肖 瑜，馬海明

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128）

眾所周知，豬是世界上第一批被馴化的動物，早期至少存在2 個馴化中心[1-2]。經(jīng)過長期的自然選擇和強烈的人工選擇，豬形成了較為豐富的遺傳多樣性。豬作為重要的經(jīng)濟動物之一，為人類生活需求提供大量的肉產(chǎn)品；同時，它作為一種模式動物，普遍用于各種人類疾病研究中[3-4]。

全基因組測序技術(shù)的出現(xiàn)極大地推動了生物學(xué)發(fā)展，為更深入地進行生命科學(xué)研究和理解提供了一個廣闊的平臺。20 世紀(jì)70 年代，Sanger 法的提出為生物學(xué)研究開辟了一條新的研究路徑，標(biāo)志著基因組學(xué)研究的開始[5]。隨著基因組學(xué)的快速發(fā)展，Sanger 法在基因組研究中數(shù)據(jù)量的測定和分析受到限制，這推動了第2 代測序技術(shù)（454 技術(shù)、Solexa 技術(shù)、SoLiD 技術(shù)）和第3 代測序技術(shù)的發(fā)展，對動物基因組學(xué)尤其是重測序的發(fā)展起到了重要作用[6]。

豬參考基因組的組裝成功為全面探索豬品種的遺傳變異與表型多樣性之間的關(guān)系提供了較為詳細的參考信息。目前，多數(shù)豬品種已完成全基因組序列測定，并以此為基礎(chǔ)，利用重測序技術(shù)對豬的遺傳進化、品種遺傳多樣性及表型形成遺傳機制等重要遺傳學(xué)問題進行了解析[7]。本文將介紹豬全基因組測序的研究內(nèi)容，討論豬全基因組測序研究工作中存在的問題，旨在為家豬種質(zhì)資源的改良和遺傳育種以及一些數(shù)量較少的特色豬品種的保種提供一定參考。

1 全基因組測序在豬基因組學(xué)研究中的應(yīng)用

1.1 全基因組de novo 測序在豬中的應(yīng)用 全基因組de novo 測序是指不存在參考序列或不以該物種已獲得基因組信息為參考的情況下，對某物種進行全基因組測序，利用生物信息學(xué)手段進行拼接和組裝，獲得該物種的全基因組序列。一個物種全基因組測序的完成標(biāo)志著可以從基因組水平對該物種的生長發(fā)育和進化起源等問題進行研究，從而推動對基礎(chǔ)生物學(xué)、分子育種、遺傳基因改良等方面的研究[8]。

全基因組de novo 測序在豬分子遺傳育種中的應(yīng)用為在全基因組水平研究豬的生物學(xué)特性提供有利平臺，并為完成豬的全基因組參考序列的構(gòu)建提供了方法和條件。2012 年國際豬基因組測序聯(lián)盟[3]、華大基因與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院[9]相繼公布了豬的全基因組序列。前者采用1 頭雌性杜洛克個體作為樣本，通過構(gòu)建BAC 和fosmid DNA 文庫，應(yīng)用全基因組鳥槍法進行測序，結(jié)合與之相對應(yīng)的拼接和組裝軟件，獲得杜洛克豬[3]Contig N50、Scaffold N50 分別為80 720、637 332 bp，最終組裝后的基因組全長為2.60 Gb，內(nèi)含編碼基因21 640 個。后者以中國本地品種豬五指山豬為測序樣本，獲得的Contig N50 為23.5 kb[9]，Scaffold 的組裝質(zhì)量顯著高于杜洛克豬，組裝后二者的基因組全長一致，注釋得到基因和編碼序列各20 326 個和11 843 個。結(jié)合杜洛克豬的參考基因組，國際豬基因組測序聯(lián)盟與來自歐洲和亞洲的野生及家豬的基因組進行比較[3]，揭示了100 萬年前的歐洲和亞洲野豬間的深度系統(tǒng)發(fā)育分化；進一步選擇性掃描分析發(fā)現(xiàn)，除了快速進化外的、與免疫反應(yīng)和嗅覺相關(guān)的基因表達，還鑒定了許多假定的致病變種，不僅擴展了豬作為生物醫(yī)學(xué)模型的潛力，也為進一步改進重要家畜品種資源奠定研究基礎(chǔ)。此外，遺傳分化使得不同個體、不同群體以及種屬間存在基因組序列長度差異，即單一個體或單一品種基因組作為參考基因組序列對后續(xù)群體選擇進化研究具有局限性，因此，需進行多個體、多品種全基因組測序取其特有和共有的序列，獲得物種完整的基因組遺傳信息，提高未來基因組學(xué)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和參考基因組的可靠性。Li 等[10]選取中歐10 個代表性豬種，采用全基因組de novo 測序方法對基因組序列進行測序，分析確定了歐洲豬和亞洲豬的分化時間，解釋了歐亞豬遺傳差異形成的原因，又結(jié)合藏豬的測序結(jié)果，與中國家豬群體比較，發(fā)現(xiàn)進化選擇的基因多參與缺氧、嗅覺、能量代謝以及藥物反應(yīng)等調(diào)控過程，并揭示了馴化過程中影響家豬唾液分泌加強的遺傳機制。如今，全基因組de novo 測序在生命科學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用的頻率越來越高，為后續(xù)基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，促使從各角度解析動物生長發(fā)育、繁殖、進化等遺傳規(guī)律，對珍稀動物的保護和優(yōu)異種質(zhì)資源動物品種的利用具有重要意義。

1.2 全基因組重測序在豬中的應(yīng)用 基因組重測序是以已知其物種參考基因組，對不同個體或物種內(nèi)品種進行全基因組測序，結(jié)合現(xiàn)有的參考基因組對個體或群體進行生物信息學(xué)分析，通過差異性比對獲得許多的單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）、插入和缺失位點（InDel）及結(jié)構(gòu)變異位點（SV）等，進一步預(yù)測動植物物種的重要經(jīng)濟性狀候選基因，同時利用群體SNPs 可探索不同物種的遺傳多樣性、進化關(guān)系、群體結(jié)構(gòu)和起源與馴化歷史等生物學(xué)方面的問題，為從分子水平進行育種提供重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，進一步縮短了分子育種工作的周期[11-12]。自2013 年以來，已經(jīng)對數(shù)百頭豬的基因組進行了重新測序，以研究豬的基因組變異、進化和選擇[13]，目前大約有350 個完整的基因組可公開獲取。

1.2.1 揭示遺傳進化機制 豬全基因組參考序列圖譜的構(gòu)建完成促進了豬全基因組重測序研究的飛速發(fā)展，在豬的基因組遺傳研究方面獲得了大量成果。在世界范圍內(nèi)一些豬品種中應(yīng)用全基因組重測序技術(shù)，挖掘出數(shù)量龐大的SNP 位點及結(jié)構(gòu)變異和拷貝數(shù)變異位點，對豬的遺傳選擇進化機制進行了深入研究。大量研究表明，中國家豬對歐洲豬種產(chǎn)生過巨大影響，二者之間存在廣泛的基因交流，并對世界當(dāng)代商業(yè)豬種育種做出重要貢獻，加速了重要性狀的進化。Ai 等[14]對來自中國的69頭豬（不同地理分布）的基因組進行重測序分析，結(jié)合歐洲和亞洲豬種（包括中國豬種）個體基因組測序信息，比較得到4 000 多萬個基因組SNPs，基于群體遺傳分析顯示中歐豬種間基因組具有相似性，進一步證明了中國和歐洲豬種間存在基因漸滲。同時，F(xiàn)u 等[15]和Molnar 等[16]在恩施黑豬和匈牙利曼加利察豬的重測序分析結(jié)果中也證實了這一點，且發(fā)現(xiàn)滲入基因AHR 具有典型的亞洲種質(zhì)特性，這與Boss 等[17]和Frantz 等[18]發(fā)現(xiàn)的豬種滲入基因與豬的繁殖性能顯著相關(guān)的結(jié)果一致，除此之外這些滲入基因還與代謝性疾病（包括高血脂癥、高血壓和動脈粥樣硬化）有關(guān)。此外，龍科任[19]研究發(fā)現(xiàn)，相較于杜洛克豬、皮特蘭豬、大白豬、漢普夏豬及長白豬，巴克夏豬和中國家豬的基因組具有較高的相似性，這可能是300 年前英國巴克夏郡本地晚熟品種與中國的華南豬雜交形成的，進一步說明了中國家豬對歐洲豬種存在種源貢獻。因此，早期的中國家豬和歐洲豬種間的品種雜交可能是中歐豬種間存在的遺傳物質(zhì)交流的重要原因。

由于世界豬品種豐富，地理位置分布廣泛，豬的適應(yīng)性和生長發(fā)育受環(huán)境因素影響存在一定差異，不同品種間樣本重測序從基因組層面解釋了受環(huán)境影響適應(yīng)性的遺傳機制，比較基因組分析進一步揭示了品種間的進化時間和方向，證明了不同地理位置豬種間的遺傳差異。Choi 等[20]對代表韓國本土豬、野豬和3 個歐洲血統(tǒng)品種的5 個品種豬進行全基因組重測序分析，檢測到了20 123 573 個SNPs，對檢測到的SNPs 進行豬品種的基因組特征進行分析，揭示了品種間遺傳分化的明顯信號。Li 等[21]利用具代表性的藏豬群體和中國不同地理分布的豬種的重測序信息，比較發(fā)現(xiàn)藏豬基因組中存在低氧適應(yīng)性基因和能量代謝等高原環(huán)境下的快速進化基因，基因組間差異表明600 萬年前家豬和藏豬就開始分化。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，歐洲和亞洲的野豬種群分歧大約1 May，導(dǎo)致了在數(shù)百萬個基因組位置和超過一百萬個固定用于替代等位基因的位置上存在顯著差異的次等位基因頻率[3,22]。Wang 等[23]分析了全球范圍內(nèi)的家豬和野豬的全基因組，確定了從4500—7000 年開始的野豬和家豬有效群體規(guī)模的明顯趨勢，研究結(jié)果與歐洲和中國的初級馴化結(jié)論一致，說明在馴化期間豬的馴化沒有明顯瓶頸，這可能是家豬和野豬之間長期的基因交流造成的。此外，對中國家豬和野豬進行全基因組重測序，鑒定了一系列與豬的生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)的受選擇基因，以及處于強選擇下與重要性狀相關(guān)的基因，這些發(fā)現(xiàn)促進了人們對中國家豬進化歷史的理解，并且對深入了解鑒定重要功能基因的突變、對豬的表型多樣性的研究提供了重要參考[24-25]。

1.2.2 解析品種遺傳多樣性形成機制 由于地理隔離、氣候變化、動物遷徙、人為的馴化選擇，不同豬種間基因組發(fā)生遺傳變異反應(yīng)，不同品種間呈現(xiàn)出不同的表型性狀及生物學(xué)特性，增加了品種的遺傳多樣性。Wang等[25]利用全基因組SNP 數(shù)據(jù)對6 個品種（眉山、二花臉、米豬、楓涇、沙烏頭豬和嘉興黑豬）進行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)太湖地區(qū)的中國本土豬表現(xiàn)出高比例的多態(tài)性標(biāo)記；同時中國本土豬都存在持續(xù)高水平的遺傳變異，這可能是因為與西方相比，中國豬野生祖先選擇強度較低、遺傳多樣性較高。這些結(jié)果與之前研究者的報道一致[26-28]。Herrero-Medrano 等[29]通過對歐洲商業(yè)品種豬進行重測序，指出在一些遺傳多樣性較低的地方品種（曼加利察豬、錫耶納琴塔豬、意大利品種Casertana）中，其基因組測序顯示純合子區(qū)域的比例超過50%，且含有大量潛在的破壞性突變，進一步研究發(fā)現(xiàn)AZGP1 和TAS2R40 基因潛在的差異選擇，這可能成為適應(yīng)環(huán)境差異性的候選突變，同時還觀察到在高產(chǎn)品種中與免疫應(yīng)答相關(guān)基因IL12RB2 和STAB1 的缺失，這可能是在豬生產(chǎn)過程中強烈的人為因素造成的。

大量研究表明，遺傳變異是物種遺傳多樣性形成的重要原因。Zhao 等[30]利用高通量測序?qū)碜灾袊蜌W洲的不同起源品種的13 頭豬進行了全基因組SV 檢測，發(fā)現(xiàn)X 染色體上存在1 個跨越35 Mb 區(qū)域的SV熱點，該熱點區(qū)域存在35 個對生殖能力具有重要意義的SV 相關(guān)基因。同時，Moon 等[31]通過對大白豬、大約克豬和亞洲野豬共40 頭豬的重測序數(shù)據(jù)進行分析，確定了由于人工選擇使得在豬的馴化過程中發(fā)生強烈的遺傳變異的相關(guān)基因（GRM7、GRM8、GHRL、ZNF638、PPARG），說明中國和歐洲豬起源品種之間的進化速度存在顯著差異，并為評估分子進化與系統(tǒng)發(fā)育信號提供了新的證據(jù)，也為更好地揭示中國和歐洲豬品種相應(yīng)表型和特征的遺傳差異提供了可能。此外，Zhao 等[30]研究還發(fā)現(xiàn)了涉及卵巢早衰和發(fā)育相關(guān)基因，如POF1B、DIAPH 159、RPS4 以及與智力相關(guān)的ANF711、ATRX、SRPX2、MAGT1 等4 種基因，這在人類生物學(xué)研究中已經(jīng)有了廣泛的報道[32-34]。Xiao 等[35]結(jié)合江蘇省5 個中國本土豬群體的測序信息進行遺傳變異和遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，中國本土豬與國外商品豬存在巨大差異，表明了中國本土豬的獨特性，該研究提供了5 個中國本土豬群的遺傳變異和種群結(jié)構(gòu)的第1 個基因組概況。這些研究有助于在未來對這些豬在基因組水平上的遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)、陽性選擇信號和分子進化史進行深入研究，并作為改善這些豬繁殖和培養(yǎng)的重要參考。

1.2.3 揭示表型形成遺傳機制 自公元一萬年以來，持續(xù)的人類選擇導(dǎo)致了家豬強烈的遺傳和表型變化。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基因關(guān)鍵區(qū)域的插入或缺失確實改變了基因結(jié)構(gòu)和表達，并且部分突變一定程度上對豬的表型存在顯著影響。Rubin 等[36]通過全基因組重測序鑒定了歐洲家豬表型進化的一些基因座，發(fā)現(xiàn)3 個具有強烈選擇特征的基因座與其背部伸長以及椎骨數(shù)增加有關(guān)，進一步進行基因組結(jié)構(gòu)變異分析，證實了歐洲豬毛色由KI 位點多拷貝和第17 內(nèi)含子剪切位點突變調(diào)控，這與Raspa[37]的研究結(jié)果一致。在亞洲地區(qū)，地理位置不同導(dǎo)致多數(shù)野豬種群間存在顯著差異，通過對中國南北方地區(qū)及西藏、日本的野豬和家養(yǎng)品種群體間的掃描性分析表明，毛發(fā)生長（DCAF17）和血液循環(huán)（VPS13A）一直處于不同的選擇，有助于在環(huán)境溫度變化過程中維持恒溫狀態(tài)，也進一步解釋了西藏野豬適應(yīng)高海拔的原因[14,21,37]。Wang 等[38]利用257 個個體的全基因組重測序數(shù)據(jù)分析了全球范圍內(nèi)的家養(yǎng)豬和野豬，經(jīng)群體選擇模式調(diào)查和比較，確定了與代謝性疾病有關(guān)以及分別參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、肌肉發(fā)育及能量代謝和生長相關(guān)的31 個基因，其中Dact2 基因?qū)ρ例X的生長狀況和被毛形態(tài)具有重要的調(diào)控作用[39-40]。

豬的毛色變化對品種的選育和保護具有重要意義。豬在進化過程中不同的品種進化形成獨特的毛色表型，通常可用視覺特征來區(qū)分品種[41]。Lü 等[42]對中國的31 個滇南小耳豬的全基因組進行重測序，發(fā)現(xiàn)其6 個白點毛色可能受多基因位點調(diào)控，而與MCR1基因無關(guān)，研究表明滇南小耳豬約20% 的總顏色變異是由關(guān)聯(lián)性較強的、具有不同表型貢獻的3 個基因（EDNRB、CNTLN 和PINK1）決定，且發(fā)現(xiàn)了一種與位于EDNRB 基因上游的保守非編碼序列中的6 個白點和黑色滇南小耳豬之間高度區(qū)分的突變，這一研究結(jié)果再一次加深了對滇南小耳豬進化過程中毛色變化的理解。Wang 等[43]研究發(fā)現(xiàn)，MITF 和EDNRB 基因是通城豬兩端黑色毛色表型形成的重要原因，也是造成多數(shù)中國家豬品種毛色變異的重要原因。Fu 等[15]進一步解釋了馴化過程影響中國黑豬遺傳變異的機理，即中國黑色品種豬是由于體型、免疫力、脂類代謝和發(fā)育過程等一些選擇目標(biāo)形成?？傊?，這些研究表明，以上已被發(fā)現(xiàn)的基因及候選區(qū)域在豬馴化過程中形成表型時發(fā)揮了重要作用。

2 豬全基因組測序研究面臨的問題和展望

近十幾年來，下一代高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速，技術(shù)不斷更新，在測序通量和讀長都得到明顯改善的情況下，極大程度地降低了檢測成本。雖然高通量測序存在明顯優(yōu)勢，但其局限性也不容忽視。目前，重測序技術(shù)通過短片段與參考基因組比對獲得變異數(shù)據(jù)，在測序深度和覆蓋度較大的條件下，可以獲得高準(zhǔn)確度的變異數(shù)據(jù)，如SNP、短序列的插入缺失以及拷貝數(shù)變異，但對于大段序列的基因組結(jié)構(gòu)變異的檢出有一定難度。因此，以單分子測序為特點的第3 代測序技術(shù)開始發(fā)展起來，其超長讀長和高通量、無DNA 模板擴增的優(yōu)勢使其具有非常高的測序準(zhǔn)確率，同時由于其測序成本低，故在全基因組測序和重測序方面得到很好應(yīng)用。從Sanger法到第2 代測序技術(shù)以及第3 代測序技術(shù)的全基因組測序技術(shù)的不斷革新，為廣泛而深入地開展豬全基因組研究提供了有利平臺，促進了動物基因組學(xué)的發(fā)展。

動物遺傳學(xué)研究的最終目標(biāo)是探索動物遺傳變異的原理，從而應(yīng)用于品種改良和優(yōu)異的種質(zhì)資源保護來保持品種多樣性。目前，中國豬飼養(yǎng)量占世界的50%，品種資源豐富且全國范圍內(nèi)分布較廣，不同品種間、不同地理位置的豬種在基因組上差異顯著。目前，全基因組測序在豬上已廣泛應(yīng)用并取得了大量的研究成果，從最早獲得的杜洛克豬和五指山豬的全基因組序列為開端，通過de novo 測序，陸陸續(xù)續(xù)已有很多品種的全基因組序列被破譯，這對全面探究豬的物種起源和群體進化起到重要作用。如今全基因組重測序在豬基因組學(xué)研究中大量開展，從群體水平研究豬的馴化起源、進化機制、遺傳多樣性和環(huán)境適應(yīng)性等，在不同群體中發(fā)現(xiàn)大量的SNPs、InDel、SV 和CNVs 等遺傳變異，并完成了遺傳圖譜的構(gòu)建，但對很多豬品種核心種質(zhì)的全基因組重測序還未開展。世界上分布于不同地理區(qū)域的許多地方豬品種存在著大量重要的遺傳多樣性，核心種質(zhì)全基因組重測序的開展對豬遺傳資源和特殊種質(zhì)資源的利用和保護具有重要的科學(xué)意義。同時，豬的重要性狀遺傳基礎(chǔ)是豬遺傳育種工作的核心科學(xué)問題，基因組測序與全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome—Wide Association Study，GWAS）相結(jié)合，可以鑒定一些與豬的重要性狀相關(guān)的基因和位點，因此，將全基因組測序技術(shù)和GWAS 結(jié)合可獲得更為精確的基因定位信息，并加速人們對復(fù)雜性狀形成機理的解讀。