孔玉方，王慧煜，韓雪清

(中國檢驗檢疫科學研究院,北京 大興100176)

隨著人們生活水平的提高,肉、蛋、奶類在人們?nèi)粘２妥郎铣霈F(xiàn)的數(shù)量猛增。因此,動物食品安全問題成為我國市場監(jiān)督管理部門關(guān)注的重點。很多家畜因感染某些疾病,致使肉、蛋、奶中帶入傳染源,此類疾病傳染性強,危害大,嚴重威脅人類健康。因此,早期快速檢測對預防控制此類疾病的發(fā)生發(fā)展具有重大意義。膠體金免疫層析技術(shù)由于標記物制備簡單、方法敏感、特異,不需要使用任何放射性同位素,應用范圍廣,如病原體、藥物、激素、代謝物檢測及飼料/食品和環(huán)境指標的監(jiān)測[1]。該技術(shù)在食源性傳染病檢測方面的相關(guān)報道較少,因此本文就膠體金免疫層析技術(shù)在常見食源性傳染病檢測中的研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 膠體金免疫層析技術(shù)

1.1 膠體金層析技術(shù)原理 膠體金免疫層析技術(shù)(Colloidal gold immunochroma-tography assay,GICA)是一種以膠體金作為標記物應用于檢測特定抗原或抗體的一種新型免疫標記技術(shù)。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷,可與帶正電荷集團的蛋白質(zhì)分子牢固結(jié)合,由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合,所以對蛋白質(zhì)的生物特性不會產(chǎn)生任何影響。除蛋白質(zhì)外膠體金還可以與其他生物大分子結(jié)合,如ConA、PHA、SPA 等。膠體金免疫標記技術(shù)主要利用了顆粒金具有高電子密度的特性,在金標蛋白結(jié)合處,在顯微鏡下可見黑褐色顆粒,當這些標記物在相應的配體處大量聚集時,肉眼可見紅色或粉紅色斑點,因此可用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中[2]。該技術(shù)成為繼酶標記、熒光素和放射性同位素技術(shù)之后的又一重要的現(xiàn)代新型免疫標記技術(shù)。GICA技術(shù)已經(jīng)成為目前檢測食源性傳染病致病菌最快速、敏感和特異的免疫學檢測方法之一。

1.2 膠體金免疫層析技術(shù)的優(yōu)點 近年來發(fā)展起來的免疫分析法、基因生物芯片、生物傳感器和PCR 等檢測技術(shù)被廣泛應用于常見食源性傳染病中。其中GICA 技術(shù)操作簡單、生產(chǎn)成本低、檢測范圍廣,不需要儀器設(shè)備檢測；檢測速度快,一般在5 ～15 min 就可得到肉眼可見的結(jié)果,可用于現(xiàn)場大批量樣品的檢測和流行病普查；GICA 試紙條穩(wěn)定性好,室溫可保存12 ～24 個月,檢測結(jié)果室溫下保存時間較長；GICA 試紙條在臨床檢驗中可用于檢測尿、唾液、全血、血清、血漿、體液等樣品僅需簡單處理或不處理即可檢測,且樣品用量極少。鑒于上述GICA 試紙條的優(yōu)點,該技術(shù)比較適合食源性暴發(fā)流行病的現(xiàn)場即時檢驗等[3]。

2 膠體金免疫層析技術(shù)在病原生物檢測中的應用

2.1 病原微生物方面的檢測

2.1.1 細菌疾病 布魯菌病是一種急慢性食源性人獸共患傳染病,人主要通過接觸病畜的流產(chǎn)物、乳、肉、皮毛而感染,當人的機體免疫力下降時,病原菌就會進入血液,形成菌血癥。目前膠體金免疫層析技術(shù)由于標記物制備簡單,檢測速度快、敏感性高和樣品用量極少的優(yōu)點,被廣泛的應用到食源性傳染病的檢測中。董浩等[4]采用GICA 和虎紅平板凝集試驗(RPST)對牛血清和羊血清進行了檢測,結(jié)果GICA 檢測法敏感性高于RPST 法,可有效的應用于家畜布病初篩試驗當中?？子穹降萚5]將布魯菌病表達純化的OMP22 和OMP28 重組蛋白作為檢測抗原,膠體金表面標記OMP22 和OMP28,制備膠體金免疫層析試紙條分別檢測牛、羊血清各100 份,與虎紅平板凝集試驗和ELISA 試劑盒的檢測結(jié)果符合率分別為97.4%和95%,檢測布魯菌病標準陽性血清的最低稀釋度達1∶128。結(jié)果表明,該試紙條敏感性高、特異性強的特點。

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌引發(fā)的一種人獸共患慢性傳染病,牛是該病的易感動物,人多因食用感染病牛的牛奶、奶制品和肉類等而感染。人結(jié)核與牛結(jié)核可相互感染,禽結(jié)核也可感染牛和人。人感染結(jié)核后,治療不及時極易造成患者死亡。牛結(jié)核病的流行傳染,縮短了奶牛的壽命,產(chǎn)奶量逐漸降低,母牛的受孕率降低。,GICA 在預防此類疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重大作用。Mduli 等[6]和Wassie 等[7]制備能夠檢測人結(jié)核分枝桿菌的GICA 試紙條,該試紙條具有較好的檢測效果。李霜君等[8]采用GICA 法檢測結(jié)核病患者和健康人血清樣本中的特異性結(jié)核抗體IgG/IgM,結(jié)果該方法檢測特異性結(jié)核抗體IgG/IgM 的特異性為91.67%,可用于結(jié)核病的篩查。

沙門菌病是由革蘭陰性桿菌引發(fā)的一種常見食源性人獸共患病,人在食用被沙門菌污染的食物12 ～72 h 后,短時間內(nèi)就會出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、發(fā)熱,嚴重者出現(xiàn)敗血癥或?qū)е禄颊咚劳觥Ｎ覈磕暧猩抽T菌造成的食物中毒事件占食品中毒總事件的40%～60%。因此,快速、高效的檢測沙門菌具有重要意義。劉志科等[9]研制了一種雞白痢沙門菌試紙條,檢測臨床采集的血清并用平板凝集試驗對其準確性進行驗證,結(jié)果與平板凝集試驗的符合率達96.43%。劉景武等[10]研制了一種以膠體金標記沙門菌血清抗體,用于檢測氯化鈉洛液、沙門菌、大腸桿菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、變形桿菌、小腸結(jié)腸耶爾森菌等細菌,結(jié)果21 株沙門菌均為陽性而其他的檢測結(jié)果均為陰性,靈敏度為106CFU/mL。

2.1.2 病毒疾病 口蹄疫是由口蹄疫病毒引發(fā)的既可嚴重侵害家畜、野生動物又可感染人的一種高度傳染、急性烈性熱性接觸性和復雜多變的傳染病。人通過與患病動物直接接觸,或者接觸到帶毒氣溶膠或污染的食物,特別是被污染的牛奶而感染。林彤等[11]制備的FMDV AsiaⅠ型的膠體金試紙條,用于檢測豬水皰病病毒和FMDV 的其他血清型無交叉反應發(fā)生,而且該試紙條與其他常規(guī)檢測方法的符合率達98.8%。Jiang 等[12]研制了一種檢測FMDV 的雙抗體夾心GICA 法,該方法檢測時間為15 min,靈敏度為11.7 ng/mL。

2.2 寄生蟲方面的檢測 旋毛蟲病是一種呈世界性分布的食源性人獸共患寄生蟲病,人多生食或半生食含有旋毛蟲幼蟲囊包的豬肉及肉制品而感染。旋毛蟲病需在橫紋肌里查找和摘取囊包幼蟲壓片鏡檢,取材困難,檢出率僅為50%左右,導致臨床診斷極度困難[13],秦銀霞等[14]以膠體金標記葡萄球菌蛋白A(SPA)和旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌抗原構(gòu)建免疫層析試紙條,用于檢測旋毛蟲感染血清,結(jié)果試紙條對旋毛蟲病患者、豬血清檢測率為100%,旋毛蟲感染小鼠的檢出率為97.87%。表明試紙條實用強。

廣州管圓線蟲病是一種新現(xiàn)的腦內(nèi)食源性人獸共患寄生蟲病,主要侵犯人的中樞神經(jīng)。人多因生食或半生食被三期幼蟲污染的水生動物而感染。目前,金標病原學檢測需從患者的腦脊液或其他部位查到Ⅳ期或Ⅴ期幼蟲,才可確診,由于寄生位置特殊,致使漏診誤診率高,。郝振華等[15]建立了一種適用于基層檢測廣州管圓線蟲病的試紙條,用于檢測小鼠陽性血清抗體。結(jié)果該方法檢測的敏感性和特異性均為100%。膠體金免疫層析法有望應用于廣州管圓線蟲病現(xiàn)場流行病學調(diào)查和臨床快速篩查。

鏈狀帶絳蟲[Taenia solium(Linnaeus,1758)]人多因誤食生的或未煮熟的含活囊尾蚴的豬肉而感染。確診豬帶絳蟲病的免疫學診斷主要是通過檢測血清中特異性抗體,采用的抗原主要是排泄分泌抗原、囊液抗原和成蟲抗原,由于這些抗原成分復雜,獲取和純化操作比較繁瑣。張少華等[16]建立了一種以膠體金標記豬帶絳蟲六鉤蚴重組蛋白(TSOL18)的雙抗原夾心試紙條,用于檢測豬血清樣品,結(jié)果該試紙條檢測的敏感性和特異性分別為75%和95.2%。

3 展望

膠體金免疫層析技術(shù)以其生產(chǎn)成本低、操作簡單、檢測快速、敏感、特異,結(jié)果肉眼可觀,不需要其他設(shè)備儀器等優(yōu)點被廣泛應用于食源性人獸共患傳染病現(xiàn)場檢測和臨床快速診斷中,成為當今學者研究的熱點。但膠體金免疫層析技術(shù)尚存在不足之處,如靈敏度低,假陽性、假陰性,重復性不高和定量不準確等問題。中國檢科院劉佳佳等[17]制備了一種牛布魯菌熒光標記免疫層析試紙條,最低可檢測出1∶100 牛布魯菌標準陽性血清,并且與商品化的ELISA 試劑盒符合率達93.5%,表明熒光標記的試紙條靈敏度更高。李廣強等[18]采用量子點標記技術(shù)檢測布病,檢測布病抗體的敏感性為99%,特異性為95.8%。相信隨著熒光量子點和鑭系金屬等標記技術(shù)的不斷成熟可有效的提高免疫標記技術(shù)的敏感性、特異性,并實現(xiàn)高通量檢測,定量或半定量檢測是將來該技術(shù)發(fā)展的主要趨勢。