邴紹苗，熊 健，覃小紅，張弘楠

(東華大學(xué) a. 上海市微納米紡織重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b. 紡織學(xué)院， 上海 201620)

紡織品在人體穿著過(guò)程中會(huì)粘染很多皮膚分泌物，同時(shí)也會(huì)受到環(huán)境污染物的影響，常常是微生物細(xì)菌繁殖和傳遞的重要媒介[1]。若能為紡織品賦予一定的抗菌功能，則可有效避免紡織品因微生物侵蝕而出現(xiàn)的受損，還可以阻斷病菌的傳播途徑[2]。靜電紡絲技術(shù)是近年興起的一種簡(jiǎn)單有效的納米纖維制備方法，采用靜電紡絲生產(chǎn)抗菌紡織品的技術(shù)引起了醫(yī)療領(lǐng)域的極大關(guān)注[3-8]，但抗菌紡織品的抗菌穩(wěn)定性往往達(dá)不到消費(fèi)者的使用需求。

抗菌劑主要分為3類：天然抗菌劑、有機(jī)抗菌劑和無(wú)機(jī)抗菌劑。其中，天然抗菌劑主要包括甲殼質(zhì)、殼聚糖[9-11]以及抗菌性蛋白質(zhì)等，無(wú)機(jī)抗菌劑主要有銀沸石、銀硅膠以及銀活性炭等[12-13]，有機(jī)抗菌劑有季銨鹽、胍類等。但無(wú)機(jī)和有機(jī)抗菌劑易造成環(huán)境污染，并對(duì)人體健康有一定危害作用，而且如使用時(shí)間較長(zhǎng)、使用方法不規(guī)范將導(dǎo)致其抗菌效果逐漸喪失，進(jìn)而導(dǎo)致耐藥細(xì)菌甚至超級(jí)細(xì)菌的產(chǎn)生[14]。大量研究證明，抗菌多肽(peptide)作為替代類抗菌藥物，具有傳統(tǒng)抗菌藥物不可比擬的優(yōu)勢(shì)[15]，其主要通過(guò)物理作用破壞微生物細(xì)菌的磷脂雙分子層而使細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)組分滲漏，或者與細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，具有非特異性、適用范圍廣、效力持久穩(wěn)定、不會(huì)產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)[16]。

目前生產(chǎn)抗菌紡織品主要有兩種方法：一是紡絲法，即在紡絲過(guò)程中加入抗菌物質(zhì)，由抗菌纖維制成相應(yīng)的抗菌紡織品[17]；二是后整理，即通過(guò)印花、浸漬、浸軋等方法將抗菌劑整理到織物上[18]。但是經(jīng)后整理處理得到的紡織品通常耐洗性較差，且織物原有的物化性能容易發(fā)生變化，而且由于抗菌劑只存在于纖維表面，其初期溶出量較大，存在穿著安全性問(wèn)題[19]，并且在洗滌過(guò)程中抗菌劑易脫落，容易造成環(huán)境污染。因此，在靜電紡絲過(guò)程中，學(xué)者們[20-21]通過(guò)在紡絲液中摻入抗菌功能性納米顆粒以實(shí)現(xiàn)紡織品的抗菌功能化處理，但這又存在由紡絲液中的納米顆粒所帶來(lái)的靜電紡絲可紡性差、抗菌劑易流失、抗菌效率低、纖維力學(xué)性能差等問(wèn)題[22]。此外，動(dòng)物試驗(yàn)證明，某些納米抗菌顆粒對(duì)人體是有害的[23-24]。

針對(duì)上述問(wèn)題，選用化學(xué)接枝法將抗菌多肽接枝到二醋酸纖維素(CDA)上，避免了由簡(jiǎn)單摻雜、共混紡絲等技術(shù)所導(dǎo)致的納米粒子的不穩(wěn)定性和聚集效應(yīng)，提高了抗菌功能的均勻性和可靠持久性。通過(guò)靜電紡絲制備改性二醋酸纖維素(CDA-g-peptide)納米纖維，并對(duì)其外觀形貌、力學(xué)性能、抗菌效果及抗菌效果的穩(wěn)定性進(jìn)行表征。靜電紡絲二醋酸纖維素纖維生物相容性好、可降解、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、熱穩(wěn)定性好[25]，制成的紡織品透氣、吸汗，同時(shí)具有低致敏性，可用于與皮膚直接接觸的繃帶、敷料以及家用紡織品等[26]。改性二醋酸纖維素納米纖維進(jìn)一步拓展了其在抗菌功能紡織品領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與原料

三氯三苯甲基氯樹脂，HOOC—(R)CH—NH—Fmoc，N，N-二異丙基乙胺(DIEA)，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)，1-羥基苯并三唑(HOBT)，吉爾生化上海有限公司；哌啶，茚三酮，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)，二氯甲烷(DCM)，三氟乙酸(TFA)，無(wú)水乙醚，丙酮，無(wú)水乙醇，丁二酸酐(SA)，三乙胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

二醋酸纖維素由南通醋酸纖維公司提供，呈白色粉粒狀或片條狀，取代度為2.43，特性黏度為1.45，數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為8.4×104。

1.2 試驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 多肽的合成

抗菌多肽的合成路線如圖1所示。多肽鏈從樹脂上切落后，經(jīng)抽濾、旋蒸濃縮，再用無(wú)水乙醚沉淀，將沉淀物真空干燥，得到抗菌多肽。

1.2.2 CDA-g-peptide制備

CDA純化。稱取一定量CDA，將其溶解在丙酮中，再用無(wú)水乙醇沉淀，低溫靜置12 h，抽濾后干燥。

CDA-g-SA制備。稱取2.0 g純化CDA，將其溶解于提純丙酮中，加入0.5 g SA、5 mL三乙胺，將反應(yīng)溫度升至65 ℃左右，反應(yīng)24 h。反應(yīng)完后，用無(wú)水乙醇沉淀后干燥。其合成原理如圖2所示。

圖1 抗菌多肽的合成路線示意圖Fig.1 Synthetic processes of antibacterial peptide

圖2 CDA-g-SA的合成原理Fig.2 The synthetic principle of CDA-g-SA

CDA與抗菌多肽(peptide)接枝。稱取1.0 g CDA-g-SA，冰浴下溶解于干燥DMF中，加入0.5 g EDC、0.4 g NHS，反應(yīng)12 h；然后將0.2 g peptide溶解在少量DMF中，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)燒瓶中，反應(yīng)12 h。 反應(yīng)完后，用無(wú)水乙醇沉淀后干燥。CDA-g-peptide合成原理如圖3所示。

圖3 CDA-g-peptide合成原理Fig.3 The synthetic principle of CDA-g-peptide

1.2.3 CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維制備

由前期預(yù)試驗(yàn)獲得CDA和CDA-g-peptide兩種溶液紡絲性能相對(duì)穩(wěn)定的參數(shù)，溶劑體系選用(丙酮∶DMAC=2∶1)混合溶劑，溶質(zhì)(CDA或CDA-g-peptide)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。稱取一定量的CDA、 CDA-g-peptide、丙酮和DMAC，分別在混合溶劑中加入兩種溶質(zhì)，磁力攪拌12 h，靜置4 h。

在室溫下，控制環(huán)境相對(duì)濕度在40%左右，采用單針頭靜電紡絲，保持兩種紡絲液流速均為0.3 mL/h、紡絲電壓為15 kV，接收距離為20 cm。

1.3 測(cè)試方法

采用TM-3000型掃描電子顯微鏡(SEM)觀察CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維的表觀形態(tài)，并使用Nano Measurer軟件測(cè)量納米纖維的直徑(隨機(jī)選取100個(gè)不同位置)。采用Mettler Toledo Seven2Go型電導(dǎo)率儀測(cè)試CDA和CDA-g-peptide紡絲液的電導(dǎo)率。采用PerkinElmer Spectrum Two型傅里葉變紅外光譜儀(FTIR)分析多肽、CDA和CDA-g-peptide的分子基團(tuán)變化。采用XQ-2型纖維拉伸強(qiáng)度儀(隨機(jī)選取納米纖維膜不同位置，膜長(zhǎng)度為50 mm，寬度為3 mm，拉伸速度為10 mm/min)，測(cè)試CDA納米纖維膜和CDA-g-peptide納米纖維膜的拉伸斷裂強(qiáng)力及斷裂伸長(zhǎng)率。

1.4 抗菌試驗(yàn)

選取金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性致病菌)和大腸桿菌(革蘭氏陰性致病菌)作為測(cè)試菌種，參照GB/T 20944.1—2007采用瓊脂平皿擴(kuò)散法表征CDA-g-peptide納米纖維的抗菌效果，其抗菌效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示?？咕阅艿脑u(píng)價(jià)參考GB/T 20944.1—2007中的振蕩法，有2個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)：一是試驗(yàn)有效性F的判斷，對(duì)于金黃色葡萄球菌及大腸桿菌等細(xì)菌，當(dāng)F≥1.5，且對(duì)照燒瓶中的活菌濃度比接種時(shí)的活菌濃度增加時(shí)，試驗(yàn)判定有效，否則試驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行試驗(yàn)；二是抑菌率的計(jì)算，當(dāng)對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抑菌率≥70%時(shí)，樣品具有抗菌效果。

表1 CDA-g-peptide納米纖維抗菌效果評(píng)價(jià)Table 1 Evaluation of antibacterial effect of CDA-g-peptide nanofibers

1.5 抗菌效果的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

由FZ/T 73023—2006可知，抗菌效果的穩(wěn)定性一直是評(píng)價(jià)抗菌產(chǎn)品優(yōu)劣的重要指標(biāo)。但目前的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)并未對(duì)其做出統(tǒng)一有效規(guī)定，而且由于制備方法、使用原料差異，各類抗菌產(chǎn)品所適用的評(píng)價(jià)方法也無(wú)法一概而論。為此，考慮到CDA-g-peptide納米纖維的制備方法及其在紡織服裝中反復(fù)洗滌使用的特點(diǎn)，將CDA-g-peptide納米纖維置于去離子水中，放在37 ℃恒溫振蕩器中振蕩，模擬不同時(shí)間的洗滌過(guò)程對(duì)抗菌性能的影響。然后將納米纖維置于細(xì)菌培養(yǎng)液中，測(cè)試不同振蕩時(shí)間處理過(guò)的納米纖維對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率的變化，并與未振蕩處理的對(duì)比，評(píng)價(jià)CDA-g-peptide納米纖維的抗菌穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 多肽的表征

圖4 多肽與氨基酸原料的紅外吸收光譜Fig.4 The infrared absorption spectra of peptide and amino acid material

2.2 CDA-g-peptide的表征

圖5 CDA、CDA-g-SA、 CDA-g-peptide的紅外吸收光譜Fig.5 The infrared absorption spectra of CDA，CDA-g-SA and CDA-g-peptide

2.3 CDA和CDA-g-peptide納米纖維的表征

2.3.1 表觀形貌表征

CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維的SEM圖如圖6所示。由圖6可知：CDA納米纖維隨機(jī)排列，表面比較光滑，平均直徑為275.8 nm，變異系數(shù)較大；而CDA-g-peptide納米纖維隨機(jī)排列，少部分以串珠液滴的形式存在，但纖維的平均直徑為117.6 nm(比CDA納米纖維小得多)，且變異系數(shù)較小，表面比較光滑。影響纖維直徑的主要因素是電導(dǎo)率，CDA和CDA-g-peptide紡絲液的電導(dǎo)率分別為1.95和18.38 μS/cm。由于CDA-g-peptide引入了酰胺鍵等基團(tuán)，提高了其紡絲液的電導(dǎo)率，故相同紡絲條件下纖維較細(xì)，雖然相對(duì)分子質(zhì)量分布寬并且存在串珠，但纖維直徑分布依然較窄。

(a) CDA納米纖維SEM圖

(c) CDA-g-peptide納米纖維SEM圖

(d) CDA-g-peptide納米纖維直徑分布圖圖6 CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維SEM圖和纖維直徑分布圖

Fig.6SEMimagesandfiberdiameterdistributionofCDAnanofibersandCDA-g-peptidenanofibers

2.3.2 力學(xué)性能表征

圖7 CDA 納米纖維膜和CDA-g-peptide納米纖維膜的負(fù)荷伸長(zhǎng)曲線Fig.7 Load-elongation curves of CDA nanofiber membranes and CDA-g-peptide nanofiber membranes

CDA納米纖維膜和CDA-g-peptide納米纖維膜的平均負(fù)荷伸長(zhǎng)曲線如圖7所示。由圖7可知，CDA納米纖維膜最大拉伸負(fù)荷大于CDA-g-peptide納米纖維膜，但二者的斷裂伸長(zhǎng)率相近。當(dāng)外加負(fù)荷一定時(shí)，CDA-g-peptide納米纖維膜的變形能力要大于CDA納米纖維膜的變形能力，并且CDA-g-peptide納米纖維膜的初始模量小于CDA納米纖維膜，即在小變形條件下，CDA納米纖維膜抵抗外力變形的能力更強(qiáng)，二者的力學(xué)性能存在一定差異。

3 CDA-g-peptide納米纖維的抗菌性能測(cè)試

大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線如圖8所示。大腸桿菌生長(zhǎng)曲線可劃分為4個(gè)階段。其中：0～3 h為遲緩期，大腸桿菌的繁殖速度很慢，曲線較平緩；4～9 h為生長(zhǎng)期，大腸桿菌快速增殖；10～16 h為穩(wěn)定期，大腸桿菌總數(shù)基本穩(wěn)定，這是由于隨著大腸桿菌的繁殖，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷減少，并且代謝產(chǎn)生的有害物積累，大腸桿菌的增長(zhǎng)速度不斷變慢，其增殖數(shù)與死亡數(shù)大致相等；17～20 h為衰亡期，由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少，而毒性物質(zhì)逐漸增加，大腸桿菌的繁殖速度逐漸減緩，死亡數(shù)明顯增多，細(xì)菌總數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖8 大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線圖Fig.8 Growth curve of E. coli

CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維對(duì)大腸桿菌的抗菌性能如圖9所示。由圖9可知，培養(yǎng)24 h后，CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維均沒(méi)有明顯的抑菌圈。但是去除對(duì)照樣(CDA納米纖維)和試樣(CDA-g-peptide納米纖維)后，對(duì)照樣接觸的培養(yǎng)基表面有大腸桿菌的生長(zhǎng)，而試樣接觸的培養(yǎng)基表面沒(méi)有大腸桿菌生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)48 h培養(yǎng)后，CDA-g-peptide納米纖維接觸的培養(yǎng)基表面仍沒(méi)有大腸桿菌生長(zhǎng)(如圖9(a)所示)。進(jìn)一步采用振蕩法與平板菌落計(jì)數(shù)法相結(jié)合的方法評(píng)價(jià)其抗菌性能(如圖9(b)所示)。根據(jù)平板菌落計(jì)數(shù)法，得出試驗(yàn)的F值為2.54，即試驗(yàn)有效。CDA-g-peptide納米纖維對(duì)大腸桿菌的抑菌率為98.4%，大于評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中的抑菌率(70%)。由此證明CDA-g-peptide納米纖維對(duì)大腸桿菌的抗菌性能優(yōu)異。

(a) 定性測(cè)試

(b) 定量測(cè)試圖9 CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維對(duì)大腸桿菌的抗菌性能測(cè)試Fig.9 E. coli antibacterial performance tests of CDAnanofibers and CDA-g-peptide nanofibers

圖10 金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線圖Fig.10 Growth curve of S. aureus

金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線如圖10所示。金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線可劃分為3個(gè)階段。其中，0～4 h為遲緩期，金黃色葡萄球菌的繁殖速度很慢；5～12 h為生長(zhǎng)期，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，金黃色葡萄球菌快速增長(zhǎng)；13～24 h為穩(wěn)定期，金黃色葡萄球菌的總數(shù)基本維持穩(wěn)定，菌落數(shù)目波動(dòng)較小。這是由于隨著金黃色葡萄球菌數(shù)目的增多，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷減少，而代謝產(chǎn)生的毒性物質(zhì)積累等，金黃色葡萄球菌的繁殖速度逐漸下降，而死亡細(xì)菌數(shù)逐漸增加，總體上達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡。

CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌性能如圖11所示。由圖11可知，與大腸桿菌的抗菌性能測(cè)試一樣，培養(yǎng)24 h后，兩組試樣均未出現(xiàn)明顯的抑菌圈，但是去除對(duì)照樣和試樣后，CDA納米纖維培養(yǎng)基上有細(xì)菌生長(zhǎng)，而CDA-g-peptide納米纖維接觸的培養(yǎng)基表面沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)48 h培養(yǎng)后，CDA-g-peptide納米纖維接觸的培養(yǎng)基表面仍沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。進(jìn)一步采用振蕩法與平板菌落計(jì)數(shù)法相結(jié)合的方法對(duì)其抗菌性能進(jìn)行評(píng)價(jià)(如圖11(b)所示)。根據(jù)平板菌落計(jì)數(shù)法，F(xiàn)值為2.04，表明試驗(yàn)有效。CDA-g-peptide納米纖維對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率為98.7%，大于評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中的抑菌率(70%)。由此證明CDA-g-peptide納米纖維對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌性能優(yōu)異。

(a) 定性測(cè)試

(b) 定量測(cè)試圖11 CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌性能測(cè)試Fig.11 S. aureus antibacterial performance tests of CDAnanofibers and CDA-g-peptide nanofibers

4 CDA-g-peptide納米纖維的抗菌穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

經(jīng)振蕩和未經(jīng)振蕩的CDA-g-peptide納米纖維的抗菌測(cè)試結(jié)果如表2所示。對(duì)照樣(CDA納米纖維)培養(yǎng)基中長(zhǎng)滿了菌落，而CDA-g-peptide納米纖維和經(jīng)振蕩處理后的納米纖維的培養(yǎng)基中幾乎沒(méi)有菌落生長(zhǎng)。經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)法得出，振蕩12、 24、 48 h后的CDA-g-peptide納米纖維對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率與未經(jīng)振蕩的CDA-g-peptide納米纖維基本一致，無(wú)顯著差異。故CDA-g-peptide納米纖維的抗菌效果穩(wěn)定。

表2 不同振蕩時(shí)間對(duì)CDA-g-peptide納米纖維抑菌率的影響Table 2 Effect of different oscillation time on bacteriostatic rate

5 結(jié) 語(yǔ)

以抗菌多肽和CDA為原料，利用抗菌多肽的氨基自由基將抗菌多肽接枝在羧基化的CDA上，合成了具有抗菌功能的CDA-g-peptide。采用靜電紡絲技術(shù)，制備了CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維。由SEM圖可知，CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維在外觀形貌上存在一定差異。在力學(xué)性能方面，CDA納米纖維膜的斷裂強(qiáng)力優(yōu)于CDA-g-peptide納米纖維膜，但二者的斷裂伸長(zhǎng)率相差不大，并不會(huì)影響其后續(xù)加工使用。CDA納米纖維和CDA-g-peptide納米纖維的抗菌性能結(jié)果表明，后者具有優(yōu)異的抗菌性能。由于抗菌多肽與納米纖維之間是化學(xué)鍵作用，而不是簡(jiǎn)單摻雜、共混，故經(jīng)不同振蕩時(shí)間處理后，其抗菌性能未出現(xiàn)明顯下降，具有抗菌可靠性和持久性。因此開發(fā)新型抗菌醋酸纖維基靜電紡絲納米纖維，可將其與傳統(tǒng)棉纖維、聚酯纖維混紡，在不影響其服用性能的前提下，賦予傳統(tǒng)紡織品高功能性和高附加值，拓展其在服用領(lǐng)域和醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用，具有較好的應(yīng)用前景。