宋士一, 李 瑩, 潘俊道, 許志丹, 楊 明

(沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽 110034)

0 引 言

肥胖人口不斷增加,現(xiàn)在已成為全球熱點(diǎn)問題[1]。在人類和大多數(shù)動(dòng)物模型中,肥胖不僅會(huì)增加脂肪組織的脂肪積累,還會(huì)導(dǎo)致其他組織和器官內(nèi)外的脂肪含量增加,即脂肪異位積累[2]。有研究證實(shí)肥胖及脂肪異位積累與2型糖尿病、心血管疾病等代謝病之間密切相關(guān)[3-4]。

脂肪組織作為重要的儲(chǔ)存能量器官,儲(chǔ)存脂肪能力是有限的,當(dāng)達(dá)到極限時(shí),血清甘油三酯和游離脂肪酸升高,導(dǎo)致非脂肪組織包括胰腺、心臟、肝臟、腎臟和血管壁中脂肪異位積累,導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡,這一過程被稱為脂毒性[5-6]。在肥胖人中,肝臟、骨骼肌或胰腺等器官的脂肪異位積累是胰島素抵抗的關(guān)鍵決定因素[7-9]。實(shí)驗(yàn)證實(shí),作為身體重要器官的心臟和腎臟,如果儲(chǔ)存了脂肪,就會(huì)引發(fā)心臟舒張功能不全,血壓上升且心率增加,腎功能變化等[10-13],這將直接危及生命。

自然界中的野生動(dòng)物,長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境溫度、食物資源等條件的變化,體重和體脂往往存在年周期的波動(dòng)。尤其是儲(chǔ)脂類冬眠的哺乳動(dòng)物如熊、旱獺、黃鼠等,通常在越冬前大量?jī)?chǔ)存身體脂肪,即“育肥”,完成脂肪積累后自發(fā)進(jìn)入冬眠,并將身體脂肪作為冬眠期的能源逐漸消耗[14-15]。為探究這些動(dòng)物的肥胖是否也存在脂肪的異位積累,是否存在肥胖導(dǎo)致相關(guān)代謝疾病的風(fēng)險(xiǎn),本實(shí)驗(yàn)用具有冬眠習(xí)性的嚙齒動(dòng)物達(dá)烏爾黃鼠(Spermophilusdauricus)作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?探究其育肥過程中重要器官脂肪的積累情況。

達(dá)烏爾黃鼠隸屬于松鼠科黃鼠屬,主要分布于古北界蒙新區(qū),其年周期的生活史特征是每年春季交配繁殖,繁殖期過后(雌性幼子斷乳后)開始積累身體脂肪,到秋末完成育肥并進(jìn)入低代謝和低體溫的冬眠狀態(tài),經(jīng)過歷時(shí)半年的冬眠后于春季出眠并進(jìn)入下一年的繁殖、育肥、冬眠周期[16]。該物種在育肥期間體重會(huì)增加50%甚至更多(達(dá)到近300 g,有的甚至?xí)_(dá)到400 g),體內(nèi)脂肪含量會(huì)占它們身體的30%,有的達(dá)到50%～60%[17]。所以本研究選擇育肥期達(dá)烏爾黃鼠研究脂肪異位積累。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物達(dá)烏爾黃鼠,2016年春季捕獲于內(nèi)蒙古通遼市,帶回沈陽師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房室溫下(21±2) ℃飼養(yǎng),以標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料喂養(yǎng),水食自取。實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)并每周稱體重,體重開始增加時(shí)按照體重進(jìn)行分組,作為起始育肥期,此時(shí)體重按100%計(jì)算為標(biāo)準(zhǔn)(n=8),待體重增加至130%時(shí)作為快速育肥期(n=8),體重增加至160%時(shí)為育肥完成期(n=7),各時(shí)期分別取心臟和腎臟稱重、置于冰箱-80 ℃冷藏,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 心臟和腎臟甘油三酯含量測(cè)定

1.2.1 樣品制備

用分析天平稱量心臟和腎臟的重量(約0.1 g),按器官重量(g)與無水乙醇體積(mL)1∶9的比例,在玻璃勻漿器中冰上研磨,勻漿液4 ℃離心2 500 rpm,10 min,取上清液用于測(cè)定甘油三酯和膽固醇。各稱取0.1 g左右心臟和腎臟,加入0.9 mL PIPA裂解液(成分:10 mM Tris(pH=7.0),158 mM Nacl,1% TritonX-100, 5 mM DTT, 1 mM PMSF,蛋白酶抑制劑混合物PIC), 在玻璃勻漿器中,冰上研磨成組織勻漿液4 ℃, 1 2000 rpm,離心10 min。取上清液用于測(cè)定樣品蛋白濃度。

1.2.2 甘油三酯和膽固醇含量測(cè)定

用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的甘油三酯測(cè)定試劑盒(貨號(hào):A111-0)和膽固醇測(cè)定試劑盒(貨號(hào):A111-1)用磷酸甘油氧化酶法和單試劑比色法用生成的紅色醌類化合物的顏色深淺與甘油三酯、膽固醇的含量成正比測(cè)定樣品中甘油三酯和膽固醇含量。按照試劑盒使用說明書操作。以蒸餾水作為空白對(duì)照。在波長(zhǎng)為492 nm下,利用酶標(biāo)儀(北京普天新橋,型號(hào):PT-3502G)測(cè)定吸光度值(OD值),并計(jì)算含量。

甘油三酯含量(mmol/gprot)=[(樣本OD值-空白OD值)/(校準(zhǔn)OD值-空白OD值)]×校準(zhǔn)品濃度(2.26 mmol/L)/待測(cè)樣本蛋白濃度(gprot/L)/5

膽固醇含量(mmol/gprot)=[(樣本OD值-空白OD值)/(校準(zhǔn)OD值-空白OD值)]×校準(zhǔn)品濃度(5.17 mmol/L)/ 待測(cè)樣本蛋白濃度(gprot/L)/5

1.2.3 蛋白濃度的測(cè)定

待測(cè)樣本蛋白濃度的測(cè)定使用北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒(貨號(hào):BCA02)用96孔板法測(cè)定。利用BCA與硫酸銅等其他試劑混合在一起,顯示為蘋果綠色,即BCA工作試劑。在堿性條件下,BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合,蛋白質(zhì)將銅離子還原為亞銅離子,1個(gè)亞銅離子整合2個(gè)BCA分子,工作試劑由原來的蘋果綠色變成紫色復(fù)合物,最大光吸收強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。操作方法同上,稱取器官重量(g)與RIPA裂解液體積(mL)1∶9的比例研磨并離心,取上清液作為待測(cè)樣品。按照試劑盒操作說明書操作,在波長(zhǎng)為492 nm下,利用酶標(biāo)儀(北京普天新橋,型號(hào):PT-3502G)測(cè)定各孔吸光度值(OD值)并計(jì)算蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差分析不同時(shí)期達(dá)烏爾黃鼠心臟和腎臟中甘油三酯和膽固醇含量變化,采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式進(jìn)行比較。(P<0.05,差異顯著,P>0.05無明顯差異,P<0.01,差異極顯著)

2 結(jié) 果

2.1 不同育肥期達(dá)烏爾黃鼠心臟和腎臟的甘油三酯含量

達(dá)烏爾黃鼠育肥過程中起始育肥期、快速育肥期和育肥完成期心臟中的甘油三酯的含量分別為315.6±46.8 mmol/gprot,274.9±50.1 mmol/gprot和368.4±57.8 mmol/gprot,心臟甘油三酯含量在3組之間沒有顯著差異(P=0.992)(圖1)。腎臟中甘油三酯的含量分別為186.0±6.4 mmol/gprot,237.6±6.9 mmol/gprot和265.6±30.9 mmol/gprot,腎臟甘油三酯含量在3組之間沒有顯著差異(P=0.379)(圖2)。

圖1 不同育肥期達(dá)烏爾黃鼠心臟甘油三酯含量

圖2 不同育肥期達(dá)烏爾黃鼠腎臟甘油三酯含量

2.2 不同育肥期達(dá)烏爾黃鼠心臟和腎臟的膽固醇含量

達(dá)烏爾黃鼠育肥過程中起始育肥期、快速育肥期和育肥完成期心臟中的膽固醇的含量分別為70.2±11.7 mmol/gprot, 56.3±11.1 mmol/gprot,和89.8±15.4 mmol/gprot,心臟膽固醇含量在3組之間沒有顯著差異(P=0.753)(圖3)。腎臟的膽固醇含量在育肥過程的起始育肥期、快速育肥期和育肥完成期分別為146.4±7.1 mmol/gprot,158.2±6.8 mmol/gprot,和169.5±13.0 mmol/gprot,3組間不存在明顯差異(P=0.802)(圖4)。

圖3 不同育肥期達(dá)烏爾黃鼠心臟膽固醇含量

圖4 不同育肥期達(dá)烏爾黃鼠腎臟膽固醇含量

3 討 論

達(dá)烏爾黃鼠屬于典型的貯脂類冬眠動(dòng)物,會(huì)在冬眠前的夏秋季節(jié)大量進(jìn)食,在體內(nèi)儲(chǔ)存大量脂肪,從而導(dǎo)致了體重的大大增加,已有的研究表明其體重的增加主要是體脂含量增加導(dǎo)致的[17]。對(duì)其它動(dòng)物的研究也表明,動(dòng)物體重的變化與體脂變化密切相關(guān)[18]。動(dòng)物剛開始肥胖時(shí),脂肪細(xì)胞可以保護(hù)非脂肪細(xì)胞,使脂質(zhì)儲(chǔ)存在脂肪器官中而避免脂質(zhì)的異位積累,且非脂肪細(xì)胞內(nèi)有調(diào)節(jié)脂肪的內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)[19]。但過度肥胖后,脂肪器官自身的儲(chǔ)存能力和調(diào)節(jié)能力不足,會(huì)出現(xiàn)脂肪異位積累,進(jìn)而導(dǎo)致疾病[16,20]。

研究表明,甘油三酯或膽固醇含量的增多是引發(fā)心血管、冠狀動(dòng)脈疾病及二型糖尿病等代謝疾病的重要原因[21-23]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)達(dá)烏爾黃鼠不同育肥期的心臟,腎臟兩大器官中甘油三酯和膽固醇的含量測(cè)定結(jié)果顯示,不同育肥期的達(dá)烏爾黃鼠無論是心臟,還是腎臟中的甘油三酯和膽固醇均無明顯的變化,一直保持著一個(gè)比較平穩(wěn)的水平,表明該物種在育肥過程中不存在脂肪在心、腎等重要器官中的積累。

由于心臟是脊椎動(dòng)物最重要的一個(gè)器官,通過為血液流動(dòng)提供壓力,以供應(yīng)氧和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并帶走最終的產(chǎn)物。腎臟具有內(nèi)分泌和泌尿雙重的作用,調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),如果有多余的脂質(zhì)就會(huì)增加心臟和腎臟的負(fù)擔(dān)。有實(shí)驗(yàn)證實(shí),喂養(yǎng)高脂食物后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,它們的心臟和腎臟的脂肪含量均有所增加,而引發(fā)了心臟和腎臟的功能紊亂[10-13]。但也有不同與上述情況例證,即便肥胖也沒有代謝性疾病,我們稱之為“健康肥胖”[24]。所謂“健康肥胖”即為新陳代謝健康的肥胖個(gè)體。但新陳代謝健康的肥胖人群的患病概率比正常體重人群的患病概率要高[25],因此,即便新陳代謝健康也不意味著完全健康。達(dá)烏爾黃鼠在育肥期會(huì)大量進(jìn)食,即便如此,它們心臟和腎臟的脂質(zhì)含量并沒有明顯的改變。且有實(shí)驗(yàn)結(jié)果:育肥期的達(dá)烏爾黃鼠血糖、血脂也沒有出現(xiàn)異常[26]。鑒于以上結(jié)果可得出達(dá)烏爾黃鼠可作為“健康肥胖”的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。