邵志勇 楊文海 龔萍 何斌 吳利軍 陳潔 陳夏冰

摘要：以蛋雞品種北農(nóng)1號(hào)為研究對(duì)象，在飼料中添加中草藥（B組）、中草藥+益生菌（C組），通過高通量測序分析蛋雞腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，并比較產(chǎn)蛋率。結(jié)果表明，添喂中藥的產(chǎn)蛋雞腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有明顯變化，細(xì)菌多樣性與不添加組比明顯降低，C組差異顯著;腸球菌屬、芽孢桿菌屬和梭菌屬微生物豐度均顯著增加，腸球菌屬豐度增加最為明顯;擬桿菌屬微生物豐度明顯降低。B組和C組的產(chǎn)蛋率均有明顯提高?？梢娭胁菟幒鸵嫔筛纳颇c道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸球菌屬在蛋雞腸道中定殖，有效提高蛋雞的生產(chǎn)性能。

關(guān)鍵詞：蛋雞;中草藥;益生菌;腸道群落結(jié)構(gòu);產(chǎn)蛋率

中圖分類號(hào)：S831.4? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）23-0145-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.035? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Chinese herbal medicine on intestinal microbial diversity

and egg production rate of laying hens

SHAO Zhi-yong，YANG Wen-hai，GONG Ping，HE Bin，WU Li-jun，CHEN Jie，CHEN Xia-bing

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430083，China）

Abstract： Taking the laying hen variety Beinong No.1 as the research object， Chinese herbal medicine （group B）， Chinese herbal medicine + probiotics （group C） were added to the feed， and the bacterial community structure changes of the laying hens were analyzed by high-throughput sequencing， and the egg production rate were compared. The results showed that the intestinal bacterial community structure of laying hens fed with traditional Chinese medicine had obvious changes， and the ratio of bacterial diversity to non-added group was significantly lower， and the difference of group C was significant. The abundances of Enterococcus， Bacillus and Clostridium were significantly increased， and the abundance of Enterococcus was the most obvious. The abundance of Bacteroides was significantly reduced. The egg production rate of group B and group C was significantly improved. It can be seen that Chinese herbal medicine and probiotics can improve the intestinal bacterial community structure， promote the colonization of Enterococcus in the intestines of laying hens， and effectively improve the production performance of laying hens.

Key words： laying hen; Chinese herbal medicine; probiotics; intestinal microbial community structure; egg production rate

在規(guī)?；B(yǎng)殖中，抗生素被大量使用?？股貫E用問題越來越受到人們的關(guān)注，替代物的研究越來越多。

益生菌是可有效改善動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境，提高畜禽的抗病性、免疫力，提高生產(chǎn)性能，能替代抗生素的一種微生態(tài)制劑[1，2]。應(yīng)用在畜禽養(yǎng)殖中的益生菌有芽孢桿菌類[3]（枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌等）、乳酸菌類[4]（植物乳桿菌、乳酸乳桿菌、乳酸片球菌、雙歧桿菌）、丁酸梭菌[5]和酵母類[6]（釀酒酵母、假絲酵母）等。這些益生菌可有效改善腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，促進(jìn)有益菌的生長，提高畜禽的生產(chǎn)性能和免疫力[7-9]。

中國是中草藥的發(fā)源地，中草藥在畜牧業(yè)中的運(yùn)用受到研究者的重視。中草藥、藥渣等均可作為飼料添加劑用于畜禽養(yǎng)殖，其作用可分為抗菌[10]、提高免疫力[11]、提高抗應(yīng)激能力[12，13]、提高生產(chǎn)性能[14]、提高繁殖能力[15，16]、提高肉質(zhì)[17，18]等。

本研究以北農(nóng)1號(hào)蛋雞為研究對(duì)象，在常規(guī)飼料中添加中草藥和益生菌，研究其對(duì)蛋雞腸道細(xì)菌群落和生產(chǎn)性能的影響。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

蛋雞：北農(nóng)1號(hào)。

常規(guī)蛋雞飼料：成分為玉米、小麥、麩皮、魚粉、豆粕、花生粕、磷酸氫鈣、石粉、復(fù)合維生素、蛋氨酸。

中草藥飼料：馬齒莧、生石膏、白頭翁、黃柏4種中草藥干燥粉碎后，過120目標(biāo)準(zhǔn)篩，然后按1∶1∶1∶1混合均勻。每噸常規(guī)蛋雞飼料添加10 kg。

中草藥+益生菌飼料：4種菌粉規(guī)格分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）10億/g;地衣芽孢桿菌（Bacillus Licheniformis）10億/g;糞腸球菌（Enterococcus Faecalis）2億/g;乳酸片球菌（Pediococcus Acidilactici）2億/g，按1∶1∶1∶1混合均勻，添加到中草藥飼料中，每噸添加1 kg。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 飼養(yǎng)? 將蛋雞分為3組，A組為飼喂常規(guī)蛋雞飼料的對(duì)照組，B組飼喂中草藥飼料，C組飼喂中草藥+益生菌飼料，每組100只。蛋雞在產(chǎn)蛋之前，一直飼喂常規(guī)飼料，從產(chǎn)蛋期開始（18周），B組和C組分別飼喂中草藥飼料和中草藥+益生菌飼料，對(duì)照組（A）保持不變。

1.2.2? 微生物測序? 飼養(yǎng)到27周時(shí)，取3組的糞便3個(gè)重復(fù)共9個(gè)樣品作為高通量測序的樣品。提取總DNA后，送上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行細(xì)菌的高通量測序。選用250 bp細(xì)菌16S rRNA高度可變V4區(qū)測序。PCR 擴(kuò)增16S rDNA V4區(qū)特異性引物為520F（5-barcode+AYTGGGYDTAAAGNG-3）、802R（5-TACNVGGGTATCTAATCC-3）。

1.2.3? 產(chǎn)蛋率測定? 按常規(guī)方法統(tǒng)計(jì)3個(gè)組在20、27、34、41周的產(chǎn)蛋率。

1.2.4? 統(tǒng)計(jì)分析? 通過QIIME計(jì)算菌群相對(duì)豐度和α多樣性。取評(píng)估指數(shù)包括ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)。ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)用于計(jì)算評(píng)估菌群相對(duì)豐度，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)用于計(jì)算評(píng)估菌群多樣性。通過Shannon指數(shù)評(píng)估每個(gè)樣品微生物群落的生態(tài)多樣性。在門和屬2個(gè)分類水平上統(tǒng)計(jì)樣品的物種相對(duì)豐度和多樣性，對(duì)所取得OTUs數(shù)進(jìn)行微生物豐度分析，利用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析，將不同種類的主要細(xì)菌，在門、屬水平進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2? 結(jié)果與分析

2.1? α多樣性指數(shù)

所有樣品均得到覆蓋深度極深的測序數(shù)據(jù)。9個(gè)樣品共獲得352 221條高質(zhì)量細(xì)菌序列用于分析。通過歸類分析，共獲得36 082個(gè)OTUs，所有OTUs通過與Greengenes的16S rRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比較后確定其微生物分類。所獲OTUs主要?dú)w類于7個(gè)菌門15個(gè)屬。ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)用于反映微生物群落的相對(duì)豐度和多樣性數(shù)據(jù)（表1）。從表1可知，飼喂中草藥組（B）與對(duì)照組（A）相比，α多樣性指數(shù)都有所降低，但無明顯差異，說明飼喂添加含中草藥的飼料對(duì)蛋雞腸道內(nèi)的微生物多樣性指數(shù)影響不顯著。飼喂中草藥+益生菌組（C組）比對(duì)照組（A組）多樣性顯著降低。C組的α多樣性指數(shù)均比B組低，且部分指數(shù)存在顯著差異。

2.2? 門分類水平下腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)

從門級(jí)分類進(jìn)行腸道菌群結(jié)構(gòu)分析，A組腸道微生物菌群主要?dú)w屬于厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、擬桿菌門（Bacteriodetes）和放線菌門（Actinobacteria），占比分別為58.63%、5.40%、0.47%、30.93%和1.43%，其中厚壁菌門為蛋雞腸道內(nèi)相對(duì)豐度最高的細(xì)菌。B組、C組厚壁菌門仍然是最主要的微生物，變化不明顯。變形菌門在B、C兩組中的豐度都顯著提高，而放線菌門的占比基本沒有變化。梭桿菌門在B組中的豐度為5.47%，顯著高于對(duì)照組的0.47%;而在C組中的豐度為2.37%，與對(duì)照組差異不顯著。擬桿菌門在A組中是豐度第二高的門類（30.9%），但B組的擬桿菌門下降至9.03%; C組僅為1.17%，與A組均差異極顯著。

2.3? 屬分類水平下腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)

進(jìn)行屬級(jí)分類水平分析，乳桿菌屬（Lactobacillus）A組豐度較高，占比21.87%，其次是擬桿菌屬（Bacteroides）等3個(gè)屬，均占比10%左右。B組、C組乳桿菌屬微生物的占比較低，為4.07%和2.37%，與A組差異顯著，不是主要屬。擬桿菌屬在3個(gè)組中的占比分別為10.53%（A組）、2.93%（B組）、0.3%（C組），差異顯著。梭菌科（Unclassified_Clostridiaceae）和消化鏈球菌科（Unclassified_Peptostreptococcaceae）兩個(gè)種屬的微生物在A組中占比較低（0.13%，0.77%），在B、C兩組都顯著提高;C組的提高量高于B組，B、C組之間差異不顯著。腸球菌屬（Enterococcus）在A組未檢出，但B、C組中均出現(xiàn)，占比分別為2.27%（B組）和2.47%（C組），與A組差異顯著。梭菌屬（Clostridium）和芽孢桿菌屬（Bacillus）占比差異較大，組間差異顯著。

2.4? 產(chǎn)蛋率

分別監(jiān)測3個(gè)組在產(chǎn)蛋期的產(chǎn)蛋率，結(jié)果如表2所示。從表2可看出，B、C兩個(gè)組的蛋雞，在產(chǎn)蛋高峰期（27～34周），平均產(chǎn)蛋率維持在93%～94%，比對(duì)照組高3個(gè)百分點(diǎn)左右，且C組產(chǎn)蛋率略高于B組，但無顯著差異。

3? 小結(jié)與討論

飼喂中草藥和中草藥+益生菌，蛋雞腸道微生物多樣性降低，飼喂中草藥+益生菌比單獨(dú)飼喂中草藥降低更顯著。說明中草藥和益生菌能改變蛋雞腸道細(xì)菌群落的多樣性，兩者配合效果更明顯。

研究中草藥和益生菌對(duì)蛋雞腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。厚壁菌門是蛋雞腸道占比最高的門類，飼喂中草藥和益生菌對(duì)其影響較小，梭菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬等常用的腸道益生菌都屬于此門類。影響不大的還有放線菌門，但其占比較低。擬桿菌門的影響顯著，占比明顯降低。擬桿菌門種屬有較多致病菌，飼喂中草藥和益生菌后，其占比降低有利于減少發(fā)病。

飼喂中草藥和中草藥+益生菌，蛋雞腸道芽孢桿菌屬占比提高2～5倍，其中飼喂中草藥+益生菌組提高更為顯著。芽孢桿菌屬中的枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等是常用的腸道益生菌，可抑制致病菌的生長，減少畜禽發(fā)病率，提高生產(chǎn)性能[19-21]。差異更大的是腸球菌屬微生物。在對(duì)照組未檢出腸球菌屬，在B、C組中占比較多。腸球菌屬在飼喂的4種益生菌中的用量比芽孢桿菌屬低一個(gè)數(shù)量級(jí)，但是蛋雞腸道占比比芽孢桿菌屬的占比高5～7倍，說明中草藥可促進(jìn)腸球菌屬的定殖。在飼喂的4種常用益生菌中，乳酸片球菌所屬的片球菌屬（Pediococcus）沒有檢出，說明乳酸片球菌難以在腸道有效定殖，中草藥對(duì)其定殖沒有明顯作用。梭菌屬微生物是能形成芽孢、厭氧生長的革蘭氏陽性細(xì)菌，該屬的丁酸梭菌是公認(rèn)的腸道益生菌[20]。梭菌屬占比在飼喂中草藥組提高了10倍以上，且飼喂中草藥+益生菌組的占比顯著高于只飼喂中草藥組，說明中草藥促進(jìn)梭菌屬的定殖，中草藥和益生菌共同作用效果更佳。飼喂中草藥和益生菌能使蛋雞腸道菌群結(jié)構(gòu)得到有效調(diào)整。

金順義等[22]研究表明益生菌發(fā)酵中草藥可有效提高母豬生產(chǎn)性能，顯著提高血清中催乳素含量。在本研究中，蛋雞的生產(chǎn)性能也有明顯提高。一般白殼蛋雞的產(chǎn)蛋率高峰期為90%左右，持續(xù)時(shí)間較短，但是飼喂中草藥和益生菌后，蛋雞在高峰期的產(chǎn)蛋率提高至94%左右，且能夠保持較長的時(shí)間，說明這兩種添加物在改善蛋雞腸道后，可有效提高蛋雞的生產(chǎn)性能。

通過高通量測序分析可發(fā)現(xiàn)，中草藥和益生菌可有效地改善蛋雞腸道中菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)芽孢桿菌屬和腸球菌屬微生物的定殖，減少潛在發(fā)病率。這兩種添加物的組合可有效提高蛋雞的生產(chǎn)性能，可為減抗限抗及抗生素替代物的研究提供數(shù)據(jù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1] 伊淑帥，王? 開，胡桂學(xué).益生菌對(duì)腸黏膜屏障的保護(hù)及作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志，2015（10）：56-61.

[2] 郭欣怡，張? 曼，韓? 飛，等.不同益生菌制劑對(duì)肉雞生產(chǎn)性能、免疫功能和腸道菌群的影響[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2016，37（11）：79-83.

[3] 郝生宏，董曉芳，佟建明，等.耐制?？莶菅挎邨U菌對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能、血清生化指標(biāo)及糞便大腸桿菌的影響[J].中國畜牧雜志，2010（19）：54-56.

[4] 曾正清.蚯蚓和乳酸菌（L4）對(duì)豬糞尿臭氣濃度和免疫機(jī)能的影響及其機(jī)理研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[5] 劉? 磊，田亞男，倪學(xué)勤，等.丁酸梭菌CBM01的碳、氮源優(yōu)化及其對(duì)胃腸道耐受性的研究[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2017，29（10）：3831-3836.

[6] KOMPIANG I P. Effect of yeast：Saccharomyces cerevisiae and marine yeast as probiotic supplement on performance of poultry[J].Indonesian journal of animal & veterinary science，2014，7（1）：18-21.

[7] 劉? 誠.微生態(tài)制劑在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].飼料博覽，2013（10）：21-23.

[8] 秦康樂，趙振華，王杏龍.復(fù)合益生菌對(duì)肉仔雞生長性能和腸道形態(tài)的影響[J].當(dāng)代畜牧，2017（18）：26-28.

[9] MURSHED M A，ABUDABOS A M.Effects of the dietary inclusion of a probiotic， a prebiotic or their combinations on the growth performance of broiler chickens[J].Rev Bras Cienc Avic，2015（17）：99-103.

[10] 呂惠敏.復(fù)方中草藥有效成分的分析及對(duì)兔腸道功能的影響[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

[11] 丁? 威，楊劍波，趙? 勇，等.中草藥添加劑對(duì)育肥豬免疫功能的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2015，43（11）：136-138.

[12] 劉鳳華，王占賀，李? 博，等.中草藥飼料添加劑在育肥豬中的抗熱應(yīng)激的研究[J].飼料研究，2002（4）：1-4.

[13] 王春華，何宇喜.維生素E及中草藥對(duì)轉(zhuǎn)群仔豬抗應(yīng)激能力影響[J].飼料研究，2013（3）：83-84.

[14] 王尚榮.中藥渣飼喂雜交奶牛試驗(yàn)[J].中國奶牛，2007（1）：14-15.

[15] 秦緒光.中草藥復(fù)方添加劑對(duì)繁殖后期種公雞繁殖性能和血液生理生化指標(biāo)的影響[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2006.

[16] 王明奎，任? 菊，郝華山.添加中草藥方劑預(yù)防母豬繁殖障礙性疫病的效果觀察試驗(yàn)[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志，2014（11）：14.

[17] 田允波，葛長榮，高? 爭.天然植物中草藥對(duì)生長肥育豬生長性能、酮體品質(zhì)和肉質(zhì)特性的影響[J].中國畜牧雜志，2003，39（1）：22-24.

[18] 袁書林，榮? 斌.中草藥飼料添加劑及不同飼糧類型對(duì)生長育肥豬肉脂品質(zhì)的影響[J].養(yǎng)豬，2004（1）：15-18.

[19] GUO J R，DONG X F，LIU S，et al.Effects of long-term Bacillus subtilis CGMCC 1.921 supplementation on performance，egg quality，and feacal and cecal microflora of laying hens[J].Poultry science，2017，96（5）：1280-1289.

[20] 陳繼發(fā)，匡佑華，康克浪，等.蒙脫石、枯草芽孢桿菌及其互作對(duì)蛋雞血漿激素含量、卵巢繁殖相關(guān)基因表達(dá)和腸道微生物的影響[J].動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2019，31（1）：294-303.

[21] 劉宗正，徐? 軻，王? 劍，等.酪酸菌對(duì)腹瀉小鼠的治療效果及其安全性[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2009，47（9）：31-35.

[22] 金順義，劉? 洋，常? 娟，等.復(fù)合益生菌發(fā)酵中草藥對(duì)泌乳母豬生產(chǎn)性能和血清生化指標(biāo)的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2018， 29（10）：16-17，20.