張 毅, 鄧昌平, 時 敏, 付 蓉, 王 瑤, 曹建國, 開國銀,*

(1.上海師范大學 生命科學學院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234;2.浙江中醫(yī)藥大學 藥學院,浙江 杭州 311402)

0 引 言

丹參(Salviamiltiorrhiza)為唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(Salvia)多年生草本植物,因其根色紅,形狀似參而得名“丹參”[1].丹參有效成分主要包括水溶性的酚酸類化合物和脂溶性的丹參酮類化合物[1].丹參酮類化合物包括丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮IIB、隱丹參酮、二氫丹參酮等[2].丹酚酸類化合物主要包括丹酚酸A、丹酚酸B 、丹酚酸C、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸等[3].丹參酮IIA是丹參中含量較多且具有廣泛藥理活性的化合物.近年來研究表明,丹參酮IIA可以抑制包括乳腺癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤細胞株的生長[4-7],對提高心肌耐缺氧的能力,保護紅細胞膜,修復心肌等有重要作用[8-10].此外它還可有效改善微循環(huán)障礙,降低冠心病、腦缺血中風及心肌梗塞病人的全血和血漿黏度[11-12],是臨床上廣泛應用于治療心血管病的中成藥制劑[13-15],同時也應用到保健品及化妝品行業(yè)[16-17].

聚酰胺是由酰胺聚合而成的一類高分子物質(zhì),作為一種高性能的塑料,被廣泛應用于各類工程中[18],近年來也被大量應用于天然產(chǎn)物的分離中.聚酰胺吸附層析法主要原理為“氫鍵吸附”,即由于聚酰胺分子內(nèi)有很多酰胺鍵可與酚羥基(黃酮體、蒽醌等) 形成氫鍵,能對酚類化合物產(chǎn)生吸附作用.其中,王怡紅等[19]首先使用聚酰胺層析的方法分離出了銀杏葉中的黃酮類物質(zhì).林春梅等[20]使用聚酰胺層析柱純化出牛蒡的總黃酮.張偉豐等[21]使用聚酰胺層析柱對阿魏酸多糖進行脫色.根據(jù)形成氫鍵的基團(羥基、羧基等)數(shù)目,含羥基越多的物質(zhì),越容易被吸附.

丹參酮IIA在丹參中的含量較低[22],目前已有的研究中采用超臨界CO2萃取法[23]、硅膠柱層析法[24]、高速逆流法[25]、大孔樹脂分離技術[26]等方法來提取分離出丹參酮IIA單體.但是采用上述常規(guī)方法提取分離丹參酮IIA效率低,成本較高,并且提取純度也有待提高.本研究采用乙醇作為提取溶劑,配合聚酰胺柱層析的方法,并采用不同濃度的乙醇作為洗脫劑分離丹參酮IIA.所分離的丹參酮IIA純度達93%以上,具有提取率和提取純度高,安全可靠,且溶劑可以重復利用,避免浪費等優(yōu)點,是一種高效的丹參酮IIA分離提純方法.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

丹參根部粗品(市售);石油醚(分析純)、乙醇(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、二氯甲烷(分析純)、甲醇(分析純),上海潤捷化學有限公司;磷鉬酸(分析純),國藥集團化學試劑有限公司;乙腈(色譜純)、聚酰胺凝膠,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氘代氯仿,美國CIL公司;薄層層析硅膠板,煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司.

儀器設備:落地式連續(xù)粉碎機(DFY-500),上海鼎廣儀器有限公司;循環(huán)水式多用真空泵[SHZ-D(Ⅲ)],上?？粕齼x器有限公司;旋轉蒸發(fā)儀(RE52-99),上海亞榮生化儀器廠;低溫冷卻水循環(huán)泵(CCA-20),鞏義市予華儀器有限責任公司;電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9140A),上海海向儀器設備廠;純水儀(Master-S30),上海和泰儀器有限公司;紫外分析儀(ZF-1),上海驥輝科學分析儀器有限公司;電子天平(FA1204B),上海天美天平儀器有限公司;高效液相色譜儀(1260 Infinity I),Agilent Technologies;核磁共振譜儀(Bruker AVANCE III 500 MHz),德國Bruker公司;吹風機(HP8220),飛利浦(中國)投資有限公司;玻璃毛細點樣管(直徑0.3 mm,長度100 mm),上海積裕實驗室設備有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 丹參有效成分的提取

將10 kg丹參干燥根部原料洗凈后自然晾干,粉碎;加入2～3倍體積的95%(體積分數(shù))乙醇浸泡7 d,期間每間隔12 h攪拌一次;將提取液通過砂芯漏斗過濾,取濾液用旋轉蒸發(fā)儀蒸出溶劑,得到浸膏;將溶劑再次倒回材料中進行浸泡提取,重復3次.最后合并得到丹參提取總浸膏,備用.

1.2.2 丹參酮類物質(zhì)的粗提取

將提取所得的乙醇提取浸膏倒入分液漏斗中,加入15倍浸膏體積的純水,后加入10倍體積的石油醚進行充分振蕩萃取,待靜置分層后取上層石油醚相,減壓濃縮,得到石油醚相浸膏.重復該操作3次,得到總的石油醚相浸膏;再向石油醚萃取后的水相中加入10倍體積的乙酸乙酯再次進行萃取,減壓濃縮,得到乙酸乙酯相浸膏.重復該操作3次,得到乙酸乙酯相總浸膏64 g.

1.2.3 乙酸乙酯相浸膏的聚酰胺凝膠柱層析分離

1.2.3.1 裝柱處理

用體積分數(shù)為10%的乙醇溶解聚酰胺膠粉并裝入相應規(guī)格(長度為45 cm,直徑為7 cm)的層析柱中,膠粉體積約為柱體積的三分之二,用10%(體積分數(shù))的乙醇沖洗柱子,直至層析柱內(nèi)壁無雜質(zhì)且膠粉緊實填充.

1.2.3.2 樣品處理

加入總體積約為40 mL的二氯甲烷和甲醇混合溶劑(體積比為1∶1)來溶解樣品,再加入1.5倍浸膏體積的聚酰胺膠粉充分攪拌混勻,旋轉蒸發(fā),將混有樣品的干燥粉末取出,干法上樣.

1.2.3.3 梯度洗脫

用不同質(zhì)量分數(shù)(10%,20%,…,100%)的乙醇溶劑進行梯度淋洗,每種質(zhì)量分數(shù)的乙醇溶劑洗脫3～5 L,控制流速為13～20 mL·min-1,每1 L接瓶,通過薄層色譜(TLC)檢視、觀察洗脫情況,分段合并收集洗脫液.將含有丹參酮IIA的洗脫液合并,減壓濃縮,得到丹參酮IIA粗品.

1.2.4 重結晶洗脫液

將上步所得的丹參酮IIA粗品用二氯甲烷和甲醇溶劑溶解,將粗品溶液置于試管中,待其結晶;再用石油醚洗滌至顏色成均一的棕紅色結晶,干燥.

2 結果與分析

2.1 不良溶劑洗脫結晶

將得到的結晶置于砂芯漏斗中,加入適量石油醚抽濾、洗滌,洗滌至顏色均一無其他雜質(zhì),為深紅色晶體(圖1),取出并稱量質(zhì)量為2.00 g.

圖1 丹參根及丹參酮IIA結晶

2.2 薄層色譜條件及結果分析

用毛細點樣管吸取二氯甲烷溶解獲得的結晶溶液少許,與丹參酮IIA標品溶液點于同一硅膠板上,以二氯甲烷-甲醇(體積比為10∶1)為展開劑,前沿線約至硅膠板的3/4 長度處取出、晾干,置于紫外分析儀254 nm紫外波長下觀察,顯示具單一熒光(圖2),再加入顯色劑磷鉬酸溶液,用吹風機吹干,觀察到無其他熒光物質(zhì)干擾(圖3).

圖2 丹參酮IIA標品與樣品TLC分析

圖3 磷鉬酸染色后丹參酮IIA標品與樣品分析

2.3 核磁共振氫譜(1H NMR)分析

條件:(500 MHz,氘代氯仿),δ 7.63(d,J(偶合常數(shù)) = 8.1 Hz,1H),7.55(d,J= 8.2 Hz,1H),7.24～7.20(m,1H),3.18(t,J= 6.4 Hz,2H),2.286(s,3H),1.83～1.75(m,2H),1.68～1.62(m,2H),1.31(s,6H),如圖4所示.δ 7.63(d,J= 8.1 Hz,1H),7.55(d,J= 8.2 Hz,1H)根據(jù)其化學位移及耦合常數(shù)可以確定其為鄰位耦合的芳香氫,即6位和7位的苯環(huán)上的氫;7.24～7.20(m,1H)為15位呋喃上的氫;3.18(t,J= 6.4 Hz,2H)為三重峰,說明其為1號氫信號;2.28～2.24(m,3H)為17位甲基氫;1.83～1.75(m,2H),1.68～1.62(m,2H)為2、3號位的亞甲基氫;1.31(s,6H)為18、19位6個甲基氫(表1).

圖4 1H NMR核磁分析結果

表1 丹參酮IIA的1H NMR、核磁共振碳譜(13C NMR)分析結果

2.4 核磁共振碳譜分析

條件:(125 MHz,氘代氯仿),δ 183.78(C-11),175.92(C-12),161.86(C-14),150.26(C-5),144.62(C-10),141.42(C-15),133.61(C-6),127.60(C-8),126.63(C-9),121.28(C-13),120.38(C-16),120.03(C-7),76.91(CDCl3),37.99(C-3),34.81(C-4),31.99(C-18),30.04(C-1),19.27(C-2),8.96(C-17),如圖5所示.以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[26-28]報道的丹參酮IIA數(shù)據(jù)一致,故鑒定此化合物為丹參酮IIA.

圖5 13C NMR核磁分析結果

2.5 高效液相色譜(HPLC)分析

取10 μL樣品進行高效液相色譜分析,色譜條件為:C-18 反相硅膠柱(Symmetry Shield TM C18,5 μm,250 mm× 4.6 mm,waters);乙腈-超純水(體積比為65∶35)為流動相;柱溫為30 ℃;流速為1 mL·min-1;檢測波長為220 nm.分析結果表明在23 min左右出現(xiàn)均一單峰,與丹參酮IIA標準品出峰時間吻合,可以確定樣品為丹參酮IIA(圖6).

圖6 丹參酮IIA (a) 標品、(b) 樣品以及 (c) 混合品(標品和樣品體積比為1∶1)的HPLC分析結果

3 結 論

采用聚酰胺柱層析、乙醇梯度洗脫,合理有效地控制柱層析流速為13～20 mL·min-1,分離出了丹參酮IIA單體,純度為93%,是一種高效的丹參酮IIA分離提純方法,適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn).應用無毒或低毒的有機溶劑,并減少有機溶劑種類及使用量,達到了降耗節(jié)能,減少人員危害和環(huán)境污染的效果,且成本低、安全可靠,可為其他植物中相關產(chǎn)物的分離、提取提供參考.同時,本研究過程中還獲得了其他極性的混合組分,下一步可以通過其他的分離方法(如硅膠層析、凝膠層析、大孔樹脂分離技術等)進一步將其分離.