楊穎　彭國(guó)平　劉實(shí)　饒力群　汪啟明

摘要? ? 百合病毒病是當(dāng)前制約百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸之一，深入了解百合病毒的種類和致病的作用機(jī)制，可為百合感病種球的早發(fā)現(xiàn)、快速檢測(cè)以及百合無(wú)毒種球篩選提供支持。本文介紹了常見(jiàn)的百合致病病毒種類、病毒檢測(cè)技術(shù)以及脫毒技術(shù)等方面的研究進(jìn)展，并根據(jù)研究結(jié)果對(duì)開(kāi)發(fā)無(wú)毒百合種球的新型篩選和檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行展望，以期為促進(jìn)百合產(chǎn)業(yè)健康快速發(fā)展提供參考。

關(guān)鍵詞? ? 百合致病病毒;病毒檢測(cè)技術(shù);脫毒技術(shù)

中圖分類號(hào)? ? S436.8? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）24-0098-04? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract? ? Lily virus disease is one of the main bottlenecks restricting the development of lily industry.In-depth understanding of the type of lily virus and the action mechanism of the disease can provide support for the early detection，rapid detection of susceptible lily disease bulbs and the screening of lily-free toxic bulbs.This paper introduced the research progress of common lily pathogenic virus species，virus detection technology and detoxification technology and so on.According to the research results，the new screening and detection technologies for the development of non-toxic lily bulbs were prospected，in order to provide reference for promoting the healthy and rapid development of lily industry.

Key words? ? lily pathogenic virus;virus detection technology;detoxification technology

百合屬于單子葉植物，是百合科百合屬多年生草本球根類植物，其繁殖方式為無(wú)性繁殖和有性繁殖，原產(chǎn)于中國(guó)，喜涼爽，較耐寒，在高溫地區(qū)則生長(zhǎng)不良，現(xiàn)主要分布于亞洲東部、歐洲、北美洲等北半球溫帶地區(qū)，國(guó)內(nèi)則主產(chǎn)于湖南、河南、四川、浙江和江蘇等地。在全球范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)至少120個(gè)品種，其中有55個(gè)品種產(chǎn)于中國(guó)，百合鱗莖的淀粉含量豐富，具有極高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值;此外，由于百合花色種類豐富、花型和植株極具特色，也具有重要的觀賞價(jià)值。20世紀(jì)40年代，百合病毒被發(fā)現(xiàn)，至今已成為危害百合種球生產(chǎn)和鮮切花品質(zhì)的世界性危害[1]。多年來(lái)，對(duì)于百合病毒的研究一直停留在病原學(xué)、病害流行學(xué)和病毒檢測(cè)技術(shù)的層面上。然而，近年來(lái)隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)植物病毒的研究也進(jìn)入到分子水平，運(yùn)用了分子生物學(xué)、基因工程和生物信息學(xué)等手段，并取得了一定的成果。Cohen等[2]首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化百合，是百合抗病毒由脫毒組培技術(shù)向基因工程發(fā)展的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。目前，在全球范圍內(nèi)已有超過(guò)15種不同的病毒被報(bào)道[3-4]。本文對(duì)常見(jiàn)的百合病毒進(jìn)行了系統(tǒng)介紹。

1? ? 百合常見(jiàn)病毒

1.1? ? 百合斑駁病毒（LMoV）

LMoV病毒是一個(gè)寬11～15 nm、長(zhǎng)680～900 nm的彎曲、無(wú)包膜、棒狀結(jié)構(gòu)[5]，為危害百合種球質(zhì)量的主要病毒之一，屬于馬鈴薯Y病毒屬的Potyvirus成員[6]。感染了LMoV病毒的百合植株會(huì)有葉片斑駁的現(xiàn)象，深綠色和淺綠色互相鑲嵌出現(xiàn)于葉片上，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)紅褐色壞死斑，感染植株的葉片會(huì)萎黃、卷曲和變窄，導(dǎo)致花變形甚至不開(kāi)放[6-8]。這些癥狀可能非常輕微或在植物早期生長(zhǎng)階段無(wú)法被發(fā)現(xiàn)。

1.2? ? 百合無(wú)癥病毒（LSV）

LSV病毒是一個(gè)長(zhǎng)度為640 nm、直徑為17～18 nm的絲狀粒子結(jié)構(gòu)[5]。單獨(dú)感染了LSV病毒的百合植株并無(wú)明顯的患病癥狀[9]，寄主一般表現(xiàn)為隱癥狀[10]，但連續(xù)栽種患病球根會(huì)導(dǎo)致百合種球退化，從而造成感染植株只有較短的生長(zhǎng)周期;產(chǎn)生的花粉粒較小，在嚴(yán)重情況下花蕾畸形或不開(kāi)花[11];鱗莖逐年變小，球莖的產(chǎn)量明顯降低。如與其他病毒共同感染時(shí)，葉片出現(xiàn)壞死斑、畸形、葉脈突出等癥狀[10]。在我國(guó)江南、江北均有發(fā)現(xiàn)，尤其以廈門的感染情況最嚴(yán)重。

1.3? ? 黃瓜花葉病毒（CMV）

CMV病毒是寄主范圍最廣泛的植物病毒，它可以感染超過(guò)1 000種植物[5]。CMV病毒一般為潛隱性侵染[12]，常常與LSV病毒一起對(duì)百合植株進(jìn)行復(fù)合感染。感染植株一般表現(xiàn)為葉片褪綠或葉脈黃化，花出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，葉片皺縮甚至畸形，植株矮小。主要分布于中國(guó)臺(tái)灣、德國(guó)、英國(guó)、愛(ài)爾蘭、瑞典、俄羅斯、日本、韓國(guó)、印度等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。

1.4? ? 南芥菜花葉病毒 （ArMV）

在自然環(huán)境下，該病毒主要通過(guò)汁液摩擦接種以及種苗、塊莖等無(wú)性繁殖材料進(jìn)行傳播，也可以通過(guò)介體線蟲(chóng)傳播，并且傳播范圍廣，現(xiàn)已報(bào)道的可侵染植物約有174屬215種[13]。感染植株一般表現(xiàn)為百合花和葉褪綠及黃化，葉片皺縮甚至壞死，植株矮小。主要分布于加拿大、美國(guó)、日本、歐洲地區(qū)、南非、澳大利亞和新西蘭等國(guó)家和地區(qū)，是我國(guó)重要的進(jìn)境植物檢疫性有害生物之一[14]。

1.5? ? 草莓潛隱環(huán)斑病毒（SLRSV）

SLRSV能侵染種子、種球、塊莖和苗木等，還可隨無(wú)性繁殖材料的貿(mào)易進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。在一些感病植株上，可引起葉片斑駁癥狀，導(dǎo)致品種生長(zhǎng)衰退和百合球莖品質(zhì)、產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失。我國(guó)目前尚未見(jiàn)其發(fā)生危害的記錄，同時(shí)也是我國(guó)對(duì)外檢疫性有害生物之一[15]。

2? ? 病毒檢測(cè)技術(shù)

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測(cè)致病病毒的手段也在不斷增加和創(chuàng)新，目前主要有生物學(xué)檢測(cè)法、電子顯微鏡檢測(cè)法、血清學(xué)檢測(cè)方法、分子生物學(xué)檢測(cè)方法四大類病毒檢測(cè)技術(shù)[16]。

2.1? ? 生物學(xué)檢測(cè)法

生物學(xué)檢測(cè)法又稱為指示植物檢測(cè)法。每一種植物病毒都有其特定的指示植物或鑒別寄主，在感染了某一種病毒后，指示植物或鑒別寄主就會(huì)出現(xiàn)特定的感染癥狀。根據(jù)這一特性，通過(guò)人為的摩擦接種，把含有待測(cè)病毒的汁液涂抹至指示植物或鑒別植物上，觀察植株產(chǎn)生的病癥，可以初步判斷出病毒種類[17]。生物學(xué)檢測(cè)法具有操作簡(jiǎn)便、不需要貴重的設(shè)備和儀器、成本較低、試驗(yàn)結(jié)果的直觀性高等特點(diǎn)。但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，易受氣候變化、毒蟲(chóng)體傳染等外界環(huán)境的影響，從而導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差。在培養(yǎng)指示植物時(shí)需要提供相同的生活條件以保證有相同的長(zhǎng)勢(shì)，需要較大的工作量，而且有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)“一病多癥”和“一癥多病”[18]的現(xiàn)象。因此，該方法在目前的檢測(cè)中應(yīng)用較少。

2.2? ? 電子顯微鏡檢測(cè)法

自1939年Kausche首次利用電子顯微鏡觀察到煙草花葉病毒的長(zhǎng)形病毒粒子以來(lái)，電子顯微鏡檢測(cè)法進(jìn)入到植物病毒技術(shù)領(lǐng)域。通過(guò)電子顯微鏡能夠觀察到植物病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、大小及病毒的增殖，從而鑒定出病毒種類。常用的試驗(yàn)方法有超薄切片法、負(fù)染色電鏡法、免疫電鏡技術(shù)和膠體金免疫電鏡等[19]。電鏡檢測(cè)法的觀測(cè)結(jié)果直觀、準(zhǔn)確、靈敏性高，但由于試驗(yàn)儀器和設(shè)備昂貴，制片步驟和操作技術(shù)復(fù)雜，對(duì)試驗(yàn)人員的技術(shù)水平要求較高，故未能廣泛應(yīng)用于植物病毒檢測(cè)中。

2.3? ? 血清學(xué)檢測(cè)方法

血清學(xué)檢測(cè)法的原理是根據(jù)抗原和抗體特異性結(jié)合反應(yīng)來(lái)判斷病毒種類，利用該方法檢測(cè)植物病毒具有高效、靈敏、直觀等優(yōu)點(diǎn)，但是檢測(cè)結(jié)果與抗血清品質(zhì)有著很大的聯(lián)系，且沒(méi)有辦法檢測(cè)類病毒或結(jié)構(gòu)易變的病毒。血清學(xué)檢測(cè)法主要包括了酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、組織印記法（TBI-A）、圓點(diǎn)免疫結(jié)合法（DBIA）。

2.3.1? ? 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。酶聯(lián)免疫吸附法是指將抗原或抗體固定在酶聯(lián)板，抗原或抗體與某種酶連接，兩者結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合體[16]，加入酶反應(yīng)的底物后在酶聯(lián)板上產(chǎn)生有色產(chǎn)物，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺可以進(jìn)行定性或定量分析。其是最常用的一種植物病毒檢測(cè)方法。

2.3.2? ? 圓點(diǎn)免疫結(jié)合法（dot-immunoBinding assay，dBIA）。該方法是對(duì)ELISA檢測(cè)法的改進(jìn)，以硝酸纖維素膜代替酶聯(lián)板[19]。DBIA檢測(cè)法保持了ELISA檢測(cè)法的靈敏性和特異性，還減少了待檢樣品的用量，反應(yīng)結(jié)果更加直觀明顯，使檢測(cè)更加簡(jiǎn)便、高速和經(jīng)濟(jì)。

2.3.3? ? 組織印記法（tissue blot-ELISA，TBIA）。TBIA檢測(cè)法的原理和ELISA檢測(cè)法相似且檢測(cè)結(jié)果具有相同的可靠性。TBIA檢測(cè)法中用硝酸纖維素膜和尼龍膜代替了酶聯(lián)板[16]，比ELISA檢測(cè)法具有更高的效率、靈敏度、方便性和更低的成本等特點(diǎn)。

2.3.4? ? 增強(qiáng)發(fā)光酶免疫技術(shù)（enhanced luminescence enzyme immunoassay，ELEIA）。ELEIA檢測(cè)法是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合的一項(xiàng)綜合技術(shù)。與ELISA檢測(cè)法相比，ELEIA檢測(cè)法是以電信號(hào)的變化來(lái)代替酶催化底物的產(chǎn)物顏色變化，檢測(cè)靈敏度較高，檢測(cè)對(duì)象的范圍更寬，但缺點(diǎn)是在臨床檢測(cè)中容易受到一些電化學(xué)活性物質(zhì)的干擾和影響。

2.3.5? ? 免疫熒光技術(shù)。免疫熒光技術(shù)由熒光抗體技術(shù)和熒光抗原技術(shù)組成[16]，依據(jù)的原理為抗原抗體特異性結(jié)合。該技術(shù)應(yīng)用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體，試驗(yàn)中常用的熒光素為異硫氰酸熒光素（FITC）和四乙基羅丹明（BRZOO），在紫外光的照射下可觀察到發(fā)出的熒光，這樣便可檢測(cè)出病毒種類及其在植株體內(nèi)分布的情況[18]。此檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高。非特異性熒光染色少，缺點(diǎn)是敏感性偏低，而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。

2.3.6? ? 免疫膠體金技術(shù)。膠體金又稱為金溶膠，是金鹽在還原劑（如檸檬酸三鈉）的作用下還原成金后所形成的大小均勻的金顆粒懸浮液，在靜電作用下形成了穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，是一種應(yīng)用于抗原抗體的新型免疫標(biāo)記技術(shù)[20]，分為免疫層析法和快速免疫金滲濾法，將膠體金作為示蹤標(biāo)志物，可用于高通量檢測(cè)的雙重或多重標(biāo)記。該檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、無(wú)污染和無(wú)特殊儀器設(shè)備的需求等優(yōu)點(diǎn)，適合田間快速診斷與口岸檢疫[21]。

2.4? ? 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

2.4.1? ? 核酸分子雜交技術(shù)。依據(jù)核苷酸單鏈互補(bǔ)原理，用放射性同位素或非放射性地高辛等標(biāo)記病毒，制作成DNA探針或RNA探針[18]，再將探針與待測(cè)樣品植物的核酸雜交。如2條核苷酸鏈成功互補(bǔ)則雜交雙鏈就會(huì)帶有放射性，從而檢測(cè)出病毒種類。此檢測(cè)方法的缺點(diǎn)是放射性同位素對(duì)環(huán)境會(huì)造成污染[16]。

2.4.2? ? 雙鏈RNA電泳技術(shù)。在大多數(shù)植物中，RNA以單鏈的形式存在，只有在感染了病毒的情況下才會(huì)復(fù)制產(chǎn)生ssRNA的特異復(fù)制中間型dsRNA[22]，即雙鏈RNA。因此，通過(guò)分離和分析dsRNA的存在[23]，可以推斷出植株是否感染了RNA病毒或類病毒。此檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，所需的設(shè)備儀器較常見(jiàn)，一般實(shí)驗(yàn)室都可采用該檢測(cè)方法。

2.4.3? ? 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)。①PCR和逆轉(zhuǎn)錄PCR。PCR反應(yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR技術(shù)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，由高溫變性、低溫退火和中溫延伸3個(gè)步驟構(gòu)成。但由于大多數(shù)植物病毒為RNA病毒，因而在PCR之前需要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，將植物的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA[24]，然后才能進(jìn)行常規(guī)PCR技術(shù)。此檢測(cè)方法有著靈敏度高、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)[25]，以熒光化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，結(jié)合了熒光檢測(cè)和逆轉(zhuǎn)錄PCR 2種技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)內(nèi)參或外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定 DNA序列進(jìn)行定量分析，實(shí)現(xiàn)了從常規(guī)PCR技術(shù)的定性檢測(cè)到定量檢測(cè)的跨越。因?yàn)閝RT-PCR技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)受到樣本的影響，所以需選擇穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。此方法檢測(cè)時(shí)間比常規(guī)PCR更短，需要的靶基因濃度更小。雖然該方法的儀器設(shè)備昂貴，但因?yàn)椴恍枰M(jìn)行凝膠電泳，對(duì)環(huán)境的污染較小，所以實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已越來(lái)越多地被運(yùn)用到植物病毒檢測(cè)中。③巢式PCR。巢式PCR是一種變異的PCR，使用2對(duì)PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第1對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第2對(duì)引物稱為巢式引物結(jié)合在第1次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使第2次PCR擴(kuò)增片段短于第1次擴(kuò)增。因此，此檢測(cè)方法可用于病毒含量低、靶基因不穩(wěn)定和擴(kuò)增產(chǎn)物少而不能進(jìn)行電泳檢查的感染植株[16]。④多重PCR。多重PCR，又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在同一PCR反應(yīng)體系里加上2對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)模板或同一模板的多個(gè)不同核酸片段的PCR反應(yīng)技術(shù)[19]，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與一般PCR相同。該檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)是高效，檢測(cè)時(shí)間比ELISA檢測(cè)法短，且靈敏度更高，具有更高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[26]。

2.4.4? ? 核酸依賴性擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)。其是一種以RNA模板進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增并能實(shí)時(shí)觀測(cè)結(jié)果的檢測(cè)方法[16]。依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)，是一種擴(kuò)增RNA的新技術(shù)，是由一對(duì)特異引物介導(dǎo)的、連續(xù)均一的、體外特異核苷酸序列等溫?cái)U(kuò)增的酶促反應(yīng)過(guò)程。此檢測(cè)方法不需依靠昂貴的設(shè)備儀器，可檢測(cè)RNA病毒和類病毒，同時(shí)模板中的DNA在檢測(cè)室并不會(huì)對(duì)待測(cè)樣品RNA病毒有所干擾，有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、不易被污染等優(yōu)點(diǎn)。該法已被廣泛運(yùn)用于植物病毒檢測(cè)中。

2.4.5? ? 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。LAMP法是針對(duì)靶基因上的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條引物，利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，109～1010的擴(kuò)增可在15～60 min內(nèi)完成，反應(yīng)能產(chǎn)生大量擴(kuò)增產(chǎn)物——焦磷酸鎂白色沉淀，可以通過(guò)肉眼觀察白色沉淀的有無(wú)來(lái)判斷靶基因是否存在[27]。此檢測(cè)方法對(duì)儀器設(shè)備的要求較低，具有操作簡(jiǎn)便、高效、高靈敏性和高特異性的特點(diǎn)，是一種適合現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的快速檢測(cè)方法。

3? ? 病毒脫毒技術(shù)

1962年P(guān)hillips最早開(kāi)展百合脫毒研究，利用百合莖尖培養(yǎng)技術(shù)成功脫毒[28];1966年Mori和Hamaya采用莖尖脫毒技術(shù)成功培養(yǎng)出無(wú)毒百合植株[29];在國(guó)內(nèi)，李進(jìn)通過(guò)莖尖脫毒技術(shù)培養(yǎng)出宜興百合脫毒組培苗[30]。

經(jīng)過(guò)不同的檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)出病毒類型后，需利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行百合脫毒處理，篩選出適合工廠大批量生產(chǎn)的百合種球。先對(duì)獲得的脫毒株系進(jìn)行病毒檢測(cè)，隨后利用快速繁殖技術(shù)提高百合繁殖系數(shù)，為未來(lái)百合無(wú)毒種球的長(zhǎng)期應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[31]。

3.1? ? 愈傷組織培養(yǎng)

愈傷組織培養(yǎng)所依據(jù)的原理是愈傷組織內(nèi)病毒的復(fù)制速度遠(yuǎn)慢于細(xì)胞的分裂增殖速度，又或在分裂過(guò)程中其中一些細(xì)胞突變獲得了抗病能力[32]。將百合植株的莖尖或鱗葉等外植體誘導(dǎo)成愈傷組織，進(jìn)而培養(yǎng)成無(wú)毒試管苗，最后培育成完整的再生植株。但此方法的脫毒率為31.7%～46.7%，總體脫毒率偏低[33];此外，在愈傷組織長(zhǎng)期無(wú)性繁殖培育過(guò)程中受到很多外界因素的刺激和影響，容易發(fā)生體細(xì)胞無(wú)性系變異，這種變異是不定向的，而無(wú)性繁殖的植物需保持優(yōu)良性狀，因而暫時(shí)不適合作為有效的脫毒途徑[33]。該方法具有可行性高、試驗(yàn)周期較短、一次性成苗數(shù)較多的優(yōu)點(diǎn)，在今后仍有研究和發(fā)展的價(jià)值和空間。

3.2? ? 莖尖培養(yǎng)

莖尖培養(yǎng)所依據(jù)的原理是病毒在植株體內(nèi)的不均勻分布，較老的組織和器官中病毒含量高，未成熟或幼嫩的組織和器官中病毒含量低，莖尖組織則為較幼嫩的部分[34]。因?yàn)椴《驹谥参矬w內(nèi)依靠維管束進(jìn)行轉(zhuǎn)移，而莖尖分生組織沒(méi)有維管束，所以只能通過(guò)胞間連絲進(jìn)行轉(zhuǎn)移，且病毒的轉(zhuǎn)移速度比細(xì)胞分裂和組織生長(zhǎng)的速度慢[35]，因而莖尖一般只含有微量或不含有病毒。因此，植物莖尖的無(wú)毒生長(zhǎng)點(diǎn)培養(yǎng)成為了脫毒復(fù)壯的一個(gè)重要方法。

3.3? ? 珠芽培養(yǎng)

珠芽培養(yǎng)是將百合的外部鱗片剝?nèi)?，留下帶有葉原基的珠芽生長(zhǎng)點(diǎn)[34]，用無(wú)菌水沖洗數(shù)次后再剝?nèi)ゲ糠秩~原基余下1～2個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)[35]，將其切成小段后進(jìn)行離體培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)脫分化成愈傷組織再分化，可以培養(yǎng)出成功脫毒的百合幼苗植株。

3.4? ? 化學(xué)處理

在外植體培養(yǎng)過(guò)程中加入病毒抑制劑[36]，抑制病毒的合成、增殖和移動(dòng)[37]，來(lái)達(dá)到脫毒的目的，常使用孔雀綠、硫尿嘧啶、8-氮鳥(niǎo)嘌呤、病毒唑等抗病毒藥劑[37]。同時(shí)，在百合生產(chǎn)中可用植物油、礦物油、殺蟲(chóng)劑和外激素噴灑以控制百合病毒在植株間的蔓延，也可以用礦物油和擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑混合物噴灑植株，控制通過(guò)百合蚜蟲(chóng)傳播的LMoV和LSV[35]。但是，在百合脫毒技術(shù)中較少單獨(dú)運(yùn)用化學(xué)處理，一般與莖尖培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合進(jìn)行脫毒，這樣可使植株有更高的存活率和脫毒率[34]。

3.5? ? 熱處理

熱處理的原理是在高溫條件下病毒會(huì)鈍化，其繁殖速度明顯減弱甚至不進(jìn)行復(fù)制繁殖，在寄主體內(nèi)的傳播變慢或停止傳播[34]。將植物在高溫條件下進(jìn)行培育，其嫩梢不含有病毒，且植物的脫毒率和存活率與培養(yǎng)溫度的高低和時(shí)長(zhǎng)有密切關(guān)系[38]。

3.6? ? 超低溫療法

研究發(fā)現(xiàn)，植物在超低溫條件下保存，其植株體內(nèi)的病毒含量會(huì)明顯降低，甚至部分材料不含病毒。此方法所依據(jù)的原理是含有病毒的頂端細(xì)胞中含有大量水分，在超低溫（-80 ℃以下）的情況下胞內(nèi)水分變成結(jié)晶水從而致死，但分生組織的細(xì)胞含水量少，細(xì)胞質(zhì)濃，在超低溫情況下不易致死[32]，可將經(jīng)超低溫處理過(guò)的莖尖進(jìn)行增殖培養(yǎng)，故該方法可作為植物脫毒的一項(xiàng)技術(shù)?，F(xiàn)有研究表明，經(jīng)過(guò)1 h超低溫處理的百合莖尖所培育出的新苗脫毒率超過(guò)90%[39]。超低溫療法脫毒技術(shù)的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、高效、可行性高、脫毒率高。

使用單一的脫毒技術(shù)處理百合植株難以完全脫除病毒，使脫毒率較低。2種或3種技術(shù)相結(jié)合可使脫毒率顯著提升，脫毒技術(shù)綜合處理成為了百合無(wú)毒化生產(chǎn)的首選[40]。

4? ? 展望

隨著科技的發(fā)展和創(chuàng)新，植物病毒病檢測(cè)技術(shù)正在逐漸進(jìn)入分子層面，并且朝著快速、高敏感性、高特異性和高通量并行性及自動(dòng)化的方向發(fā)展[18]，使無(wú)毒種球能在早期被快速鑒定，但是該技術(shù)與美國(guó)、荷蘭和日本等百合鮮切花技術(shù)發(fā)展較先進(jìn)的國(guó)家相比仍存在差距。在百合種植時(shí)缺乏有效、系統(tǒng)和嚴(yán)格的植株病毒檢疫控制，導(dǎo)致在經(jīng)過(guò)多代單性繁殖后植物體內(nèi)逐漸積累病毒，百合出現(xiàn)患病癥狀并在植株間蔓延，嚴(yán)重影響了百合種植及產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[41]。

根據(jù)當(dāng)今百合種植業(yè)的需求，超低溫療法是百合脫毒技術(shù)中較優(yōu)先的選擇，該技術(shù)不依靠昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的技術(shù)，能夠高效、簡(jiǎn)便地培養(yǎng)出百合脫毒種球。探索出最適的處理溫度是目前的一個(gè)研究方向，同時(shí)如何做到利用分子層面的病毒檢測(cè)技術(shù)在早期將無(wú)毒種球準(zhǔn)確地鑒定出來(lái)也是科研工作者需要發(fā)展和完善的問(wèn)題。

5? ? 參考文獻(xiàn)

[1] BRIERLEY P，SMITH F F.Studies on lily virus diseases：the neerotic-fleck complex in lilium longiflorum[J].Phytopathology，1944，34（6）：529-555.

[2] COHEN A，MEREDITH C P.Agrobacterium-mediated transformation of Lilium[C].VI International Symposium on Flower Bulbs，1992，5：611-618.

[3] 徐品三，冀文婕，張鄭瑤，等.百合病毒編碼蛋白及抗病性研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（8）：97-101.

[4] 梁巧蘭，魏列新，徐秉良.侵染觀賞百合病毒寄主范圍研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008（4）：94-96.

[5] ZHANG Y B，WANG Y J，XIE Z K，et al.Simultaneous detection of three lily viruses using Triplex IC-RT-PCR[J].Journal of Virological Methods，2017，249：69-75.

[6] 徐品三，孫冰輪，姜旭，等.百合斑駁病毒大連分離物基因組全序列測(cè)定及其分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，28（增刊1）：12-15.

[7] 徐品三，宋炯，張鄭瑤.百合斑駁病毒外殼蛋白基因原核表達(dá)、抗血清制備及其應(yīng)用[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2017，44（4）：630-635.

[8] 李月月，孫健，譚冠林，等.百合斑駁病毒云南分離物全基因組序列分析及CP結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[J].植物病理學(xué)報(bào)，2018，48（2）：187-194.

[9] 徐品三，賈娟，孫冰輪，等.百合無(wú)癥病毒對(duì)百合光合生理、酶活性及葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響[J].植物病理學(xué)報(bào)，2014，44（4）：387-392.

[10] 蔣輝，源朝政，陳海霞.龍山卷丹百合無(wú)癥病毒的檢測(cè)[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，20（5）：27-30.

[11] 張健如，趙忠，趙建華.百合無(wú)癥狀病毒的鑒定與預(yù)防[J].上海農(nóng)業(yè)科技，1983（6）：23.

[12] 王成龍，源朝政，陳海霞，等.龍山卷丹百合黃瓜花葉病毒的檢測(cè)[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，21（5）：15-18.

[13] 粟智平，楊益娥，鄧叢良，等.半巢式RT-Realtime PCR檢測(cè)南芥菜花葉病毒[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015（18）：145-147.

[14] 吳東妮，陳舜勝，楊翠云，等.南芥菜花葉病毒高靈敏度檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（5）：74-78.

[15] 于翠，楊翠云，周國(guó)粱，等.進(jìn)境百合種球上草莓潛隱環(huán)斑病毒的檢測(cè)方法[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2008（4）：381-382.

[16] 陶源，吳興泉.植物病毒檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].分子植物育種，2017，15（7）：2901-2906.

[17] 陳進(jìn).百合病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].濰坊工程職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，29（3）：102-105.

[18] 張偉，徐碩，陳德鑫.常用植物病毒病檢測(cè)技術(shù)比較[J].南方農(nóng)業(yè)，2013，7（12）：24-28.

[19] 劉曉榮，王志剛，張惠華，等.百合病毒檢測(cè)研究進(jìn)展[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（3）：49-51.

[20] 武晉慧，孟利.免疫膠體金技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2019，35（13）：146-151.

[21] 張京宣，曹秀芬，宋濤，等.植物病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展分析[J].北京農(nóng)業(yè)，2011（30）：79-80.

[22] 源朝政，陳海霞，呂長(zhǎng)平，等.百合病毒病檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（9）：77-80.

[23] 葉華智，伍光慶，冷懷瓊.應(yīng)用分析雙鏈RNA技術(shù)診斷蘋果潛隱性病毒病[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1991（2）：195-199.

[24] 賈慧，王進(jìn)忠，陳忠斌，等.百合病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004（4）：73-76.

[25] 陳敏敏，張茹佳，查倩，等.百合體胚誘導(dǎo)、發(fā)育及不同組織實(shí)時(shí)定量PCR內(nèi)參基因篩選[J].分子植物育種，2018，16（15）：4982-4990.

[26] 徐榕雪，明軍，穆鼎，等.百合三種病毒的多重RT-PCR檢測(cè)[J].園藝學(xué)報(bào)，2007（2）：443-448.

[27] SHAILESH PANDURANG GAWANDE，RAGHAVENDRA K P，DILIP MONGA，et al.Rapid detection of tobacco streak virus（TSV）in cotton（Gossypium hirsutum）based on reverse transcription loop mediated iso-thermal amplification（RT-LAMP）[J].Journal of Virological Methods，2019，270：21-25.

[28] 張藝萍，屈云慧，王祥寧，等.提高百合莖尖組織培養(yǎng)脫毒效率研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（1）：37-38.

[29] BHOJWANI S S，RAZDAN M K.Plant tissue culture：theory and pract-ice[M].New York：Elsevier Science Publishing Company INC，1983：287-313.

[30] 李進(jìn)，顧繪，胡桂華，等.宜興百合脫毒組培苗培養(yǎng)技術(shù)[J].蔬菜，2000（1）：27.

[31] 王海新，安玉明，石峰.百合種球脫病毒試驗(yàn)研究[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（3）：28-30.

[32] 遲惠榮，毛碧增.植物病毒檢測(cè)及脫毒方法的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2017，33（8）：26-33.

[33] 胡新穎，楊迎東，顏津?qū)?，?百合種球脫毒技術(shù)研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（4）：6-8.

[34] 王麗花，王繼華，瞿素萍，等.百合病毒脫毒及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（6）：673-677.

[35] 張藝萍，屈云慧，熊麗，等.百合脫毒技術(shù)研究進(jìn)展[J].南方農(nóng)業(yè)（園林花卉版），2007（2）：22-24.

[36] 李益鋒，肖君澤，鄧建平，等.龍牙百合快速繁殖與脫毒研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（16）：4804-4805.

[37] 楊柏云，羅麗萍，高蔭榆.龍牙百合脫毒技術(shù)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（6）：2309-2310.

[38] 豐先紅，李健，羅孝貴.百合病毒脫除技術(shù)研究進(jìn)展[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2015，5（9）：91-95.

[39] 袁從兵.龍牙百合快速繁殖與脫毒分析[J].南方農(nóng)業(yè)，2016，10（3）：6-7.

[40] 王超，王文和，趙祥云，等.百合病毒脫除技術(shù)研究[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，27（4）：25-28.

[41] 鄭麗娜，刁義維，吳沙沙，等.百合無(wú)毒化種球繁育關(guān)鍵技術(shù)[J].分子植物育種，2009，7（6）：1245-1253.