李小琴，趙 祺，者國(guó)雄，2，楊 湉，張鳳良*

（1.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪666100；2.西南林業(yè)大學(xué)，昆明650224）

橡膠樹（Hevea brasiliensis）原生于亞馬遜流域，是大戟科（Euphorbiaceae）重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物之一，也是目前唯一大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的天然橡膠來源。橡膠樹喜高溫、高濕、靜風(fēng)的生長(zhǎng)環(huán)境，適合生長(zhǎng)的年均溫度為20～30℃，當(dāng)溫度低于10℃，橡膠樹會(huì)受到不同程度的寒害，特別是低于0℃時(shí)受害嚴(yán)重，甚至死亡［1］。目前，世界天然橡膠主要產(chǎn)區(qū)集中在馬來西亞、印度尼西亞、泰國(guó)、斯里蘭卡、印度、中國(guó)等國(guó)家，除中國(guó)外，其余地區(qū)的最低氣溫大多在15℃以上，橡膠樹不易受到寒害。而中國(guó)植膠區(qū)屬熱帶季風(fēng)氣候，冬季常有寒潮來襲，根據(jù)歷年橡膠樹寒害調(diào)查報(bào)告，滇東南植膠區(qū)冬季溫度常低于10℃，偶爾會(huì)出現(xiàn)5℃以下連續(xù)低溫陰雨天氣，局部地區(qū)氣溫甚至低至0℃，橡膠樹每年都會(huì)遭到不同程度的寒害［2-6］。

我國(guó)從20世紀(jì)60年代就已開始橡膠樹抗寒高產(chǎn)選育種工作，主要以營(yíng)建抗寒前哨圃來評(píng)價(jià)種質(zhì)資源抗寒性強(qiáng)弱，在已有的種質(zhì)資源基礎(chǔ)上鑒定篩選出了一批適合我國(guó)植膠區(qū)的抗寒高產(chǎn)無性系，如GT1、云研77-2、云研77-4、熱研93-114、天任31-45等［7-10］。采用抗寒前哨圃來鑒定橡膠樹抗寒性的育種雖取得了較好的效果，但該技術(shù)對(duì)地理環(huán)境要求較高，且每年的自然低溫有不可預(yù)見性，經(jīng)常出現(xiàn)多年冬季溫度不夠低或持續(xù)時(shí)間短，植株基本不受害；或者冬季溫度過低，持續(xù)時(shí)間過長(zhǎng)，植株甚至?xí)克劳觯b定結(jié)果所受影響極大。課題組近幾年采用抗寒前哨圃的方法進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定，也面臨著同樣的問題。

隨著科學(xué)技術(shù)手段的進(jìn)一步提高，實(shí)驗(yàn)室生理及分子鑒定方法在大量果樹、林木、花卉等抗寒性鑒定上取得了巨大進(jìn)步［11-13］。對(duì)橡膠樹室內(nèi)抗寒生理鑒定也有一些報(bào)道，大多數(shù)研究者所使用的材料為葉片［14-16］，而橡膠樹在冬季遭遇低溫時(shí)，葉片多已衰老，甚至脫落，寒害主要表現(xiàn)為樹皮裂開、爆膠甚至干枯，樹皮的組織結(jié)構(gòu)將直接影響到植株對(duì)低溫的耐受能力。以枝條作為材料較少［1，17］，也未見將橡膠樹的抗寒性與樹皮含水量厚度作關(guān)聯(lián)分析。鑒于此，本文以橡膠樹樹皮為材料，通過人工模擬低溫脅迫，測(cè)定了20份橡膠樹魏克漢種質(zhì)資源樹皮受脅迫后的相對(duì)電導(dǎo)率，結(jié)合其樹皮的含水量和厚度，進(jìn)行抗寒性鑒定評(píng)價(jià)，旨在選出抗寒能力強(qiáng)的橡膠樹種質(zhì)資源，同時(shí)為橡膠樹抗寒性間接選擇積累一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料選自“農(nóng)業(yè)部景洪橡膠樹種質(zhì)資源圃”苗圃地內(nèi)20份橡膠樹魏克漢種質(zhì)資源一年生嫁接無性系，編號(hào)為1～20號(hào)，苗木按常規(guī)育苗管理，生長(zhǎng)良好。每個(gè)無性系隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的從上而下第二蓬葉的一年生枝條作為材料。

1.2 方法

1.2.1 枝條的低溫處理

2018年1月20 日，每個(gè)無性系選取3株植株進(jìn)行采集，帶回實(shí)驗(yàn)室依次用自來水和蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干水分，再將每根枝條剪成均勻的4段，同一無性系隨機(jī)分成4組，每組3段，用塑封袋包好并做好標(biāo)記。用冰箱設(shè)置4個(gè)溫度梯度:4℃（對(duì)照）、0℃、-2℃和-5℃，降溫速度為4℃/h，當(dāng)達(dá)到預(yù)設(shè)溫度后持續(xù)12 h，再以4℃/h的速度升溫至室溫，取出待測(cè)。

1.2.2 測(cè)定方法

相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定:將低溫處理后的枝條用濾紙吸干水分，避開芽眼，準(zhǔn)確裁取1 cm×1 cm小方塊樹皮，同一低溫處理的同一無性系共裁取6片，每2片放入一個(gè)試管中，加入雙重蒸餾水20 mL，混合均勻，室溫放置24 h，期間搖勻數(shù)次。用SG3-ELK型便攜式電導(dǎo)率儀先測(cè)出初始電導(dǎo)值（C1），再蓋上試管塞，沸水浴30 min，取出冷卻至室溫后再測(cè)出終電導(dǎo)值（C2），重復(fù)測(cè)定3次。按以下計(jì)算公式對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率進(jìn)行計(jì)算:

相對(duì)電導(dǎo)率REC（%）=（C1/C2）×100%

樹皮性狀的測(cè)定:選用未經(jīng)任何處理的枝條，裁取樹皮，用游標(biāo)卡尺對(duì)樹皮厚度進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量時(shí)避開芽眼；同時(shí)，隨機(jī)裁取3塊均勻大小的樹皮，稱取其鮮重，用烘箱80℃烘干至恒重，稱取其干重，計(jì)算出樹皮含水量。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理作圖，用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析及相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析。非線性回歸按Logistic方程Y=k/（1+ae-kt)進(jìn)行擬合，其中Y為低溫處理下的橡膠樹葉片相對(duì)電導(dǎo)率，t為處理溫度，K、a、b為參數(shù)，K為Y的最大極限值。根據(jù)Sukumaran等基于電解質(zhì)滲出率達(dá)50%時(shí)的溫度正好與組織半致死溫度（LT50）相一致，提出以電解質(zhì)滲出率達(dá)50%時(shí)的溫度作為組織的半致死溫度（LT50）［18］。由擬合出的方程計(jì)算當(dāng)Y為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度t值，即橡膠樹枝條半致死溫度LT50。

2 結(jié)果與分析

2.1 枝條相對(duì)電導(dǎo)率受低溫的影響

相對(duì)電導(dǎo)率是反映植物組織受凍后細(xì)胞原生質(zhì)膜透性大小的重要指標(biāo)，以相對(duì)電導(dǎo)率表示植物在低溫傷害下細(xì)胞質(zhì)膜透性變化是植物抗寒性鑒定常用的方法［19］。低溫下，橡膠樹樹皮組織細(xì)胞的膜透性增大，造成電解質(zhì)外滲，溫度愈低，電解質(zhì)滲透率越大，相對(duì)電導(dǎo)率越大。試驗(yàn)測(cè)定的20個(gè)橡膠樹無性系隨溫度降低相對(duì)電導(dǎo)率的變化趨勢(shì)見圖1，從中可以看出，隨著處理溫度的下降，相對(duì)電導(dǎo)率呈現(xiàn)不同程度的上升趨勢(shì)，在0℃時(shí)變化較小，-2℃增長(zhǎng)較快，在-5℃低溫，曲線均表現(xiàn)出迅速增長(zhǎng)趨勢(shì)。在整個(gè)變化過程中，每份種質(zhì)資源相對(duì)電導(dǎo)率增長(zhǎng)趨勢(shì)相同，均呈現(xiàn)出“S”型增長(zhǎng)。

結(jié)合表1數(shù)據(jù)可知，0℃處理相對(duì)電導(dǎo)率均值為38.18%，與4℃對(duì)照均值33.49%相比，增幅僅為14%，說明橡膠樹在0℃處理12 h時(shí)所受寒害較輕；經(jīng)過-2℃低溫處理，所測(cè)20個(gè)無性系中有8個(gè)相對(duì)電導(dǎo)率已超過50%，而其余無性系也基本接近50%，可知橡膠樹的半致死溫度多集中在-2℃；到-5℃低溫，相對(duì)電導(dǎo)率整體均值已高達(dá)84.89%，參試種質(zhì)資源枝條組織均受到嚴(yán)重傷害，顯示出橡膠樹對(duì)低溫的極不耐受性。

表1 橡膠樹不同無性系抗寒性、樹皮含水量及厚度比較

2.2 不同無性系半致死溫度的確定及抗寒性比較

由 Logistic 方程Y=K/（1+ae-bt)進(jìn)行擬合，對(duì)橡膠樹枝條半致死溫度（LT50）進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)半致死溫度越低表示該樹種抗寒性越強(qiáng)［20］，得出20份魏克漢種質(zhì)資源枝條抗寒性排序結(jié)果如表1，Logistic方程擬合度R2在0.884～0.965，擬合效果較好。橡膠樹半致死溫度變幅為-2.366～-0.395℃，均值為-1.348℃。根據(jù)LT50的高低，可以分為3類，LT50在-2℃以下的，即抗寒性強(qiáng)的無性系號(hào)依次為 12、7、2、13和 4號(hào)，占所測(cè)群體的25%；LT50在-2～-1℃的，即抗寒性一般的無性系號(hào)依次為9、16、6、15、19、20和14號(hào)，占35%；LT50在-1℃以上的，即抗寒性弱的無性系號(hào)依次為8、18、5、1、11、3、10和7號(hào)，占 40%。由此可見，所測(cè)橡膠樹群體抗寒性強(qiáng)的資源相對(duì)較少。

2.3 枝條抗寒性與樹皮含水量和厚度相關(guān)性分析

20個(gè)橡膠樹無性系樹皮的含水量及厚度測(cè)定結(jié)果比較見表1，樹皮含水量在71.30%～80.09%，變幅較小，均值為75.95%；樹皮厚度為0.54～1.02 mm，變幅較大，最大值已接近最小值的2倍，均值為0.78 mm。

對(duì)橡膠樹半致死溫度、樹皮含水量及樹皮厚度進(jìn)行相關(guān)性分析（表2），可以看出，橡膠樹樹皮厚度與半致死溫度呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為-0.746，說明當(dāng)樹皮厚度值越大，半致死溫度越低，即抗寒性越強(qiáng)。而含水量與半致死溫度、樹皮厚度間相關(guān)性均不顯著。

表2 橡膠樹半致死溫度與樹皮性狀的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

本研究利用室內(nèi)人工模擬低溫處理的方法對(duì)20份橡膠樹魏克漢種質(zhì)資源枝條的抗寒性進(jìn)行了鑒定，通過相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定可以有效地將其抗寒性強(qiáng)弱區(qū)分開，根據(jù)半致死溫度可將20個(gè)橡膠樹無性系分為3類，即抗寒性強(qiáng)的（有5個(gè)）、抗寒性一般的（7個(gè)）和抗寒性弱的（8個(gè)），所測(cè)的橡膠樹魏克漢種質(zhì)資源抗寒性強(qiáng)的種質(zhì)相對(duì)較少，增加了后期抗寒選育種的難度。

對(duì)樹皮含水量及厚度的測(cè)定結(jié)果表明，不同無性系間的樹皮含水量差異較小，而樹皮厚度差異大，最大值是最小值的2倍；由相關(guān)性分析結(jié)果可知，抗寒性與厚度呈極顯著正相關(guān)，說明在進(jìn)行大量橡膠樹無性系抗寒性鑒定時(shí)，可以考慮先通過測(cè)定樹皮厚度作初步篩選，以降低后期工作量。

與建立橡膠樹抗寒前哨圃相比，室內(nèi)抗寒性鑒定具有成本低、見效快、育種時(shí)間縮短等優(yōu)勢(shì)。本研究因?qū)嶒?yàn)設(shè)備的局限性，僅設(shè)置了4個(gè)溫度梯度，所測(cè)指標(biāo)也較單一，后期還需從多方面進(jìn)行綜合研究，如考慮橡膠樹對(duì)低溫比較敏感，可以將溫度梯度設(shè)得更低；對(duì)持續(xù)低溫耐受力的研究，可在同一低溫下從不同處理時(shí)間進(jìn)行探討；選擇多個(gè)與抗寒性相關(guān)的生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，以便綜合評(píng)價(jià)；樹體不同部位的抗寒性是否一致等，也有待進(jìn)一步研究。