魯玉杰 袁 園 劉鳳杰 王爭(zhēng)艷 何向楠

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院；河南省小麥儲(chǔ)藏協(xié)同創(chuàng)新中心 ，鄭州 450001)

小麥粉中害蟲碎片的數(shù)量是面粉質(zhì)量等級(jí)的劃分的重要指標(biāo)。在國(guó)際貿(mào)易中銷售的不同等級(jí)的小麥粉中害蟲碎片的含量在各個(gè)國(guó)家有不同的規(guī)定，加拿大健康保護(hù)協(xié)會(huì)規(guī)定每50 g小麥粉樣品中含有少于20個(gè)大于0.2 mm的昆蟲碎片[1]。而美國(guó)食品和藥物管理局規(guī)定禁售程度為每50 g小麥粉中含有75個(gè)或更多的昆蟲碎片[2]。在歐洲，對(duì)小麥粉中害蟲碎片的量也有一些限制。近年來，夏季面粉廠最頭疼的是面粉蟲害問題[3]。小麥粉生蟲還嚴(yán)重影響面粉的質(zhì)量和出口貿(mào)易[4]。目前害蟲數(shù)量的檢測(cè)方法沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。染色法[3]、近紅外光譜檢測(cè)法[5]、磷鎢酸檢測(cè)尿酸法[6]、浮選法[7]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法[8]、高效液相色譜法[9]等是近幾年研究的熱點(diǎn)，但目前還沒有一種快速準(zhǔn)確的方法并在實(shí)際中得到推廣。DNA(脫氧核糖核酸)是細(xì)胞染色體中的遺傳基因，其分子各個(gè)片段就代表各個(gè)遺傳信息[10]。由于DNA指紋圖譜直接反映DNA水平上的差異，它成為當(dāng)今應(yīng)用廣泛的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)。目前，DNA指紋技術(shù)在昆蟲領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在系統(tǒng)演化及分類鑒定兩方面[11-12]。Balasubramanian等[13]利用DNA指紋技術(shù)能夠檢測(cè)小麥粉中赤擬谷盜和雜擬谷盜成蟲的碎片，其靈敏度為小麥粉中1.0%的害蟲感染水平。本研究為開發(fā)小麥粉中快速有效的檢測(cè)害蟲的技術(shù)，利用了昆蟲的延長(zhǎng)因子基因EF1為目的基因的DNA分子指紋圖譜技術(shù)對(duì)小麥粉中的常見的赤擬谷盜Triboliumcastaneum、雜擬谷盜Triboliumconfusum和鋸谷盜Oryzaephilussurinamensis的碎片、幼蟲和卵進(jìn)行了檢測(cè)，并抽取了面粉廠中樣品對(duì)其幼蟲含量進(jìn)行了靈敏度和準(zhǔn)確率的驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 蟲源

試蟲赤擬谷盜Triboliumcastaneum，雜擬谷盜Triboliumconfusum和鋸谷盜Oryzaephilussurinamensis采自河南省鄭州市，在河南工業(yè)大學(xué)儲(chǔ)糧生態(tài)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)數(shù)代后備用。選用蟲齡、生理狀態(tài)一致的赤擬谷盜、雜擬谷盜、鋸谷盜(成蟲、幼蟲和蟲卵)。赤擬谷盜和雜擬谷盜的飼料為全麥粉∶碎麥?！媒湍?9∶3∶1)；鋸谷盜的飼料配比為：全麥粉∶碎麥?！醚帑溒媒湍?5∶3∶3∶1)。在溫度(30±2) ℃，濕度(70±5)%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 供試小麥粉

選用無蟲且品質(zhì)較好的小麥，將其除去雜質(zhì)后用自來水洗干凈，放入烘箱中60 ℃烘2～3 h，將小麥的含水量調(diào)至(14±0.5)%。將小麥取出冷卻至室溫，用實(shí)驗(yàn)室小麥磨粉機(jī)磨成小麥粉。小麥粉經(jīng)過80目篩子，篩去大于80目篩孔的小麥粉或面團(tuán)，篩下物即為所需的小麥粉樣品。一部分小麥粉用于所需蟲源的飼料，一部分作為DNA提取時(shí)所需的小麥粉樣品。

1.2 方法

1.2.1 兼并引物設(shè)計(jì)

以鞘翅目模式昆蟲赤擬谷盜的延長(zhǎng)因子(GB：HM156722.1 ；GI：299152241)基因序列為模板，在NCBI中找到赤擬谷盜的基因序列，找出其編碼序列。將基因的編碼序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，在比對(duì)結(jié)果中挑選不同的昆蟲的序列。利用Clustalx軟件選取出相同的基因序列，兼并引物的設(shè)計(jì)在18～22個(gè)堿基，同一列不同的堿基用其他的字母代替，不同的引物組合如表1所示。

1.2.2 不同的昆蟲基因組的提取

從赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜中提取的基因組，采用Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物(上海)有限公司生產(chǎn)]說明書，其方法步驟略。

1.2.3 PCR反應(yīng)條件

不同昆蟲PCR反應(yīng)的條件按照梯度PCR進(jìn)行條件的設(shè)定，然后得到一個(gè)確定的反應(yīng)條件赤擬谷盜不同蟲態(tài)的反應(yīng)條件為：94 ℃，預(yù)變性5 min；94 ℃，變性30 s和56 ℃退火45 s；72 ℃延伸30 s的35個(gè)循環(huán)；72 ℃，延伸10 min；16 ℃保溫1 h之內(nèi)放入4 ℃的冰箱保存或者進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。雜擬谷盜、鋸谷盜不同蟲態(tài)的PCR反應(yīng)條件與赤擬谷盜條件基本一致，改良PCR反應(yīng)條件將退火溫度分別為改為48和50 ℃。

1.2.4 簡(jiǎn)并引物的篩選

從培養(yǎng)的雜擬谷盜和鋸谷盜試蟲中分別挑選數(shù)頭成蟲、幼蟲和蟲卵放入干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)。成蟲和幼蟲清水洗凈放入吸水紙吸干；往放有蟲卵的培養(yǎng)皿內(nèi)加入少量乙醇潤(rùn)濕，再加入適量稀硫酸(1∶19=V∶V)蓋上培養(yǎng)皿，放置于水浴鍋上蒸汽浴8 min，蟲卵表面的面粉被去掉，用布氏漏斗低壓抽濾，室溫晾干。用天平稱取50 mg小麥粉和占50 mg小麥粉總量的20%、10%、5%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.05%的不同昆蟲蟲態(tài)。稱量的昆蟲放入1.5 mL的無菌離心管中，離心管蓋上蓋子放入盛有液氮的小容器內(nèi)，放置3～5 min使之冷卻。然后取出離心管并打開蓋子使用組織研磨器進(jìn)行研磨至粉末狀，最后往離心管內(nèi)加入稱取的50 mg小麥粉混勻，每種處理重復(fù)3次。

1.2.5 不同質(zhì)量比例的目的基因條帶亮度值

以50 mg小麥粉為準(zhǔn)，分別將占20%、10%、5%、3%、1%、0.5%、0.1%和0.05%等的不同比例且不同蟲態(tài)的害蟲添加入小麥粉中，提取害蟲的目的基因并且進(jìn)行PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳。利用Tanon-2500凝膠成像分析儀和GIS-1D圖像分析軟件計(jì)算電泳圖中目的基因條帶的灰度值作為條帶亮度的定量值，計(jì)算出害蟲含量與條帶亮度的關(guān)系曲線。

1.2.6 DNA指紋檢測(cè)方法在面粉廠隨機(jī)抽樣檢驗(yàn)

在鄭州金苑面粉有限公司的倉庫隨機(jī)抽取幾袋小麥粉，每一袋小麥粉中抽取500 g放在實(shí)驗(yàn)室里，共抽取7份，每份樣品從抽取的面粉放在溫度(30±2) ℃，濕度(70±5)%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d后再分成兩份，一份進(jìn)行DNA指紋圖譜方法面粉蟲蟲卵的檢測(cè)，另一份利用篩選法對(duì)面粉中的幼蟲進(jìn)

表1 赤擬谷盜延伸因子十對(duì)兼并引物的序列

注：M：DNA Marker，DL1000 1-12：分別以赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜為模板表示50～60 ℃的3溫度梯度。圖1 不同引物組合在不同溫度下的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

行檢測(cè)得到實(shí)際的檢測(cè)數(shù)量。對(duì)比DNA指紋圖譜方法的害蟲含量與條帶亮度的關(guān)系方程計(jì)算理論的檢測(cè)量與時(shí)間的檢測(cè)數(shù)量進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種害蟲延長(zhǎng)因子基因片段擴(kuò)增引物的篩選

10對(duì)引物相互組合后按照梯度PCR的方法優(yōu)化對(duì)三種小麥粉中主要害蟲赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜延長(zhǎng)因子基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出引物EFS319和EFA758組合的PCR產(chǎn)物中，每個(gè)退火溫度的擴(kuò)增條帶都非常清晰，條帶大小符合目的片段且?guī)缀鯖]有引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，說明EFS319和EFA758這對(duì)引物可以有效擴(kuò)增出來特異性條帶，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。因此確定本研究延長(zhǎng)因子的正向引物EFS319：5′CGT GA(A/G) CGT GGT ATC ACC AT(T/C)G3′。反向引物EFA758：5′CCC TTG AAC CA(T/G) GGC AT(T/C) TTG 3′

2.2 DNA指紋技術(shù)檢測(cè)小麥粉中三種害蟲成蟲碎片的最低檢出限

小麥粉中分別加入不同含量的赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜成蟲碎片、幼蟲和卵。DNA指紋技術(shù)檢測(cè)后的電泳圖如圖2所示。

注：M為DL1000 Marker，其條帶片段長(zhǎng)度分別為：1 000、700、500、400、300、200和100 bp；1泳道為其目的基因片段；2～7依次是昆蟲碎片含量為20%、10%、5%、3%、2%和1%；8是小麥粉的基因片段；CK為空白對(duì)照，是在PCR體系中以無菌水代替目的基因的對(duì)照組，主要用作排除底物污染的確定。B和C為優(yōu)化PCR反應(yīng)條件后雜擬谷盜和鋸谷盜的檢測(cè)結(jié)果圖圖2 小麥粉中含赤擬谷盜(A)、雜擬谷盜(B)、鋸谷盜(C)碎片DNA檢測(cè)靈敏度

由圖2可知，當(dāng)成蟲碎片含量占20%時(shí)能檢測(cè)到，直到碎片含量占2%時(shí)仍能檢測(cè)，但當(dāng)赤擬谷盜碎片含量為1%時(shí)凝膠成像圖中沒有條帶。對(duì)PCR條件優(yōu)化后可以檢測(cè)雜擬谷盜、鋸谷盜碎片含量的最低檢測(cè)限為1%。

2.3 DNA指紋技術(shù)檢測(cè)小麥粉中三種害蟲幼蟲的最低檢出限

在小麥粉中分別加入不同含量的赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜幼蟲。DNA指紋技術(shù)檢測(cè)后的電泳圖如圖3所示。從圖3可以看出赤擬谷盜幼蟲含量最低檢測(cè)限是1%。對(duì)PCR條件優(yōu)化后可以檢測(cè)出雜擬谷盜、鋸谷盜的幼蟲含量最低達(dá)到0.05%。說明了DNA指紋檢測(cè)技術(shù)可以準(zhǔn)確判斷小麥粉中幼蟲的發(fā)生情況。

注：M為DL1000 Marker；1泳道為其目的基因片段；A中2～8依次為赤擬谷盜幼蟲含量為20%、10%、5%、3%、1%、0.5%，9為小麥粉的目的基因；B和C中2～10依次是幼蟲含量20%、10%、5%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.05%， B和C為優(yōu)化PCR反應(yīng)條件的檢測(cè)結(jié)果；11為小麥粉的目的基因；CK為空白對(duì)照。圖3 小麥粉中含赤擬谷盜(A)、雜擬谷盜(B)、鋸谷盜(C)幼蟲DNA檢測(cè)結(jié)果

2.4 DNA指紋技術(shù)檢測(cè)小麥粉中三種害蟲蟲卵的最低檢出限

在小麥粉中分別加入不同含量的赤擬谷盜、雜擬谷盜和鋸谷盜蟲卵。DNA指紋技術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出赤擬谷盜蟲卵含量最低檢測(cè)限是1%。對(duì)PCR條件優(yōu)化后可以檢測(cè)出來雜擬谷盜和鋸谷盜的卵最低的可以達(dá)到0.05%。說明了DNA指紋檢測(cè)技術(shù)可以準(zhǔn)確判斷小麥粉中蟲卵的發(fā)生情況。

注：M為DL1000 Marker；1泳道為其目的基因片段；A中2～7依次為赤擬谷盜卵的含量為20%、10%、5%、3%、1%、0.5%，8為小麥粉的目的基因；B和C中2～10依次為的雜擬谷盜和鋸谷盜卵含量20%、10%、5%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%和0.05%(PCR優(yōu)化條件后檢測(cè)結(jié)果)；11為小麥粉的目的基因；CK為空白對(duì)照。圖4 小麥粉中含赤擬谷盜(A)、雜擬谷盜(B)、鋸谷盜(C)卵DNA檢測(cè)靈敏度

2.5 DNA指紋圖譜亮度與小麥粉中不同害蟲碎片含量的相關(guān)性

將占50 mg小麥粉中含有不同含量的害蟲碎片進(jìn)行DNA檢測(cè)，檢驗(yàn)后的電泳條帶進(jìn)行亮度分析，得出害蟲碎片含量與電泳條帶亮度的線性關(guān)系如圖5所示。

圖5 小麥粉害蟲碎片含量與DNA電泳條帶亮度的關(guān)系

由圖5可知，DNA電泳條帶亮度(Y)與害蟲碎片含量(X)呈良好的相關(guān)關(guān)系。回歸方程為：Y=858.36X+74.540(r=0.961 9)。說明可以根據(jù)目的基因的瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度預(yù)測(cè)小麥粉中成蟲的數(shù)量。

2.6 DNA指紋檢測(cè)方法在面粉廠成蟲檢測(cè)中應(yīng)用

為了檢驗(yàn)DNA分子指紋圖譜檢測(cè)害蟲的準(zhǔn)確性，在面粉廠隨機(jī)取了7份小麥粉，用DNA指紋技術(shù)測(cè)定成蟲碎片的含量的檢測(cè)，根據(jù)實(shí)際害蟲發(fā)生的情況，利用害蟲含量與條帶亮度的關(guān)系進(jìn)行了預(yù)測(cè)，檢測(cè)值和預(yù)測(cè)值的結(jié)果比較如表2所示。

從表2可以看出：當(dāng)成蟲數(shù)量大于12以上才能檢測(cè)出條帶亮度。隨機(jī)取樣的小麥粉中害蟲的數(shù)量多，條帶亮度值越高；而且條帶亮度值隨著實(shí)際害蟲的數(shù)量增加而增加，說明了通過檢測(cè)目的基因的條帶亮度可以初步推測(cè)樣品中害蟲的感染程度。利用DNA指紋技術(shù)測(cè)定7份小麥粉樣品的害蟲含量與實(shí)際發(fā)生量相比，準(zhǔn)確率均在66.67%～80.56%。結(jié)果說明了利用DNA指紋技術(shù)測(cè)定的小麥粉害蟲含量可以預(yù)測(cè)小麥粉中害蟲的感染程度，但是檢測(cè)的準(zhǔn)確率有待提高。

表2 隨機(jī)7份小麥粉30 d后DNA指紋技術(shù)檢測(cè)和

注：表中“-”表示沒有檢測(cè)結(jié)果。

3 討論

Bennett[14]利用DNA指紋技術(shù)檢測(cè)水稻抗病蟲害的結(jié)果說明DNA指紋技術(shù)已經(jīng)提供了關(guān)于昆蟲和病原菌群體結(jié)構(gòu)獨(dú)特的信息。因此可以利用儲(chǔ)糧昆蟲具有基因結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性，采用DNA指紋技術(shù)進(jìn)行害蟲的檢測(cè)。Balasubramanian等[13]設(shè)計(jì)了兩對(duì)不同的兼并引物，用DNA指紋技術(shù)研究了小麥粉中赤擬谷盜和雜擬谷盜的碎片，其結(jié)果為害蟲碎片的最低檢出限為1%。本研究采用一對(duì)通用引物可檢測(cè)小麥粉中三種不同的害蟲，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、成本低廉。且幼蟲和蟲卵的檢測(cè)靈敏度顯著高于成蟲碎片的檢測(cè)。在檢測(cè)小麥粉中赤擬谷盜成蟲、幼蟲和卵時(shí)應(yīng)用的PCR擴(kuò)增條件的退火溫度是56 ℃，在檢測(cè)小麥粉中的雜擬谷盜和鋸谷盜時(shí)改良的PCR擴(kuò)增時(shí)的退火溫度分別為48和50 ℃，因此檢測(cè)出赤擬谷盜成蟲碎片時(shí)的最低檢出限為2%，而對(duì)雜擬谷盜和鋸谷盜的最低檢出限為1%。而且改良后的PCR條件可以提高幼蟲和卵的檢出限。說明了在DNA指紋技術(shù)檢測(cè)時(shí)PCR擴(kuò)增的條件優(yōu)化非常關(guān)鍵。

本研究還發(fā)現(xiàn)不同害蟲碎片含量與DNA片段電泳條帶亮度成正相關(guān)。對(duì)隨機(jī)取樣的面粉檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果準(zhǔn)確率最高可達(dá)80.56%。說明DNA指紋圖譜技術(shù)可以預(yù)測(cè)小麥粉中三種害蟲感染程度，但是檢測(cè)的準(zhǔn)確率有待提高。在以后的研究中DNA指紋技術(shù)不僅可用于定性還可以提高定量的準(zhǔn)確性。在應(yīng)用中可以開發(fā)一種快速檢測(cè)的試劑盒，對(duì)于快速檢測(cè)成品糧中害蟲的發(fā)生具有重要的指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

利用DNA分子指紋圖譜技術(shù)檢測(cè)成蟲碎片、幼蟲和蟲卵檢測(cè)限分別為1%、 0.05%和1%。說明此方法可以檢測(cè)成蟲碎片、幼蟲和卵。根據(jù)不同害蟲碎片含量(X)檢測(cè)出來DNA片段電泳條帶亮度(Y)之間的關(guān)系Y=858.36X+74.540(r=0.961 9)，說明兩者存在明顯的相關(guān)性。利用DNA檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)從面粉廠隨機(jī)抽取的樣品，發(fā)現(xiàn)實(shí)際結(jié)果和DNA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率可達(dá)80.56%。說明可以利用DNA分子指紋圖譜技術(shù)預(yù)測(cè)小麥粉中害蟲的感染程度。