韓新月　陳營(yíng)

尋找菌株S1發(fā)酵海帶時(shí)海藻酸鈉裂解酶活力較高的條件，將海藻酸鈉裂解酶提取并將其接入在不同條件的培養(yǎng)基中，選出能夠裂解海藻多糖和使海帶液化的最佳條件。

方法? 用酶活檢測(cè)的方法檢測(cè)出菌株S1在何時(shí)產(chǎn)生海藻酸鈉裂解酶活力最強(qiáng);在235nm下檢測(cè)海帶發(fā)酵液中海藻寡糖的含量。

結(jié)果 海帶分解75%時(shí)海藻酸鈉裂解酶活力為8.5，內(nèi)裝有氯化鈉、維氏鹽、氯化銨、30%海帶的三角瓶中且溫度為37℃在160rpm下一直搖動(dòng)海帶在三天內(nèi)液化85%。海帶分解75%時(shí)海藻酸鈉裂解酶活力較高，在此時(shí)提取的海藻酸鈉裂解酶接入內(nèi)裝有氯化鈉、維氏鹽、氯化銨、30%海帶的三角瓶中且溫度為37℃在160rpm下一直搖動(dòng)海帶液化速度最快且產(chǎn)生海藻寡糖的量最多。

隨著科技的進(jìn)步，研究發(fā)現(xiàn)海藻寡糖在食品、日用化工、化妝品、醫(yī)藥、軍工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。如海藻糖可以代替蔗糖用于食品領(lǐng)域，海藻糖與蔗糖相比甜味更為平和，使血糖升高的速度也更為緩慢，海藻寡糖也可以添加到海藻面膜等化妝品中具有良好的保濕效果，在軍工領(lǐng)域海藻寡糖可用于防輻射止血，是天然的好材料，在醫(yī)藥領(lǐng)域海藻寡糖可以用于保存生物制劑維持生物大分子的活性，還可以附著在細(xì)胞表面維持細(xì)胞的活性，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域海藻寡糖可以作為植物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)液使植物具有獨(dú)特的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。獲得海藻寡糖方法主要有物理降解法、化學(xué)降解法以及生物降解法。物理法主要采取輻射的方式，操作復(fù)雜且降解條件難以控制;化學(xué)法目前采用，但存在目標(biāo)寡糖的產(chǎn)量少，副產(chǎn)物多及回收率低等問(wèn)題;微生物發(fā)酵法條件溫和，成本低、操作簡(jiǎn)單，但菌種易污染，微生物利用有益產(chǎn)物導(dǎo)致產(chǎn)量降低。酶特異性降解法具有專一性強(qiáng)、寡糖得率高且條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，目前已報(bào)道的海藻寡糖裂解酶可以很快將海藻多糖裂解且得到大量海藻寡糖，因此提取海藻寡糖裂解酶及其作用條件有很大研究?jī)r(jià)值。本實(shí)驗(yàn)從海帶發(fā)酵液中通過(guò)酶活檢測(cè)找到S1菌何時(shí)產(chǎn)生海藻酸鈉裂解酶的酶活最強(qiáng)，并通過(guò)微孔濾膜注射器分離出海藻酸鈉裂解酶，并將海藻酸鈉裂解酶應(yīng)用在不同條件的以海帶為底物的培養(yǎng)基中，挑選出最適合海藻酸鈉裂解酶作用的條件，目的是最大程度地提取和利用以寡糖為主的海帶有效成分。

一、材料與方法

1、 材料

（1）樣品? 采于山東煙臺(tái)長(zhǎng)島縣海帶養(yǎng)殖場(chǎng)的新鮮海帶。

（2）實(shí)驗(yàn)菌種

S1為得到一株能夠裂解海藻多糖的菌株，我們可以從腐爛的海藻如海帶中尋找，挑取腐爛的海藻在以海藻酸鈉為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)平板劃線分離，挑取單菌落接種至另一個(gè)相同的培養(yǎng)基中平板劃線，取單菌落接種至海帶富集培養(yǎng)基中，若其能使海帶液化，則證明其為所需要的菌株，然后對(duì)其進(jìn)行16SrRNA鑒定。

（3）培養(yǎng)基? 富集培養(yǎng)基（g/L）：新鮮海帶塊（1 cm2以下）300 g，硫酸銨5 g，氯化鈉10 g，維氏鹽溶液50 mL，pH 6-7（維氏鹽溶液：K2HPO4·3H2O 6.50 g，MgSO4·7H2O 2.50 g，NaCl 2.50 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4·H2O 0.04 g，蒸餾水1000 mL）。

（3）實(shí)驗(yàn)方法

①海藻酸鈉裂解酶的制備方法

干海帶浸泡四個(gè)小時(shí)后將海帶切成細(xì)小的碎塊，放入500ml三角瓶中，每瓶加入30g海帶碎塊、100ml富集培養(yǎng)基，即海帶濃度為30%。高壓蒸汽滅菌（121℃，30min），取冰箱里保存的海帶發(fā)酵液按10%接種量接入富集培養(yǎng)基，設(shè)置兩組平行實(shí)驗(yàn)和一組空白實(shí)驗(yàn)。將接種后的富集培養(yǎng)基放入搖床（溫度：37℃、轉(zhuǎn)速：160rpm）搖瓶培養(yǎng)。與對(duì)照組對(duì)比，觀察海帶分解程度，并在海帶分解50%、75%、100%、100%放置一天、兩天時(shí)，分別取發(fā)酵液經(jīng)5000rpm離心10min后，將上清液經(jīng)過(guò)微孔濾膜注射器過(guò)濾除菌后即可制成海藻酸鈉裂解酶粗酶提取液。

②海藻酸鈉裂解酶酶活性及海藻寡糖的含量的檢測(cè)方法

檢測(cè)海藻寡糖含量的具體方法：取4ml發(fā)酵液，在500r/min的離心速下，離心10-15min，然后取1ml上清液液適當(dāng)稀釋，在235nm處測(cè)量其光吸收值，以此值乘上稀釋倍數(shù)來(lái)代表1ml發(fā)酵液中海藻寡糖的含量。

檢測(cè)海藻酸鈉裂解酶活性的具體方法：取4ml發(fā)酵液，在500r/min的離心速下，離心10-15min，然后取1ml上清液液適當(dāng)稀釋，測(cè)量稀釋后上清液在235nm下OD值然后把稀釋的上清液在40℃水浴中加熱10min，再迅速煮沸15min使酶滅活，再次測(cè)量235nm下的OD值。規(guī)定：40℃水浴加熱10 min，吸光值增加0.1為一個(gè)酶活力單位U。測(cè)量前后兩次OD值的差值再乘以稀釋倍數(shù)最后除以0.1即為1ml發(fā)酵液或反應(yīng)液的酶活。公式表達(dá)為：1ml發(fā)酵液的酶活=[（OD值后-OD值前）·稀釋倍數(shù)]/0.1

③不同發(fā)酵產(chǎn)酶時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響

將所制得的酶液按照10%接入量，接入內(nèi)裝有100ml富集培養(yǎng)基的500ml的三角瓶中。將接入酶液后的富集培養(yǎng)基放入搖床（溫度：37℃、轉(zhuǎn)速：160rpm）搖瓶培養(yǎng)，進(jìn)行酶解反應(yīng)使海帶分解，每隔一天測(cè)量一次各組反應(yīng)液中的酶活及海藻寡糖的含量并且觀察海帶分解情況，一共培養(yǎng)四天。將海帶分解情況拍照記錄并記錄跟蹤檢測(cè)的數(shù)據(jù)，最后選出海帶分解情況最好的一組，由此即可確定哪一海帶分解度時(shí)所制得的酶液為使海帶分解的最適酶液。

④體系不同成分對(duì)酶解反應(yīng)的影響

海藻酸鈉裂解酶粗酶提取液與海帶的酶解反應(yīng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中的氯化銨、酵母浸膏、海藻酸鈉與細(xì)菌生長(zhǎng)有關(guān)，氯化銨和酵母浸膏中的成分是否影響酶解反應(yīng)未知。海藻酸鈉裂解酶活性的發(fā)揮需要離子為已知。在含有離子（氯化鈉和維氏鹽）的幾組培養(yǎng)基中分別加入酵母膏、硫酸銨、酵母膏和硫酸銨并設(shè)置純水對(duì)照組，制取海帶發(fā)酵分解75%時(shí)的海藻酸鈉裂解酶粗酶提取液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，搖瓶（溫度：37℃、轉(zhuǎn)速：160rpm）培養(yǎng)三天后觀察各組海帶分解情況并測(cè)量各組中的酶活和海藻寡糖含量。

⑤不同溫度與搖動(dòng)時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響

將實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)置為42℃，設(shè)置42℃靜置、42℃分段搖動(dòng)、42℃一直搖動(dòng)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組。由于實(shí)驗(yàn)室條件所限，對(duì)照組選擇為1.2.3中的最優(yōu)組，酶解反應(yīng)體系成分均采用1.2.3中最優(yōu)組成分。培養(yǎng)三天后觀察海帶分解度及測(cè)定酶活性和海藻寡糖含量。比較數(shù)據(jù)得出結(jié)論找到工藝優(yōu)化的最適溫度和體系搖動(dòng)時(shí)間。

⑥不同海帶濃度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)探究最佳海帶濃度。選擇已經(jīng)探索并得出結(jié)論的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，從起始30%海帶做起，到40%、50%、60%、70%，并設(shè)置平行組，最后只看分解效果和測(cè)量235nm的OD值。按海帶量的10%接入酶液。放置最優(yōu)條件下培養(yǎng)三天，觀察各組海帶分解程度。

二、結(jié)? 果

1、發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳時(shí)間

將海帶達(dá)到各個(gè)分解度的發(fā)酵液過(guò)濾除菌制得無(wú)菌的海藻酸鈉裂解酶粗酶提取液，將海藻酸鈉裂解酶粗酶提取液按10%的接入量加入到滅菌后的海帶培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)4天，每隔一天檢測(cè)一次酶活及海藻寡糖的含量并觀察記錄分解情況。

2、 酶解反應(yīng)體系的最佳成分

酶解反應(yīng)體系中的最佳成分是離子（氯化鈉和維氏鹽）和氯化銨，它們的存在可以促進(jìn)海帶的分解，有利于酶解反應(yīng)。取各組的反應(yīng)液離心取上清液檢測(cè)反應(yīng)液中的酶活性及海藻寡糖的含量 ，如表2

3、酶解反應(yīng)的最適溫度與搖動(dòng)時(shí)

反應(yīng)體系成分：海帶、氯化鈉、維氏鹽、氯化銨、酶液

分段搖動(dòng)為每天定時(shí)搖動(dòng)2h

4、酶解反應(yīng)的最佳海帶濃度

最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件：溫度：37℃，160r/min，酶促體系成分為氯化鈉、維氏鹽、氯化銨，從起始30%海帶做起，到40%、50%、60%、70%，設(shè)兩個(gè)平行，最后只看分解效果和測(cè)量235nm的光吸收值，按海帶量的10%接入酶液。

三、討論

1、發(fā)酵工藝優(yōu)化分析? 在進(jìn)行傳統(tǒng)的發(fā)酵方法制備海藻寡糖時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中海藻寡糖的含量是先上升后下降的，在海帶完全液化分解之時(shí)，發(fā)酵液中海藻寡糖的含量并非最高。我們的研究目的有兩個(gè)，一是盡快使海帶完全分解液化，二是使發(fā)酵液中海藻寡糖最高。但由于微生物在分解海藻酸產(chǎn)生海藻寡糖之時(shí)也會(huì)利用海藻寡糖，所以為了得到盡可能多的海藻寡糖，我們將傳統(tǒng)的發(fā)酵法工藝進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化分為兩個(gè)階段，第一階段是海帶發(fā)酵階段，此階段的主要目的是制備酶活性最高的無(wú)菌海藻酸裂解酶粗酶提取酶液，第二階段的主要目的是利用所制得的酶液使海帶分解產(chǎn)生海藻寡糖。由于第二階段的反應(yīng)體系中沒(méi)有菌體細(xì)胞存在，因此只要酶的活性足夠，在底物充足的情況下便會(huì)一直積累產(chǎn)生海藻寡糖而無(wú)消耗，這樣便可達(dá)到工藝優(yōu)化提高產(chǎn)量的目的。

2、小結(jié)? 本次研究收獲的是已經(jīng)掌握了制備無(wú)菌酶液的方法即微孔濾膜除菌法，目前可以制得純凈的無(wú)菌酶液。找到了一種測(cè)量酶活及海藻寡糖含量的簡(jiǎn)便有效的方法，即以發(fā)酵液自身來(lái)測(cè)酶活，測(cè)定235nm下的OD值。探索出了海帶發(fā)酵分解至75%這一分解度時(shí)所制得的粗酶液能夠使固體海帶以最快的速度分解且分解效果徹底。探索出了工藝優(yōu)化的最佳條件。更為重要的是提高了海藻寡糖的產(chǎn)量，在相同條件下利用工藝優(yōu)化的方法生產(chǎn)海藻寡糖比傳統(tǒng)菌種發(fā)酵的方法產(chǎn)量提高了25%。

（作者單位：264005煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）