張 雷，姚鴻萍，程曉亮

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安 710061)

萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素為糖肽類(lèi)抗菌藥物，用于預(yù)防和治療多種革蘭氏陽(yáng)性菌感染，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)[1]。二者在結(jié)構(gòu)上除了在去甲萬(wàn)古霉素的N末端缺少1個(gè)甲基以外幾乎相同，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。萬(wàn)古霉素與去甲萬(wàn)古霉素的抗菌譜和活性相似，治療窗均較窄，萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的谷質(zhì)量濃度治療窗分別為10～20[2-3]和5～10 μg·mL-1[4]。谷質(zhì)量濃度低于治療窗時(shí)治療效果不佳，谷質(zhì)量濃度高于治療窗時(shí)出現(xiàn)腎毒性和耳毒性的風(fēng)險(xiǎn)增加[2-3]。因此，需要進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)以確保藥物療效并防止毒性和不良反應(yīng)發(fā)生[2]。

圖1萬(wàn)古霉素(A)和去甲萬(wàn)古霉素(B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

Fig.1 Chemical structure of vancomycin (A) and norvancomycin (B)

文獻(xiàn)報(bào)道的萬(wàn)古霉素藥物質(zhì)量濃度的分析方法有多種，包括免疫分析法[5]、HPLC法[6]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[7-12]。盡管免疫分析法的速度快、操作方便，但該方法的特異性和靈敏度不高，需要特定的設(shè)備[13]。HPLC法的紫外或熒光檢測(cè)器對(duì)分析物的結(jié)構(gòu)選擇性不高，且需要將分析物與內(nèi)源性物質(zhì)完全分離，因此分析時(shí)間較長(zhǎng)[14]。LC-MS/MS法是一種靈敏度高、結(jié)構(gòu)選擇性強(qiáng)的分析方法。目前文獻(xiàn)報(bào)道的LC-MS/MS法測(cè)定萬(wàn)古霉素質(zhì)量濃度包括在線樣品萃取和柱切換技術(shù)[8]、三氟乙酸和甲醇[9]、三氯乙酸[10]或乙腈[11-12]沉淀蛋白。這些方法采用離子對(duì)色譜或正相色譜，萃取過(guò)程較復(fù)雜，在線樣品萃取費(fèi)用較高。只有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定去甲萬(wàn)古霉素質(zhì)量濃度的方法，包括熒光偏振免疫[15]、HPLC法[16]和LC-MS/MS法[17]，但這些方法靈敏度較低。

本研究的目的是建立一種簡(jiǎn)單的反相色譜測(cè)定血漿中萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的LC-MS/MS法，結(jié)果表明，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確和可靠，可用于血藥質(zhì)量濃度的監(jiān)測(cè)。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器 Thermo TSQ Endura型三重四極桿質(zhì)譜儀(配有可加熱電噴霧離子源)，戴安Ultimate 3000型高效液相色譜儀(配有HGP-3200RS型雙梯度泵、SRD-3200型真空脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器)(美國(guó)Thermo公司)；Basic型電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；AllegraTM×-22R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；Elix@3純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.1.2試藥 萬(wàn)古霉素(批準(zhǔn)文號(hào)H20140174)和去甲萬(wàn)古霉素(批準(zhǔn)文號(hào)H13020286)均購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；甲醇和甲酸均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)默克公司；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2方法

1.2.1色譜條件 色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ (100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流動(dòng)相：1 mL·L-1甲酸水溶液(A)-甲醇(B)；流速：0.3 mL·min-1。梯度洗脫程序：0～1.5 min，90%A；1.5～3 min，90%～40%A，并保持4 min；7～7.5 min,40%～90%A，保持0.5 min。分析時(shí)間：8 min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件離子源 離子源：可加熱電噴霧(HESI)離子源；檢測(cè)方法：正離子模式檢測(cè)；電噴霧電壓：3 500 V，離子源蒸發(fā)溫度：400 ℃；離子傳輸管溫度：300 ℃。掃描方法為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)，萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)離子對(duì)分別為m/z725.7→144.2，m/z718.3→144.2和m/z338.3→296.0，套管透鏡補(bǔ)償電壓分別為164，164和167 V，碰撞能量分別為33，33和17 V。碰撞氣氬氣的壓力為1.5 mTorr，鞘氣(N2)和輔助氣(N2)壓力分別為35和8 Arb。萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素和利奈唑胺的駐留時(shí)間均為200 ms。

1.3儲(chǔ)備液、對(duì)照品溶液和對(duì)照血漿樣品的制備 精密稱(chēng)取萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素對(duì)照品各10 mg，置于10 mL量瓶中，加純水溶解并稀釋至刻度，分別配制成質(zhì)量濃度為 1 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取上述萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素儲(chǔ)備液，分別用純水稀釋成質(zhì)量濃度為0.2，0.4，1，5，10，100和200 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

取180 μL空白血漿，分別加入10 μL不同質(zhì)量濃度的萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液，制備萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素終質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.05，0.25，0.5，2.5，5和10 μg·mL-1的對(duì)照血漿樣品?？瞻籽獫{中加入不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，制備萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素終質(zhì)量濃度為0.02，0.25和8 μg·mL-1的質(zhì)控樣品。

1.4血漿樣品的前處理 取200 μL空白血漿，置于EP管中，加入10 μL質(zhì)量濃度為500 ng·mL-1的利奈唑胺內(nèi)標(biāo)溶液，再加入40 μL高氯酸沉淀蛋白，渦旋30 s。加入400 μL的純化水，渦旋30 s，以提高萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的回收率，以11 750 r·min-1離心15 min后加入50 μL二氯甲烷，渦旋30 s。取20 μL上清液進(jìn)樣分析。

1.5方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1專(zhuān)屬性 通過(guò)對(duì)比空白血漿、分別加入萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液或內(nèi)標(biāo)溶液的空白血漿以及給藥后患者的血漿樣品色譜圖，考察該方法的專(zhuān)屬性。

1.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取空白血漿180 μL，分別加入10 μL萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液和利奈唑胺內(nèi)標(biāo)溶液，血漿中萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的理論質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.05，0.25，0.5，2.5，5和10 μg·mL-1。按照1.4項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，分別以萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的峰面積與內(nèi)標(biāo)利奈唑胺峰面積的比值對(duì)其質(zhì)量濃度作圖，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得加權(quán)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3定量下限和最低檢測(cè)限 取空白血漿180 μL，加入10 μL萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素對(duì)照品溶液，進(jìn)行樣品處理后進(jìn)樣分析，當(dāng)信噪比(S/N)為10時(shí)的檢測(cè)質(zhì)量濃度為本方法的定量下限(LLOQ)，當(dāng)信噪比(S/N)為3時(shí)的檢測(cè)質(zhì)量濃度為本方法的最低檢測(cè)限(LLOD)。

1.5.4精密度與準(zhǔn)確度 平行制備高、中、低質(zhì)控樣品各5份，1 d內(nèi)進(jìn)樣分析，計(jì)算日內(nèi)精密度RSD值和準(zhǔn)確度(以相對(duì)誤差表示)；連續(xù)5 d進(jìn)樣分析，計(jì)算日間精密度和準(zhǔn)確度。要求日間和日內(nèi)精密度RSD值小于15%，日間和日內(nèi)的相對(duì)誤差在±15%之內(nèi)。

1.5.5提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 取180 μL空白血漿，分別加入10 μL萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素質(zhì)控溶液和利奈唑胺溶液，按照1.4項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，得峰面積A。取空白血漿，按照1.4項(xiàng)下方法處理，取620 μL上清液，分別加入10 μL萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素質(zhì)控溶液和利奈唑胺溶液，進(jìn)樣分析得峰面積B。取620 μL水，分別加入10 μL萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素質(zhì)控溶液和利奈唑胺溶液，進(jìn)樣分析得峰面積C。A/B為本方法的提取回收率，B/C為本方法的基質(zhì)效應(yīng)。

1.5.6穩(wěn)定性 將質(zhì)量濃度為0.02，0.25和8 μg·mL-1萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的血漿樣品反復(fù)凍融3次，室溫下保存24 h(短期穩(wěn)定性)和-80 ℃保存1個(gè)月(長(zhǎng)期穩(wěn)定性)后進(jìn)行分析，考察萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的穩(wěn)定性。

1.5.7稀釋效應(yīng) 用空白血漿將質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1的萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素血漿樣品稀釋10倍，經(jīng)1.4項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，考察稀釋對(duì)質(zhì)量濃度測(cè)定的影響。

1.6治療藥物監(jiān)測(cè)應(yīng)用 將LC-MS/MS法應(yīng)用于萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素治療藥物的監(jiān)測(cè)。萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素血藥質(zhì)量濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，在下一次給藥前采集谷質(zhì)量濃度血樣，離心后收集血漿樣品進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

2 結(jié)果

2.1LC-MS/MS法的建立 本研究的目的是建立一種測(cè)定人血漿中萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素質(zhì)量濃度的LC-MS/MS法，并應(yīng)用于治療藥物監(jiān)測(cè)。萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素母離子和子離子全掃描譜圖見(jiàn)圖2。m/z1 450.7和m/z1 436.4的萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的[M+H]+峰觀測(cè)不到，但分子離子峰分別出現(xiàn)在m/z725.7和m/z718.3。說(shuō)明萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素帶雙電荷，這是因?yàn)槿f(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素具有多個(gè)可離子化的堿性基團(tuán)。根據(jù)萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的子離子譜圖，選擇萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的子離子m/z144.2作為定量離子。因此，萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為m/z725.7→144.2和m/z718.3→144.2。

萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的親水性強(qiáng)，文獻(xiàn)報(bào)道采用離子對(duì)色譜[11]和正相色譜[12]分離萬(wàn)古霉素和內(nèi)源性物質(zhì)。本研究采用梯度洗脫，用反相色譜柱分離萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素和內(nèi)源性物質(zhì)。開(kāi)始時(shí)，低甲醇相(10%)保持1.5 min，甲醇相在1.5 min內(nèi)逐漸增加至60%，并保持4 min，高比例的有機(jī)相有利于分析物的電離。見(jiàn)圖3。由圖3可知，萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素和利奈唑胺的保留時(shí)間分別為3.67，3.71和4.62 min，說(shuō)明分析物達(dá)到了較好的色譜分離。

圖2萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素母離子和子離子全掃描譜圖

A.萬(wàn)古霉素母離子；B.去甲萬(wàn)古霉素母離子；C.萬(wàn)古霉素子離子；D.去甲萬(wàn)古霉素子離子。

Fig.2 Full scan mass spectra for the parent and product of vancomycin and norvancomycin

A.parent ion for vancmycin；B.parent ion for norvancmycin；C.product ion for vancmycin；D.product ion for norvancmycin.

蛋白沉淀或有機(jī)試劑萃取通常用于提取分析物，但由于萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素難溶于有機(jī)試劑，因此不能采用有機(jī)試劑萃取，用甲醇或乙腈沉淀蛋白導(dǎo)致萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的靈敏度降低。實(shí)驗(yàn)選擇高氯酸沉淀蛋白，以增加分析物的靈敏度，高氯酸沉淀蛋白后萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的回收率約為50%。為了提高回收率，蛋白沉淀后加入不同體積的水，回收率隨水體積的增加而增大。但水稀釋了樣品，降低了靈敏度，因此選擇加入2倍體積的水，萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的回收率大于70%。

生物樣品中內(nèi)源性物質(zhì)引起的基質(zhì)效應(yīng)是LC-MS/MS分析中的一個(gè)難點(diǎn)，血漿中極為豐富的磷脂是基質(zhì)效應(yīng)的主要來(lái)源[17-18]。二氯甲烷是提取脂類(lèi)的良好溶劑[17]，用于減少基質(zhì)效應(yīng)。蛋白質(zhì)沉淀后，用二氯甲烷萃取上清液以降低基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果顯示二氯甲烷萃取后無(wú)明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

2.2方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1專(zhuān)屬性 在空白血漿中分別加入萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素或內(nèi)標(biāo)溶液(萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素終質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1)其與用藥后患者血漿的色譜圖見(jiàn)圖3。萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素和利奈唑胺的保留時(shí)間分別為3.67，3.71和4.62 min，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的檢測(cè)無(wú)干擾。

圖3萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的典型色譜圖

A.空白血漿；B.空白血漿中分別加入萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素和內(nèi)標(biāo)溶液(萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的終質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1)；C.患者使用萬(wàn)古霉素或去甲萬(wàn)古霉素后的血漿。

Fig.3 Typical chromatograms of vancomycin and norvancomycin

A.blank plasma；B.blank plasma spiked with vancomycin，norvancomycin or internal standard (final concentration of vancomycin and norvancomycin was 5 μg·mL-1)；C.trough blood samples collected from patients received vancomycin or norvancomycin therapy.

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別以血漿中萬(wàn)古霉素或去甲萬(wàn)古霉素的質(zhì)量濃度為自變量(x)，對(duì)其峰面積與利奈唑胺峰面積的比值(y)作圖，以1/C2為權(quán)重，進(jìn)行最小二乘法線性回歸，得血漿樣品中萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。連續(xù)3 d制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素質(zhì)量濃度在0.01～10 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限的實(shí)際質(zhì)量濃度和理論質(zhì)量濃度的誤差在±20%以?xún)?nèi)，其他質(zhì)量濃度的誤差在±15%以?xún)?nèi)。

表1萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素3條標(biāo)準(zhǔn)曲線

Tab.1 Calibration curves of vancomycin and norvancomycin in 3 runs

分析物參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線1標(biāo)準(zhǔn)曲線2標(biāo)準(zhǔn)曲線 3x±s萬(wàn)古霉素斜率0.002 00.002 40.002 80.002 4±0.000 4 截距-0.014 0-0.004 0-0.014 0-0.011 0±0.006 0 r0.998 50.993 40.993 50.995 1±0.003 0 去甲萬(wàn)古霉素斜率0.002 20.002 60.002 60.002 5±0.000 2 截距-0.008 00.013 6-0.018 0-0.004 2±0.016 2 r0.994 60.996 70.997 50.996 3±0.001 5

2.2.3最低檢測(cè)限和定量下限 萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的最低檢測(cè)限和定量下限分別為3和10 g·mL-1。

2.2.4精密度和準(zhǔn)確度 萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間精密度RSD值均小于15%，準(zhǔn)確度誤差在±15%之內(nèi)，符合體內(nèi)生物樣品分析的要求。結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度

分析物理論質(zhì)量濃度/ng·mL-1實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度/ng·mL-1相對(duì)誤差/%RSD/%萬(wàn)古霉素2018.32±2.61-8.4014.25250246.20±17.58-1.527.148 0007 853.90±216.77-1.832.76去甲萬(wàn)古霉素2019.16±1.84-4.209.60250275.68±24.0710.278.738 0009 174.35±377.0714.684.11

2.2.5基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率 萬(wàn)古霉素低、中和高質(zhì)控樣品的回收率分別為74.16%±8.13%，76.57%±5.73%和76.79%±7.18%，去甲萬(wàn)古霉素低、中和高質(zhì)控樣品的回收率分別為73.01%±6.23%，77.71%±5.14%和81.11%±6.86%，符合體內(nèi)生物樣品分析的要求。萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的基質(zhì)效應(yīng)分別為98.86%～108.69%和95.97%～109.64%，說(shuō)明無(wú)顯著的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表4。內(nèi)標(biāo)物的回收率和基質(zhì)效應(yīng)分別為74.07%±1.24%和118.17%±6.42%。

2.2.6穩(wěn)定性 萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素血漿樣品在反復(fù)凍融3次、室溫下保存24 h和-80 ℃保存1個(gè)月的穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素血漿樣品在上述條件下穩(wěn)定。

表3萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素日間精度度和準(zhǔn)確度

分析物理論質(zhì)量濃度/ng·mL-1實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度/ng·mL-1相對(duì)誤差/%RSD/%萬(wàn)古霉素2016.01±2.03-19.9512.68250227.05±15.19-9.186.698 0008 888.59±50.6611.110.57去甲萬(wàn)古霉素2017.16±1.72-14.2010.02250243.85±29.28-2.4612.018 0006 914.33±212.27-13.573.07

表4萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

分析物理論質(zhì)量濃度/ng·mL-1回收率/%基質(zhì)效應(yīng)/%萬(wàn)古霉素2074.16±8.13102.99±11.1725076.57±5.73108.69±9.348 00076.79±7.1898.86±6.82去甲萬(wàn)古霉素2073.01±6.23108.63±10.9725077.71±5.14109.64±8.118 00081.11±6.8695.97±8.70

2.2.7稀釋效應(yīng) 血漿稀釋后測(cè)定值與理論值進(jìn)行比較，萬(wàn)古霉素的相對(duì)誤差和RSD值分別為8.41%和8.35%，去甲萬(wàn)古霉素的相對(duì)誤差和RSD值分別為0.20%和1.48%。二者的相對(duì)誤差和RSD值均小于15%，結(jié)果表明本方法可用于測(cè)定質(zhì)量濃度高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限的樣品。

表5萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素樣品的穩(wěn)定性結(jié)果

穩(wěn)定性分析物理論質(zhì)量濃度/ng·mL-1實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度/ng·mL-1相對(duì)誤差/%RSD/%凍融穩(wěn)定性萬(wàn)古霉素2020.391.956.96250248.67-0.5312.128 0007 780.04-2.753.61去甲萬(wàn)古霉素2023.2718.606.58250284.1213.657.058 0008 586.467.3312.65短期穩(wěn)定性(室溫下保存24 h)萬(wàn)古霉素2019.34-3.306.93250278.6511.466.018 0009 074.2613.431.58去甲萬(wàn)古霉素2019.38-3.1010.58250285.9314.3710.578 0008 142.731.783.89長(zhǎng)期穩(wěn)定性(-80 ℃保存1個(gè)月)萬(wàn)古霉素2016.94-15.3012.40250241.76-3.307.218 0008 994.0712.434.87去甲萬(wàn)古霉素2019.21-3.9514.06250254.671.876.158 0008 283.833.558.36

2.2.8治療藥物監(jiān)測(cè)應(yīng)用 對(duì)接受推薦劑量萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素治療的患者進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)，萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的穩(wěn)態(tài)谷質(zhì)量濃度分別見(jiàn)圖4A和4B。52.94%的患者達(dá)到萬(wàn)古霉素的治療窗(10～20 μg·mL-1)，33.82%的患者低于治療窗，而13.24%的患者高于治療窗。45.45%的患者達(dá)到去甲萬(wàn)古霉素的治療窗(5～10 μg·mL-1)，9.09%的患者低于治療窗，而45.45%的患者高于治療窗。因此，治療藥物監(jiān)測(cè)對(duì)確保萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素療效及降低毒性和不良反應(yīng)是很有必要的。

圖4接受推薦劑量治療患者的萬(wàn)古霉素(A)去甲萬(wàn)古霉素(B)穩(wěn)態(tài)谷質(zhì)量濃度

Fig.4 Steady state trough concentration of vancomycin (A) and norvancomycin (B) in patients received recommended dose

3 討論

LC-MS/MS法與HPLC法相比，具有靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)、分析時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。本研究建立的LC-MS/MS法與已有的方法相比有以下優(yōu)點(diǎn)：①可同時(shí)測(cè)定萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的質(zhì)量濃度，方法適用性強(qiáng)。②血樣前處理采用簡(jiǎn)單的高氯酸沉淀蛋白，與文獻(xiàn)報(bào)道的在線樣品萃取和柱切換[10]、乙腈提取樣品后蒸干和復(fù)溶后分析[14]等方法相比，樣品前處理簡(jiǎn)單、方便和省時(shí)。③高氯酸沉淀蛋白后萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的回收率為50%，由于分析物在水中的高溶解性，當(dāng)加入2倍體積的水渦旋后，萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的回收率大于70%。④使用梯度洗脫，用反相色譜柱分離萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素和內(nèi)源性物質(zhì)，萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為3.67，3.71和4.62 min。未觀察到顯著的基質(zhì)效應(yīng)，說(shuō)明被測(cè)物與內(nèi)源性基質(zhì)達(dá)到了較好的分離。⑤用利奈唑胺作為內(nèi)標(biāo)，相對(duì)于用氘代內(nèi)標(biāo)，更易獲得，且滿足分析的需求。⑥本方法的定量下限為10 ng·mL-1，可滿足低質(zhì)量濃度樣本的測(cè)定需求。

本研究建立了一種簡(jiǎn)單、快速、可靠以及能同時(shí)測(cè)定人血漿中萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的LC-MS/MS法，該方法具有高選擇性和靈敏度，已應(yīng)用于萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素治療藥物監(jiān)測(cè)，52.94%和45.45%的患者分別達(dá)到萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的治療窗，表明治療藥物監(jiān)測(cè)對(duì)確保萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素療效及降低毒性和不良反應(yīng)很有必要。