊二元乳(粉)的檢測，或者是否還有更理想的參數(shù)尚不確定.

同其他檢測方法相比，非線性化學(xué)指紋圖譜檢測技術(shù)定量檢測的優(yōu)點(diǎn)在于該圖譜是樣品中所有成分共同作用的結(jié)果，因此理想的用于定量檢測二元乳中不同來源乳的參數(shù)應(yīng)該同盡可能多的乳成分具有相關(guān)性，但目前指紋圖譜各個參數(shù)與鮮乳不同成分之間的相關(guān)性研究尚未見報(bào)道，故本研究將從非線性化學(xué)指紋圖譜諸多參數(shù)中篩選有效的能夠反映牛羊混合乳濃度變化的參數(shù)，并考察該參數(shù)與乳不同成分的相關(guān)性，建立更加靈敏可靠的混合乳定性定量檢測方法.

1 材料與方法

1.1 材料

牛乳樣品購自陜西科技大學(xué)附近養(yǎng)殖場及超市.羊乳樣品購自三原興牧乳山羊養(yǎng)殖專業(yè)合作社及附近農(nóng)戶.經(jīng)感官評定、乳成分分析儀檢測和滴定分析，感官指標(biāo)及蛋白質(zhì)、脂肪、非脂乳固形物含量和酸度等理化指標(biāo)符合國標(biāo)GB19301-2010《生乳》要求的牛乳及羊乳樣品分別為33份和32份.

1.2 主要試劑

硫酸，天津市紅碧化學(xué)試劑廠；溴酸鈉，廣州省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；丙酮，天津利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司；硫酸錳，天津市福晨化學(xué)試劑廠.以上試劑均為分析純，水為重蒸蒸餾水.

1.3 主要儀器

MZ-1B型非線性化學(xué)指紋圖譜分析儀,湖南尚泰科技有限公司;217型復(fù)合甘汞電極、213型金屬鉑電極及MT-100型乳成分測定儀，南京南分醫(yī)療生化儀器有限責(zé)任公司.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

(1)測定方法

非線性化學(xué)指紋圖譜測定方法：同馬永杰[23].

乳成分測定方法：參照MT-100型乳成分測定儀說明書.

(2)分析方法

使用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件，通過單因素方差分析，篩選出牛羊乳之間具有顯著差異的非線性化學(xué)指紋圖譜參數(shù)；通過Pearson相關(guān)性分析確定指紋圖譜參數(shù)與各種主要乳成分的相關(guān)性，通過回歸分析法確定該參數(shù)與牛羊混合二元乳含量比的數(shù)學(xué)表達(dá)式.

2 結(jié)果與討論

2.1 牛羊乳非線性指紋圖譜比較

非線性化學(xué)指紋圖譜有很強(qiáng)的特征性，不同品種的樣品都有各自不同的圖譜.羊乳和牛乳雖然主要成分相似，但是這些成分的種類和濃度仍有一定的差異，因此其非線性化學(xué)指紋圖譜雖然相似但也有一定的差異.圖2為隨機(jī)抽取的兩份牛乳和羊乳樣品的非線性化學(xué)指紋圖譜.從圖2可以直觀地看出牛乳與羊乳的指紋圖譜基本形狀相似，但是牛乳的誘導(dǎo)時(shí)間明顯比羊乳的短，在振蕩結(jié)束的后期，羊乳振蕩衰減的更快，因此圖譜的尾部相對牛乳要粗短，而牛乳圖譜的尾部相對要細(xì)長.

圖2 牛乳和羊乳非線性化學(xué)指紋圖譜比較

這些直觀的差異雖不能直接用于兩種乳的定量檢測，但是說明兩種指紋圖譜的某些參數(shù)是具有差異的.只有在兩種乳中具有差異的非線性指紋圖譜參數(shù)才可能用于檢測牛羊二元乳(粉)中兩種乳的含量，并且差異顯著的參數(shù)更易于檢測.故本研究首先篩選兩種乳的圖譜中具有差異的參數(shù).在測定65個牛羊乳樣品的非線性化學(xué)指紋圖譜基礎(chǔ)上，通過單因素方差分析比較牛乳和羊乳指紋圖譜各參數(shù)的差異顯著性，結(jié)果表明牛乳和羊乳指紋圖譜的誘導(dǎo)時(shí)間、最高電位時(shí)間具有極其顯著的差異，停波時(shí)間和最大振幅具有顯著差異，而其他參數(shù)差異不顯著，詳見表1所示.

王二丹等[22]和馬永杰等[23]分別發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)時(shí)間和停波時(shí)間與羊乳(粉)中摻入牛乳(粉)的含量具有線性關(guān)系，并確定了可用于定量測定羊乳(粉)中摻入的牛乳(粉)的含量的線性回歸方程.本研究發(fā)現(xiàn)牛乳和羊乳的誘導(dǎo)時(shí)間和停波電位分別具有極其顯著和顯著的差異.因?yàn)閮烧呔哂酗@著的差異，因此當(dāng)牛羊混合乳的混合比例發(fā)生變化時(shí)，該參數(shù)的改變才能夠很好的反映這種含量的變化.

故本實(shí)驗(yàn)也從另一個角度驗(yàn)證了通過誘導(dǎo)時(shí)間和停波時(shí)間的變化測定牛羊二元混合乳中比例變化的合理性.另外牛乳和羊乳指紋圖譜的最高時(shí)間和最大振幅分別具有極其顯著和顯著的差異，因此推測根據(jù)這兩個參數(shù)的變化也可以測定牛羊混合乳中兩者的含量.由于誘導(dǎo)時(shí)間和最高電位比停振時(shí)間和最大振幅的差異更顯著，推測這兩個參數(shù)用于兩種乳含量的檢測會更加準(zhǔn)確可靠.

表1 牛羊乳非線性化學(xué)指紋圖譜參數(shù)的單因素方差分析

注：*表示差異顯著(0.01

2.2 羊乳成分與最高電位時(shí)間的相關(guān)性分析

由于純羊乳和純牛乳指紋圖譜的最高電位時(shí)間和誘導(dǎo)時(shí)間均具有極其顯著的差異，因此本研究進(jìn)一步考察了這兩個參數(shù)與羊乳主要成分的相關(guān)性.通過測定32份羊乳樣品的主要成分，即蛋白質(zhì)、脂肪及非脂乳固形物的含量以及指紋圖譜的參數(shù)，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件中Pearson相關(guān)性分析考察乳成分與指紋圖譜參數(shù)的相關(guān)性.結(jié)果如表2和表3所示.

表2 最高電位時(shí)間與羊乳成分的Pearson相關(guān)性分析

注：** P<0.01，極顯著相關(guān).

表3 誘導(dǎo)時(shí)間與羊乳成分的Pearson相關(guān)性分析

注：*0.01

Pearson相關(guān)性分析表明最高電位時(shí)間與蛋白質(zhì)、脂肪和非脂乳固形物含量的r值分別為-0.5,0.504和-0.461，故三種主要成分與最高電位時(shí)間均具有中等強(qiáng)度的相關(guān)性，其中蛋白質(zhì)和非脂乳固形物與最高電位時(shí)間為負(fù)相關(guān)而脂肪與最高電位時(shí)間為正相關(guān)，且在0.01水平上具有極其顯著相關(guān)性.而另一個差異極其顯著的參數(shù)誘導(dǎo)時(shí)間與蛋白質(zhì)、脂肪和非脂乳固形物等也有顯著的相關(guān)性，但相關(guān)性的強(qiáng)度(r值)和顯著性(P值)均弱于最高電位時(shí)間.結(jié)果表明最高電位時(shí)間是可用于定量測定牛羊二元乳含量的最佳參數(shù).

2.3 最高電位時(shí)間與兩種乳含量的關(guān)系

由于純羊乳和純牛乳的最高電位時(shí)間具有極其顯著的差異，并且該參數(shù)與羊乳中的三種主要成分均具有相關(guān)性，因此進(jìn)一步考察不同含量比例的牛羊二元乳的最高電位時(shí)間.分別將最高電位時(shí)間最高和最低的牛奶27號和19號、羊奶11號和16號等質(zhì)量混合，作為測試用純牛奶和純羊奶，分別配制牛乳含量([Mc])與羊乳含量([Mg])的比值([Mc]/[Mg])依次為1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1共9種含量不同的二元混合奶，并測定其最高電位時(shí)間，平行測定三次，取平均值.以[Mc]/[Mg]為橫坐標(biāo)，最高電位時(shí)間為縱坐標(biāo)，做散點(diǎn)圖，如圖3所示.由圖3可見最高電位時(shí)間隨牛奶含量的增加逐漸降低，即隨羊奶含量的增加，最高電位時(shí)間在延長.但[Mc]/[Mg]與最高電位時(shí)間并未呈現(xiàn)線性關(guān)系，非線性回歸分析表明[Mc]/[Mg]與最高電位時(shí)間具有很好的對數(shù)對應(yīng)關(guān)系，所得相關(guān)指數(shù)R2值最高的回歸方程為：

tpet=-2.379ln[Mc]/[Mg]+12.258，對應(yīng)的R2為0.967 2.

圖3 牛羊二元乳中[Mc]/[Mg]與最高電位時(shí)間的回歸分析

為驗(yàn)證回歸方程的精密度和準(zhǔn)確度，從樣品中抽取牛乳及羊乳各一份，配制不同比例二元混合乳，并對比其最高電位的測量時(shí)間與和經(jīng)驗(yàn)公式擬合時(shí)間，結(jié)果如表4所示.由表4可知，該方法測得最高電位時(shí)間的平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.39，最高相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<2.1，平均相對誤差為6.65.以上結(jié)果表明該方法重復(fù)性好，不過相對誤差略偏大，但是能夠滿足一般的定性和定量測定需要.

表4 非線性指紋圖譜法測定

注：*平行測定5次，取平均值.

3 結(jié)論

為更好地利用非線性化學(xué)指紋圖譜技術(shù)測定牛羊乳二元混合乳中兩者的混合比例，本研究首次通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法從鮮乳的非線性化學(xué)指紋圖譜諸多參數(shù)中篩選出牛羊乳之間具有差異的參數(shù)指標(biāo)四項(xiàng)，其中停振時(shí)間和最大振幅具有顯著差異(0.01

Pearson相關(guān)性分析表明最高電位時(shí)間與羊乳主要成分即蛋白質(zhì)、脂肪和非脂乳固形物含量均具有相關(guān)性，且該相關(guān)性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有極其顯著的意義，因此混合乳中兩種乳源的蛋白質(zhì)、脂肪和非脂乳固形物的含量變化均能影響混合乳指紋圖譜中最高電位時(shí)間的變化，故可以采用最高電位時(shí)間表征混合乳中牛羊乳的含量.最高電位時(shí)間隨牛乳含量增加逐漸減少，而且牛羊乳含量的比值與最高電位時(shí)間具有很好的對數(shù)對應(yīng)關(guān)系，所得回歸方程和R2分別為tpet=-2.397ln[Mc]/[Mg]+12.258和0.967 2.經(jīng)檢驗(yàn)該方程合理可靠，可用于牛羊混合二元奶的定性和定量檢測.

本研究建立了根據(jù)非線性化學(xué)指紋圖譜最高電位時(shí)間確定牛羊混合二元乳中兩種乳含量的方法，該方法具有操作簡單、樣品不用預(yù)處理和分析成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，為乳品摻假提供了一個簡便可行的方法.