張麗蓉 宋金武 黎英文 鄧金花 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司 （廣東 廣州 510663）

內(nèi)容提要： 目的：比較形成生物被膜的細菌和游離菌對消毒劑的抗性。方法：采用超聲波平板法和載體浸泡定量殺菌試驗進行實驗室觀察。結(jié)果：用含800mg/L的過氧乙酸消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為90.53%、87.64%和83.16%，對其細菌生物被膜的平均殺滅率僅為82.56%、84.81%和82.85%；用含150mg/L的二氧化氯消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為96.95%、96.18%和96.05%，對其細菌生物被膜的平均殺滅率僅為86.37%、89.54%和91.20%。結(jié)論：形成生物被膜的細菌對消毒劑抗性都比游離菌強，鮑曼不動桿菌差異尤為明顯。

生物被膜是指細菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，將其自身包繞其中而形成的大量細菌聚集膜樣物，具有普遍存在，難發(fā)現(xiàn)和難去除等特點。雖然生物被膜是細菌等微生物存在的主要形式，具有重要的研究意義，但多年來經(jīng)典細菌學主要研究的是浮游生長的細菌，而忽視了對細菌生物被膜的研究[2]。目前國內(nèi)對生物被膜的研究主要集中在醫(yī)學領域，對其他相關領域中的生物被膜研究報道較少，研究理論基礎相對薄弱[1]。為比較研究醫(yī)學領域、食品工業(yè)中常見的細菌生物被膜和游離菌對消毒劑抗性的大小，選擇環(huán)凱牌二氧化氯消毒液和HKM過氧乙酸消毒液作為實驗消毒劑，通過超聲波平板法和載體浸泡定量殺菌試驗比較其殺菌效果?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1.材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用消毒劑：環(huán)凱牌二氧化氯消毒液、HKM過氧乙酸消毒液由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司研制。實驗時，用無菌標準硬水配制成不同濃度溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

試驗菌為鮑曼不動桿菌（ATCC 19606）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853），由廣東省微生物菌種保藏中心提供。

1.2 方法

1.2.1 細菌生物被膜的培養(yǎng)

用丙酮浸泡不銹鋼片除去表面的油脂，然后把不銹鋼片置于5mol/L鹽酸溶液中浸泡15min，用洗滌劑清洗，再用蒸餾水沖洗干凈，將處理后的不銹鋼片放入含有5mL TSB培養(yǎng)液的試管中，121?C滅菌15min，待用。分別將鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌接種在TSB培養(yǎng)液中37?C培養(yǎng)過夜，18h后使其活菌數(shù)達108CFU/mL。在含TSB溶液和不銹鋼片的無菌試管中，加入0.1mL上述菌懸液，每隔24h更換1次TSB培養(yǎng)液，于37?C連續(xù)培養(yǎng)7d，即可形成穩(wěn)定生物被膜。

1.2.2游離菌菌懸液

分別將鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分離培養(yǎng)，取典型菌落接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，培養(yǎng)24h，將新鮮斜面培養(yǎng)物用胰蛋白胨生理鹽水洗下并稀釋成含菌量為1.0×108～5.0×108CFU/mL試驗菌懸液。

1.2.3 中和劑鑒定試驗

試驗菌為鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，試驗設6組，按照2002版《消毒技術規(guī)范》中規(guī)定的中和劑鑒定試驗程序進行試驗。結(jié)果，以第1組無菌生長或菌數(shù)遠少于第2組；第2組菌數(shù)超過5CFU/mL；第3、4、5組菌數(shù)為1.0×108～5.0×108CFU/mL，且組間菌落數(shù)誤差小于15%；第6組不長菌，表明所選中和劑及其濃度適宜。試驗重復2次[3]。

1.2.4 載體浸泡定量殺菌實驗

按照2002版《消毒技術規(guī)范》中規(guī)定的載體浸泡定量殺菌試驗程序進行試驗。

1.2.5 超聲波平板法殺菌試驗

將培養(yǎng)7d的不銹鋼片從TSB培養(yǎng)液中取出，經(jīng)無菌PBS清洗后分別放入已稀釋至相應濃度的消毒液試管中，待菌藥相互作用至各預定時間，用無菌鑷子將菌片分別移入裝有5.0mL中和劑的試管中，將上述試管置于超聲波清洗器中，設定超聲處理溫度為25?C，超聲波功率為95W進行超聲震蕩10min。將超聲波處理后的樣液在無菌條件下，取樣（或作適當稀釋后，取相應稀釋度的稀釋液）1mL，置于滅菌平皿內(nèi)，每管接種兩個平皿，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，37?C培養(yǎng)24～48h后進行活菌菌落計數(shù)，計算平均殺滅率。試驗重復3次。

陽性對照組：將培養(yǎng)7d的不銹鋼片從TSB培養(yǎng)液中取出，經(jīng)無菌PBS清洗放入裝有5mL PBS的試管中作用至相應時間，將上述試管置于超聲波清洗器中，設定超聲處理溫度為25?C，超聲波功率為95W進行超聲震蕩10min。將超聲波處理后的樣液在無菌條件下，取樣（或作適當稀釋后，取相應稀釋度的稀釋液）1mL，置于滅菌平皿內(nèi)，每管接種兩個平皿，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，37?C培養(yǎng)24～48h后進行活菌菌落計數(shù)，計算平均殺滅率。試驗重復3次。

2.結(jié)果

2.1 中和劑鑒定試驗結(jié)果

結(jié)果表明，用含5g/L硫代硫酸鈉+3g/L卵磷脂+10g/L吐溫80組成的磷酸鹽緩沖液（PBS）作為中和劑，可有效中和環(huán)凱牌二氧化氯消毒液和HKM過氧乙酸消毒液最高試驗濃度溶液對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的殘余作用，且中和劑和中和產(chǎn)物對試驗菌及培養(yǎng)基均無影響。見表1。

2.2 殺菌試驗結(jié)果

2.2.1 過氧乙酸消毒劑殺菌實驗結(jié)果

用含800mg/L的過氧乙酸消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為90.53%、87.64%和83.16%，對其細菌生物被膜的平均殺滅率分別為82.56%、84.81%和82.85%；含1500mg/L的過氧乙酸消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為94.55%、92.36%和90.34%，對其細菌生物被膜的平均殺滅率分別為88.11%、89.17%和89.17%；含2000mg/L的過氧乙酸消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為98.10%、97.05%和96.18%，對其細菌生物被膜的平均殺滅率分別為93.55%、94.73%和93.18%。見表2。

2.2.2 二氧化氯消毒劑殺菌實驗結(jié)果

含150mg/L的二氧化氯消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為96.95%、96.18%和96.05%，對其細菌生物被膜的平均殺滅率分別為86.37%、89.54%和91.20%；含250mg/L的二氧化氯消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率分別為98.03%、97.35%和99.10%，對其細菌生物被膜的平均殺滅率分別為90.58%、92.17%和95.22%；含400mg/L的二氧化氯消毒劑作用1min，對鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌游離菌的平均殺滅率均為100%，而對其細菌生物被膜的平均殺滅率僅為96.31%、98.56%和99.45%。見表3。

表1. 中和劑鑒定試驗結(jié)果

表2. 過氧乙酸消毒劑殺菌效果

表3. 二氧化氯消毒劑殺菌效果

3.討論

實驗結(jié)果表明，形成生物被膜的細菌對過氧乙酸和二氧化氯兩種消毒劑抗性都比游離菌強，其中鮑曼不動桿菌差異尤為明顯，這與國內(nèi)相關研究結(jié)果吻合，國內(nèi)多項研究均表示鮑曼不動桿菌的多重耐藥性與生物被膜的形成有密切關系[4]。

從理論上講，生物被膜是細菌在接觸表面生活時采取的生長方式，這是細菌的一種本能，任何細菌均有可能形成生物被膜。形成生物被膜的細菌對消毒劑有很強的抵抗力，也就是醫(yī)學上常說的“耐藥性”。生物被膜是細菌在接觸表面形成的高度組織化的多細胞結(jié)構(gòu)，其中的EPS（胞外聚合物）起屏障作用，限制抗生素分子向細菌細胞運輸，多糖蛋白復合物還可與一些藥物反應，具有中和藥物的活性[5]。近年來有研究表明生物被膜中存在許多毛細管狀的水通道，是一種多孔滲水結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于水和營養(yǎng)物質(zhì)的分散，能將營養(yǎng)物質(zhì)從生物被膜的表面輸送給底部的微生物，同時微生物的代謝產(chǎn)物也能從底部傳送到表面，排出體外。所以生物被膜中微生物其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理、生化特性及消毒劑的敏感性都與浮游生長的微生物顯著不同，形成生物被膜的細菌不僅可以抵制消毒劑的作用，也可以對抗外在壓力，如缺水、營養(yǎng)成分缺乏等情況[6]。近年來，細菌感染日趨嚴重，而生物被膜作為細菌耐藥的主要因素，如何防止生物被膜的形成、及時清除已形成的生物被膜，深入研究生物被膜耐藥機制及相關調(diào)控基因表達，也許將成為未來研究細菌耐藥機制的熱點。