吳許文，溫旺榮，李沛樟，倪金良，簡仕銘

(1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東廣州 510163；2.鏡湖醫(yī)院檢驗(yàn)科,澳門 999078)

敗血癥是由致病菌引起血流感染的一種常見綜合征，及時(shí)作出診斷是降低患者病死率的關(guān)鍵[1]。主要是因消化道、呼吸道、傷口感染導(dǎo)致病原體進(jìn)入血液循環(huán)所致[2-6]。澳門鏡湖醫(yī)院檢驗(yàn)科2010-2016年相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，近七年從血液中分離的主要致病菌有大腸埃希菌(EC)40.18%，金黃色葡萄球菌(SA)11.87%和肺炎克雷伯菌(KP)9.48%，其中因?yàn)E用抗菌藥物而產(chǎn)生的耐甲氧西林SA(MRSA)占SA的53.18%。

致病菌在血液循環(huán)內(nèi)會(huì)產(chǎn)生各類毒素，引起寒戰(zhàn)、發(fā)熱、休克，甚至死亡。為防止更嚴(yán)重的后果,及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷敗血癥至關(guān)重要。目前，血液細(xì)菌培養(yǎng)是診斷敗血癥的主要方法，但培養(yǎng)和鑒定需5～7 d才能得到結(jié)果，耗時(shí)過長影響了其應(yīng)用價(jià)值，未能達(dá)到快速、有效治療的目的。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的分子診斷方法[7]。通過核酸提取、PCR擴(kuò)增和分析，一般可在數(shù)小時(shí)內(nèi)得到結(jié)果，具有很大的潛在應(yīng)用前景。本研究希望通過建立多重PCR方法，對(duì)EC、KP、SA和MRSA同時(shí)進(jìn)行檢測，并將16S rDNA作為陽性感染對(duì)照組，從而提高準(zhǔn)確性、降低成本和縮短時(shí)間，達(dá)到一次性檢出血液中的主要致病菌的目的。

1 材料及方法

1.1菌株來源 本研究所采用菌株包括EC、KP、SA、MRSA、表皮葡萄球菌(SE)、路鄧葡萄球菌(SL)、鮑曼不動(dòng)桿菌(AB)、銅綠假單胞菌(PA)、普通變形桿菌(PV)、糞腸球菌(EF)、無乳鏈球菌(SAg)、創(chuàng)傷弧菌(VV)、停乳鏈球菌(SDy)、緩癥鏈球菌(SMi)和頭狀葡萄球菌(SC)均為澳門鏡湖醫(yī)院臨床分離菌株。購自美國菌種保藏中心(ATCC)的其他菌株包括EC(ATCC 25922)、KP(ATCC 700603)、SA(ATCC 29213)、MRSA(ATCC 33591)和SE(ATCC 12228)。

1.2培養(yǎng)基與試劑 Mueller-Hinton(M-H)平板、血平板均購自法國生物梅里埃公司，肉湯LB培養(yǎng)基為自配，BACTECTM培養(yǎng)瓶購自美國BD公司。2×Multiplex PCR Kit購自QIAGEN公司，DL2000 DNA標(biāo)志物、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR Kit均購自TaKaRa公司，DuRed 核酸染料購自泛博生化公司。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[8-9]設(shè)計(jì)引物，包括細(xì)菌16S rDNA基因、EC phoA基因、KP mdh基因、SA femA基因和MRSA mecA基因。引物由深圳華大基因有限公司合成。引物序列和產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物序列和產(chǎn)物大小

1.3.2細(xì)菌培養(yǎng)及基因組DNA提取 將分純的標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于LB肉湯，37 ℃培養(yǎng)過夜，取100 μL菌液 13 000×g離心1 min，棄上清液后加入50 μL Takara Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR Kit，并按說明書操作提取DNA，直接用于PCR反應(yīng)。而血流感染的標(biāo)本可置于血培養(yǎng)瓶37 ℃培養(yǎng)4 h進(jìn)行預(yù)增菌，然后取500 μL于離心管 13 000×g離心1 min，棄上清液后加入50 μL Takara Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR Kit，并按說明書操作提取DNA，直接用于PCR反應(yīng)。

1.3.3單一基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物，在相同條件下以標(biāo)準(zhǔn)菌EC ATCC 25922、KP ATCC 700603、SA ATCC 29213和MRSA ATCC 33591的DNA為模板，分別對(duì)其進(jìn)行16S rDNA、EC phoA、KP mdh、SA femA和MRSA mecA單一基因PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 12.5 μL、0.1 μmol/L引物、模板(Template)1 μL、雙蒸餾水(ddH2O)至25 μL。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)獲得的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物于4 ℃保存，1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.3.4多重PCR條件優(yōu)化 為建立快速同時(shí)檢測多個(gè)目標(biāo)病原體的多重PCR方法，將所有引物加到同一個(gè)反應(yīng)里面，PCR反應(yīng)體系仍為25 μL，對(duì)EC ATCC25922、KP ATCC700603、SA ATCC29213和MRSA ATCC33591的DNA模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。優(yōu)化反應(yīng)條件及體系并進(jìn)行正交試驗(yàn)，包括調(diào)整引物為0.01～0.20 μmol/L，以0.02 μmol/L遞增；根據(jù)設(shè)計(jì)的引物退火溫度，以56 ℃為基礎(chǔ)，以2 ℃遞加，直至62 ℃，時(shí)間90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物于4 ℃保存，1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.3.5多重PCR方法的特異性 采用Takara Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR Kit提取試驗(yàn)菌株基因組DNA，利用所建立的多重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證本方法的特異性。

1.3.6多重PCR方法的靈敏度 測定EC ATCC 25922、KP ATCC 700603、SA ATCC 29213和MRSA ATCC 33591的菌液濃度并進(jìn)行10倍梯度稀釋，依次2.75 ×106至2.75 CFU/mL、 2.43×106至2.43 CFU/mL、3.13×106至3.13× CFU/mL和3.03×107至24.3 CFU/mL，各稀釋度經(jīng)裂解后取1 μL基因組DNA，分別進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以確定其檢測限。

1.3.7驗(yàn)證試驗(yàn) 將建立的多重PCR方法與傳統(tǒng)血培養(yǎng)方法對(duì)300個(gè)血培養(yǎng)樣本進(jìn)行比較，驗(yàn)證本方法的可靠性。血培養(yǎng)方法為采集血液標(biāo)本于BACTECTM全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)配套培養(yǎng)瓶，放于BACTEC9240血培養(yǎng)儀37 ℃培養(yǎng)直至儀器提示陽性后轉(zhuǎn)種血平板過夜，后挑取單菌落到Vitek-2 Compact微生物鑒定分析儀進(jìn)行藥敏和鑒定試驗(yàn)，如儀器培養(yǎng)5 d無提示陽性則視為陰性。

1.3.8預(yù)增菌試驗(yàn) 使用標(biāo)準(zhǔn)菌EC ATCC25922配制為1個(gè)單位菌液[5]置于BACTECTM培養(yǎng)瓶，37 ℃培養(yǎng)1、2、3、4 h進(jìn)行預(yù)增菌，并按Takara Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR Kit說明書操作提取DNA，直接用于PCR反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1單一基因PCR檢測結(jié)果 以EC ATCC25922、KP ATCC700603、SA ATCC29213和MRSA ATCC33591為模板，使用16S-F/16S-R引物經(jīng)擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物在1 500 bp有16S rDNA條帶；使用PhoA-F/PhoA-R引物擴(kuò)增EC ATCC25922后PCR產(chǎn)物為903 bp；使用Mdh-F/Mdh-R引物擴(kuò)增KP ATCC700603310后PCR產(chǎn)物為364 bp；使用MecA-F/MecA-R引物擴(kuò)增MRSA ATCC33591后PCR產(chǎn)物為310 bp；使用FemA-F/FemA-R引物擴(kuò)增SA ATCC29213后PCR產(chǎn)物為132 bp，所有目的擴(kuò)增條帶均清晰。在該反應(yīng)體系下的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。單一基因片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2多重PCR條件優(yōu)化 在單一PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增的基礎(chǔ)上優(yōu)化了多重PCR反應(yīng)體系及條件，最佳反應(yīng)體系(25 μL)為2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 12.5 μL，引物終濃度：16S-F/16S-R為0.06 μmol/L(0.15 μL)、PhoA-F/PhoA-R為0.01 μmol/L(0.25 μL)、Mdh-F/Mdh-R為0.02 μmol/L(0.5 μL)、MecA-F/MecA-R為0.1 μmol/L(0.25 μL)和FemA-F/FemA-R為0.12 μmol/L(0.3 μL)，Template 1 μL、ddH2O 7.5 μL。而在56～62 ℃的退火溫度實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)中，60 ℃擴(kuò)增效果較好，確定其為最終退火溫度。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性15 min后,按94 ℃ 30 s、60 ℃ 1.5 min、72 ℃ 1.5 min進(jìn)行35個(gè)循環(huán),然后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。EC ATCC 25922的PCR產(chǎn)物于1 500、903 bp有條帶，KP ATCC 700603的PCR產(chǎn)物于1 500、364 bp有條帶，SA ATCC 29213的PCR產(chǎn)物于1 500、132 bp有條帶，MRSA ATCC 33591的PCR產(chǎn)物于1 500、310、132 bp有條帶。其多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。

注：M表示DNA Marker DL2000;N表示陰性對(duì)照;1為EC ATCC25922;2為KP ATCC700603;3為MRSA ATCC33591;4為SA ATCC29213;5為EC ATCC25922;6為KP ATCC700603;7為MRSA ATCC33591;8為SA ATCC29213

圖1 EC、KP、MRSA、SA單一基因PCR電泳結(jié)果

注：M表示DNA Marker DL2000;1為EC ATCC 25922;2為KP ATCC 700603;3為SA ATCC 29213;4為MRSA ATCC 33591;5為EC ATCC 25922、 KP ATCC 700603、SA ATCC 29213和MRSA ATCC 33591

圖2 EC、KP、SA、MRSA多重PCR電泳結(jié)果

2.3多重PCR的特異性 EC在16S rDNA和phoA位置有陽性條帶，KP在16S rDNA和mdh位置有陽性條帶，SA在16S rDNA和femA位置有陽性條帶，MRSA在16S rDNA、mecA和femA位置有陽性條帶。其他菌株只有在16S rDNA位置出現(xiàn)陽性條帶。表明本研究所建立的多重PCR方法具有高度特異性，沒有發(fā)現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，特異度為100%。見表2。

表2 多重PCR的特異性

注：+表示陽性；-表示陰性

2.4多重PCR的靈敏度 EC ATCC 25922的phoA基因檢測限為2.75×102CFU/mL，KP ATCC 700603的mdh基因檢測限為2.43×103CFU/mL，SA ATCC 29213的femA基因檢測限為3.13×102CFU/mL，MRSA ATCC 33591的mecA基因檢測限為3.03×102CFU/mL。而16S rDNA的檢測限EC ATCC 25922為27.5 CFU/mL、KP ATCC 700603為2.43×102CFU/mL、SA ATCC 29213為3.13×102CFU/mL和MRSA ATCC 33591為3.03×103CFU/mL。見圖3。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn) 300份血標(biāo)本中傳統(tǒng)血培養(yǎng)方法測定陽性標(biāo)本187份，其中EC為116份，KP為24份，SA(不包括MRSA)為4份，MRSA為6份，其他血液致病菌感染為37份。采用多重PCR方法檢出16S rDNA陽性標(biāo)本183份，在16S rDNA陽性標(biāo)本中phoA陽性114份，mdh陽性22份，femA陽性10份，mecA陽性6份，與傳統(tǒng)血培養(yǎng)方法檢測敗血癥感染比較，其準(zhǔn)確率為97.9%(183/187)，雖然多重PCR方法出現(xiàn)部分假陰性，但超過95%血流感染可在約8 h檢測到，是一種快速檢測敗血癥的方法。見表3。

注：A表示多重PCR對(duì)EC和SA的靈敏度。M為DNA Marker DL2000;1～7為EC ATCC25922，濃度依次為2.75×106、2.75×105、2.75×104、2.75×103、2.75×102、27.5、2.75 CFU/mL;8～14為SA ATCC29213，濃度依次為3.13×106、3.13×105、3.13×104、3.13×103、3.13×102、31.3、3.13 CFU/mL。B表示多重PCR對(duì)MRSA和KP的靈敏度。M為DNA Marker DL2000；1～7為MRSA ATCC33591，濃度依次為3.03×107、3.03×106、3.03×105、3.03×104、3.03×103、3.03×102、30.3 CFU/mL;8～14為KP ATCC700603，濃度依次為2.43×106、2.43×105、2.43×104、2.43×103、2.43×102、24.3、2.43 CFU/mL

圖3 多重PCR的靈敏度

續(xù)表3 多重PCR方法與血培養(yǎng)方法檢測結(jié)果比較(n)

注：-表示陰性

2.6預(yù)增菌試驗(yàn) 16S-F/16S-R引物擴(kuò)增4 h的PCR產(chǎn)物在1 500 bp有 16S rDNA清晰條帶。見圖4。

注：M表示DNA Marker DL2000;1為1 h;2為2 h;3為3 h;4為4 h

圖4預(yù)增菌試驗(yàn)

2.7多重PCR方法和傳統(tǒng)血培養(yǎng)方法檢測時(shí)間比較 多重PCR方法8.3 h可得到結(jié)果，而傳統(tǒng)血培養(yǎng)方法則需等待血培養(yǎng)儀器提示陽性后再進(jìn)行轉(zhuǎn)種培養(yǎng)和生化鑒定等過程，總時(shí)間60 h可得到陽性鑒定結(jié)果，培養(yǎng)陰性結(jié)果則需要5 d才可確定為陰性。見表4。

表4 多重PCR方法和傳統(tǒng)血培養(yǎng)方法檢測時(shí)間比較

注：-表示不需要該步驟

3 討 論

PCR是簡單、實(shí)用的分子生物學(xué)技術(shù)[7]，通過將核酸變性、退火和擴(kuò)增3個(gè)步驟對(duì)DNA模板進(jìn)行復(fù)制。該檢測技術(shù)與常規(guī)培養(yǎng)分離細(xì)菌的方法比較，具有快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，在臨床檢驗(yàn)方面具有良好的應(yīng)用前景，市場上已研發(fā)出許多用于檢驗(yàn)臨床致病菌的PCR商品化試劑盒[12-13]，如德國Roche公司的LightCycler SeptiFast MGRADE-test、韓國SeeGene公司的Magicplex Sepsis Real-time PCR等，均可檢測敗血癥患者血液中的EC[2,11]、KP[12]、SA[1，8]、沙門菌和志賀菌等多種微生物，但其儀器、設(shè)備要求高，試劑成本昂貴。因此，希望透過建立一個(gè)可同時(shí)檢測EC、KP、SA和MRSA的多重PCR方法，縮短血流感染所需的檢測時(shí)間，以達(dá)到盡快查找病因和診治的目的,同時(shí)，通過自行研發(fā)以降低檢測成本，減輕患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。

引物是影響PCR擴(kuò)增成功的重要一環(huán)，因此，選取合適的基因或序列作為目的基因設(shè)計(jì)引物很重要，從相關(guān)文獻(xiàn)可知，EC的檢測常會(huì)使用到bfp、eae、stx、AggR、Elt、Est和inv目的基因來分類不同的EC菌群[2,11,16]，亦有研究表明，phoA基因可作為EC通用的分子標(biāo)記[8,17]。

HAEGGMAN等[18]報(bào)道了KP管家基因mdh編碼蘋果酸脫氫酶和gyrA基因編碼旋轉(zhuǎn)酶亞單位A用于評(píng)價(jià)該菌的遺傳多樣性，其后有學(xué)者使用mdh作為目的基因?qū)P進(jìn)行了PCR檢測[8,15]。而對(duì)SA的檢測，常用nuc，sodA和femA作為種特異性目的基因設(shè)計(jì)引物[1,14]。隨著臨床抗菌藥物的普及使用和濫用，SA產(chǎn)生抗藥性菌株漸多，其中產(chǎn)生的MRSA除對(duì)甲氧西林耐藥外，對(duì)氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類等常用抗生素均具有多重耐藥性，可用PCR方法檢測SA的甲氧西林抗性mecA基因，以確定該SA是否為MRSA[10,14]。

本研究選取了THONG等[8]報(bào)道的phoA、mdh、femA和mecA為目的基因，建立了可同時(shí)檢測血流感染中幾種常見致病菌，包括EC、KP、SA和MRSA的多重PCR方法。另外，除上述目標(biāo)菌外，在多重PCR體系中同時(shí)加入了針對(duì)原核生物保守區(qū)16S rDNA序列的引物8F/1492R[9]，檢測其他細(xì)菌引起的敗血癥，對(duì)EC、KP、SA和MRSA以外的細(xì)菌感染作出陽性提示，以避免漏檢。

血液具有各種復(fù)雜的成分，選取合適的DNA提取方法對(duì)血流感染標(biāo)本進(jìn)行DNA提取是PCR檢測成功與否的另一影響因素。

BANADA等[1]用白細(xì)胞、血漿和全血標(biāo)本檢測SA引起的敗血癥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)不同組分的血液標(biāo)本中細(xì)菌DNA提取的結(jié)果具有差異，其中全血標(biāo)本檢測陽性率最高。因此，本研究亦選擇了用全血標(biāo)本對(duì)血流感染中的細(xì)菌DNA進(jìn)行收集提?。涣硗?，細(xì)菌因其種類不同，提取方法的差異也會(huì)影響獲得細(xì)菌DNA的量，本研究選取日本Takara公司的 Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR Kit對(duì)血中各類細(xì)菌進(jìn)行DNA提取，獲得了足夠PCR試驗(yàn)的DNA量。

而根據(jù)不同程度的血流感染，其體內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量會(huì)有差異，低程度的感染其血液中的細(xì)菌濃度較低而未能被提取足夠的DNA量，從而影響PCR的檢測結(jié)果顯示為假陰性。在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方面，沈愷妮等[19]建議，根據(jù)一系列臨床及血液學(xué)指標(biāo)變化以提高血培養(yǎng)陽性率。本研究選取了符合的血流感染樣本進(jìn)行試驗(yàn)，包括發(fā)熱、心率加快、呼吸急促、白細(xì)胞升高、炎癥指標(biāo)上升等，以便兩種方法的比較。

EC在116份血流感染標(biāo)本中有2份、KP在24份血流感染標(biāo)本中有2份未能被PCR方法檢出，顯示為假陰性結(jié)果，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一般血流感染的成年人血液中的細(xì)菌<1～10 CFU/mL[5]，所以，筆者認(rèn)為，假陰性結(jié)果與標(biāo)本中細(xì)菌濃度較低有關(guān)，在采集患者標(biāo)本后先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)以提高細(xì)菌濃度，再進(jìn)行PCR檢測有利于降低假陰性發(fā)生率。本研究結(jié)果顯示，95%以上傳統(tǒng)血培養(yǎng)方法陽性的標(biāo)本與建立的多重PCR方法比較，可獲得一致的結(jié)果，對(duì)血標(biāo)本先進(jìn)行4 h的預(yù)培養(yǎng)可獲得PCR方法需要的檢測量，而延長預(yù)培養(yǎng)時(shí)間亦有利于提高準(zhǔn)確率。

4 結(jié) 論

本研究研發(fā)了一種可診斷敗血癥的多重PCR方法，可同時(shí)對(duì)EC、KP、SA和MRSA 4種目標(biāo)致病菌進(jìn)行檢測。與傳統(tǒng)血培養(yǎng)方法比較，多重PCR方法的特異性為100%，準(zhǔn)確率為97.9%(183/187)，而檢測所需時(shí)間，多重PCR方法為8.3 h，傳統(tǒng)血培養(yǎng)方法陽性為60 h，陰性為5 d。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法比較，本研究提供了一種高準(zhǔn)確率、快速、簡單的敗血癥檢驗(yàn)方法。