周 浩， 李 博， 牛 林， 邱 林， 王 永，*

1湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，湖北 孝感 432000； 2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/昆蟲資源利用與害蟲可持續(xù)治理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070； 3廣州海關(guān)隸屬南沙海關(guān)，廣東 廣州 511400； 4中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽 455000； 5湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長沙 410128

二化螟Chilosuppressalis(Walker)是水稻的重要害蟲，對水稻產(chǎn)量造成重大損失(Qiuetal.,2017)。長期以來二化螟的防治一直以化學(xué)農(nóng)藥為主，但大量長期使用化學(xué)農(nóng)藥使得二化螟產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)造成環(huán)境污染,危害人類健康(徐秀秀等，2013)。因此，尋找新型有效的防治方法刻不容緩(曹明章等，2004)。轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻為防治二化螟提供了新思路，被認(rèn)為是一種新的、可替代化學(xué)農(nóng)藥的、環(huán)境友好的控制害蟲危害的策略(Tangetal.,2018)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis, Bt)殺蟲基因作為外源基因?qū)朕r(nóng)作物中，可以對標(biāo)靶害蟲起到良好的防治效果(Huetal.,2018)。

Bt伴孢晶體產(chǎn)生的Cry蛋白殺蟲活性物質(zhì)是目前主要應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因蛋白(Bravoetal.,2011)。Cry蛋白對鱗翅目害蟲的作用機(jī)制已有許多報(bào)道(Huetal.,2018)。Cry蛋白被害蟲攝取后首先在昆蟲消化道內(nèi)溶解，在敏感害蟲中腸蛋白酶的作用下被激活，活化的Cry蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至圍食膜，與中腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜囊(brush border membrane vesicle,BBMV)膜上特異性蛋白受體相結(jié)合，通過一系列蛋白質(zhì)相互作用，使中腸細(xì)胞裂解或細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致蟲體死亡(Jurat-Fuentes & Crickmore,2017)。目前公認(rèn)的2種模型即成孔模型和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模型(Meloetal.,2016)。成孔模型中，蛋白與受體蛋白相結(jié)合，導(dǎo)致蛋白的寡聚化，進(jìn)而形成穿孔，引起細(xì)胞滲漏裂解，蟲體死亡(Bravoetal.,2004)；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模型中，Cry蛋白與鈣黏蛋白(cadherin，CAD)相互作用后激發(fā)了依賴Mg2+的信號級聯(lián)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡而引起昆蟲死亡(Zhangetal.,2005)。Jurat-Fuentes & Adang (2006)提出了成孔和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)共同作用的模型。無論是哪種模型，Cry蛋白與受體蛋白的結(jié)合是Cry蛋白殺蟲活性的前提(Tanakaetal.,2013)。目前已有許多Cry蛋白受體蛋白得到鑒定，包括鈣黏蛋白CAD、氨肽酶、堿性磷酸酶和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等(Bravoetal.,2011; Pardo-Lopezetal.,2013; Pigott & Ellar,2007; Qiuetal.,2017; Soberonetal.,2018)。

CAD是一類依賴于鈣離子的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，在細(xì)胞裂解、細(xì)胞增殖與分化過程中起到重要作用，并能調(diào)控細(xì)胞外與胞質(zhì)內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑(Angstetal.,2001)。Vadlamudietal. (1993)首次在煙草天蛾ManducasextaL.中發(fā)現(xiàn)CAD是Cry1Ab蛋白的結(jié)合蛋白。此后，在不同類別的昆蟲和不同種類的Cry蛋白相互作用中，許多昆蟲的CAD作為Cry蛋白的結(jié)合或受體蛋白得到證實(shí)，如棉紅鈴蟲Pectinophoragossypiella(Saunders)和歐洲玉米螟Ostrinianubilalis(Hübner) (Flannaganetal.,2005; Morinetal.,2003)。此外，CAD的突變可導(dǎo)致CAD與Cry蛋白的蛋白質(zhì)互作發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致昆蟲產(chǎn)生抗性(Huetal.,2018)。破壞棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)的CAD基因與棉鈴蟲對Cry1Ac蛋白的遺傳抗性相關(guān)(Wangetal.,2016)。

不同的Cry蛋白對不同的昆蟲具有特異性，即使同一類別的昆蟲也具有差異性(Parketal.,2014; Renetal.,2016)。與對Cry1Ac敏感的棉鈴蟲品系相比，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除HaCad基因，棉鈴蟲對Cry1Ac抗性增加549倍，但是Cry2Ab的敏感性無顯著改變(Wangetal.,2016)。Cry蛋白在不同的細(xì)胞系中同樣能夠引起不同的細(xì)胞死亡反應(yīng)。在Cry1Ac蛋白作用下，轉(zhuǎn)染MsCAD的TnH5細(xì)胞能夠激活PKA/AC通路引起的死亡反應(yīng)，但是CF1細(xì)胞中Cry1Ac并不激活PKA/AC通路，而是引起細(xì)胞凋亡(Soberonetal.,2018)。CAD與Cry蛋白的互作隨著鱗翅目昆蟲種類的不同而變化(Stevensetal.,2017)。因此，不同類別的Cry蛋白與不同種類昆蟲的CAD互作需要進(jìn)行具體研究。

前期的研究結(jié)果表明，利用RNAi沉默二化螟CAD1基因后，二化螟對于Cry蛋白的敏感性下降，猜想二化螟CAD1是Cry2A和Cry1C的潛在受體(Zhangetal.,2017)。本研究構(gòu)建原核表達(dá)載體獲得二化螟CAD1蛋白，利用Ligand blot技術(shù)分析二化螟CAD1蛋白與Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的結(jié)合能力，初步驗(yàn)證二化螟CAD的功能，為進(jìn)一步闡明二化螟鈣黏蛋白CAD1的Cry蛋白受體功能提供理論支持，也起到豐富和完善Bt蛋白殺蟲機(jī)理的作用。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試?yán)ハx為二化螟敏感品系，由本課題組室內(nèi)培養(yǎng)20代以上。二化螟幼蟲用人工飼料飼養(yǎng)，成蟲喂以10%蔗糖水。培養(yǎng)條件：溫度(27±1) ℃，光周期16 L∶8 D，相對濕度(65±10)%。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶(Takara公司)、膠回收試劑盒(Axygen公司)、peasy-T1載體和Trans BL21 (DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞(全式金公司)、限制性內(nèi)切酶(Fermentas公司)、T4 DNA連接酶(Promega公司)、10%SDS-PAGE凝膠配制所用的TEMED和Tris-base(武漢鼎國生物技術(shù)有限公司)、硝酸纖維素膜(NC膜)(Bio-rad公司)、ECL試劑盒(Thermo Scientific公司)、活化的CrylAc和Cry2Aa蛋白(美國一龍公司Envirologix Inc.)。Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，PBS、PBST緩沖液和蛋白純化時(shí)所使用的Inclusion bingding buffer為本實(shí)驗(yàn)室配制，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)已發(fā)表的二化螟CAD1基因序列(GenBank: DQ821523.2)，采用Primer3web在線設(shè)計(jì)特異性引物，正向引物5′-TGGGGATCCATGGTAGCGGACAGCAGCCTGG-3′，反向引物5′-TCCCTCGAGTAGCCGGAATTGCTTGTTGGTGAAC-3′，為了便于將目的基因克隆到表達(dá)載體上，在正向、反向引物中分別設(shè)計(jì)了NotI和XhoI酶切位點(diǎn)(下劃線表示)。以二化螟中腸cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為20 μL：上下游引物各0.4 μL，模板1 μL，RNase-free Water 12.8 μL，LA TaqDNA聚合酶0.2 μL，LA Buffer 2.0 μL，dNTP 3.2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收純化，連接到peasy-T1載體上，轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑取陽性單克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

NotI和XhoI雙酶切含有CsCAD1的peasy-T1載體，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳純化并回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶連接同樣經(jīng)過雙酶切并回收的pET-28a-(+)載體，轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后挑取陽性單克隆對其進(jìn)行測序鑒定。

1.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定

將測序正確的pET-28a-(+)-CsCAD1重組質(zhì)粒1 μL加入100 μL Trans BL21感受態(tài)細(xì)菌中，加入800 μL的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，4000g離心2 min后，棄上清，留100 μL菌液重旋沉淀使其均勻，全部涂于含50 mg·L-1卡那霉素(Kana)的LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。第2天進(jìn)行PCR驗(yàn)證，取10 μL單克隆正確的菌液，于10 mL Kana液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至D600值達(dá)到0.5～0.8時(shí)，加IPTG至終濃度為1.0 mmol·L-1，于37 ℃繼續(xù)誘導(dǎo)4 h，以不加IPTG誘導(dǎo)作為陰性對照。誘導(dǎo)結(jié)束后，取該表達(dá)菌株，12000g離心1 min，棄上清，向沉淀加100 μL 1×SDS緩沖液重懸菌體，100 ℃水浴5 min使蛋白變性，置于-20 ℃冰箱保存。之后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.5 目的蛋白的Ni柱親和純化

由于二化螟CAD是以包涵體形式表達(dá)，需用10 mL含有8 mol·L-1尿素的Binding buffer平衡層析柱，另用含尿素的Binding buffer重懸沉淀，充分混勻，使包涵體溶解，4 ℃、12000g離心15 min，取上清液作為上樣樣品。往層析柱加入樣品，蓋緊蓋子，封口膜封好，待其與層析柱充分結(jié)合，先用10 mL Binding Buffer洗脫雜蛋白，再用不同質(zhì)量的咪唑和Binding Buffer配制成不同濃度的洗脫液(pH調(diào)至7.9)，依次洗脫目的蛋白并收集，從每管收集的純化蛋白中取出10 μL作為樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.6 Cry蛋白的定量制備

用PBS緩沖液溶解Cry1Ac、Cry2Aa的蛋白干粉，以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用分光光度計(jì)法制作其標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定樣品濃度，配好的Cry蛋白置-80 ℃保存。

1.7 目的蛋白CsCAD1與Cry1Ac、Cry2Aa的結(jié)合分析

將純化后的CsCAD1蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，用含5%脫脂牛奶的PBST在室溫下封閉2 h；分別轉(zhuǎn)移至含有蛋白量4、2、1 μg的Cry1Ac、Cry2Aa的PBST中，37 ℃孵育2 h；用PBST洗滌NC膜6次，每次5 min；然后與Cry1Ac、Cry2Aa的抗體(1∶3500)孵育2 h，再用PBST洗滌NC膜6次，每次5 min；之后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3500)孵育2 h，待NC膜晾干，采用ECL試劑盒發(fā)光顯色，顯影液觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsCAD1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將帶有重組質(zhì)粒CAD1—pET-28a-(+)的BL21菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測，并以未加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)作為陰性對照，從染色結(jié)果中可以看到，目的蛋白為一分子質(zhì)量44 Ku左右的蛋白條帶(圖1A)，其分子質(zhì)量與目的片段通過DNAman軟件預(yù)測的蛋白分子質(zhì)量相符合，初步表明目的蛋白成功表達(dá)。

將表達(dá)成功的目的蛋白經(jīng)Ni柱純化后，SDS-PAGE電泳顯示其條帶單一(圖1B)，表明純度較好，可用于后續(xù)Ligand blot分析與Cry蛋白的結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

圖1 二化螟CAD1蛋白的原核表達(dá)和純化Fig.1 The prokaryotic expression and purification of C. suppressalis CAD1A:二化螟CAD1蛋白的原核表達(dá)。M，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，未加IPTG誘導(dǎo)的總蛋白。2，IPTG誘導(dǎo)的總蛋白，箭頭所示為誘導(dǎo)蛋白所在位置；B:二化螟CAD1蛋白的純化，1～4分別為不同上樣量的純化蛋白。A: The prokaryotic expression of C. suppressalis CAD1. M， Protein standard. 1， Total protein induced without IPTG. 2， Total protein induced by IPTG. The arrow showed the location of the induced protein； B: The purification of C. suppressalis CAD1. 1～4， Purified proteins with different amounts.

2.2 CsCAD1蛋白與Cry1Ac、Cry2Aa的結(jié)合

為了檢測CsCAD1蛋白能否與Cry1Ac、Cry2Aa蛋白結(jié)合，進(jìn)行了Ligand blot實(shí)驗(yàn)。先在NC膜上封閉CsCAD1蛋白，將蛋白量分別為4、2和1 μg的Cry1Ac或Cry2Aa蛋白與NC膜結(jié)合，再分別與Cry1Ac或Cry2Aa的抗體結(jié)合，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，最后進(jìn)行顯色反應(yīng)。結(jié)果表明，Cry1Ac和Cry2Aa蛋白均能夠與CsCAD1蛋白結(jié)合，并且隨著Cry1Ac和Cry2Aa蛋白量的增加，CsCAD1蛋白與二者結(jié)合的條帶更亮(圖2)，表明在二化螟中CAD蛋白具有與Cry蛋白結(jié)合的能力，CAD1蛋白可能是Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的潛在受體。

3 討論

Cry蛋白與昆蟲中腸BBMV上的蛋白相結(jié)合是其發(fā)揮殺蟲活性的基礎(chǔ)，也是Cry殺蟲特異性的關(guān)鍵(Bravoetal.,2004)。2種公認(rèn)的Cry蛋白作用機(jī)制中，CAD作為結(jié)合蛋白均參與Cry蛋白的殺蟲活性。CAD是研究比較深入的受體蛋白，在不同的昆蟲中，被鑒定為不同Cry蛋白的結(jié)合蛋白或受體，或者同一昆蟲體內(nèi)多個(gè)結(jié)合蛋白參與Cry的活性功能，已報(bào)道CAD和APN是二化螟體內(nèi)Cry1Ad毒素的結(jié)合蛋白(Qiuetal.,2017)。本研究證實(shí)Cry1Ac和Cry2Aa蛋白可以與二化螟中腸的BBMVs結(jié)合，并能與原核表達(dá)的CsCAD1蛋白結(jié)合，這可能是Cry1Ac和Cry2Aa蛋白對二化螟起作用的重要機(jī)制。

圖2 二化螟CAD1與Cry1Ac、Cry2Aa蛋白的結(jié)合Fig.2 Binding reaction of C. suppressalis CAD1 with Cry1Ac and Cry2Aa proteinA:二化螟CAD1蛋白與Cry1Ac蛋白的結(jié)合,M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；1～3依次為上樣量4、2和1 μg的Cry1Ac蛋白。B:二化螟CAD1蛋白與Cry2Aa蛋白的結(jié)合，M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；1～3依次為上樣量4、2和1 μg的Cry2Aa蛋白。A: Binding reaction of C. suppressalis CAD1 and the Cry1Ac protein. M， Protein Standard. 1～3， Cry1Ac toxin of 4 , 2 and 1 μg, respectively; B: Binding reaction of C. suppressalis CAD1 and the Cry2Aa protein. M， Protein Standard. 1～3， Cry1Ac toxin of 4 , 2 and 1 μg, respectively.

CAD定位于中腸上皮細(xì)胞，不同物種中CAD作為結(jié)合蛋白的功能并不相同，這已在部分鱗翅目、鞘翅目和雙翅目昆蟲的中得到驗(yàn)證(Parketal.,2014)。一些鱗翅目昆蟲體內(nèi)CAD已經(jīng)被鑒定為Cry1A蛋白的受體，如棉鈴蟲、棉紅鈴蟲、甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner和歐洲玉米螟等(Flannaganetal.,2005; Morinetal.,2003; Wangetal.,2016)。由于昆蟲物種的豐富性和Cry毒性的多樣性，不同物種中CAD蛋白的作用差異較大(Renetal.,2016; Stevensetal.,2017)。甜菜夜蛾CAD蛋白報(bào)道作為Cry1Ca受體(Gongetal.,2015; Renetal.,2016)，然而，基因沉默其80%CAD基因表達(dá)僅導(dǎo)致其對Cry1Ca的敏感性降低50%，表明甜菜夜蛾體內(nèi)還存在其他的Cry1Ca結(jié)合蛋白或受體(Gongetal.,2015; Renetal.,2016)。表達(dá)HvCAD (HeliothisvirescensCAD)的細(xì)胞可與Cry1A蛋白結(jié)合，但不能與Cry1Fa結(jié)合(Jurat-Fuentes & Adang,2006; Soberonetal.,2018)。相反，有報(bào)道Cry1A和Cry1Fa在H.virescens中腸膜上具有共同的結(jié)合位點(diǎn)，并且Cry1Ac抗性的Heliothisvirescens與Cry1Fa存在交互抗性(Gouldetal.,1995; Soberonetal.,2018)。后來研究表明，HvCAD是Cry1A類蛋白而不是Cry1Fa蛋白的唯一受體，交互抗性可能是與CAD不同的其他結(jié)合蛋白的突變引起的(Jurat-Fuentes & Adang,2006; Soberonetal.,2018)。小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(L.)體內(nèi)Cry1Ac的功能受體是ABCC2而不是CAD蛋白，CAD蛋白起輔助作用，其CAD在Bt作用機(jī)理中的重要性隨著鱗翅目昆蟲種類的不同而變化(Stevensetal.,2017)。小粉蟲Alphitobiusdiaperinus(Panzer)體內(nèi)一個(gè)185 ku AdCad1蛋白被鑒定為Cry3Bb蛋白的受體，沉默AdCad1基因?qū)е滦》巯x對Cry3Bb的敏感性明顯降低(Huaetal.,2014)。雙翅目昆蟲中，CAD調(diào)節(jié)埃及伊蚊AedesAegypti(L.) Cry11Aa對其幼蟲的毒性，沉默其CAD基因?qū)е缕鋵ry11Aa的敏感性降低(Leeetal.,2015; Rodriguez-Almazanetal.,2012; Zhangetal.,2015)。研究顯示,岡比亞按蚊AnophelesgambiaeGiles體內(nèi)2個(gè)CAD基因中，AgCad1蛋白不是Cry11Ba的受體，AgCad2蛋白可能是Cry11Ba的功能受體(Huaetal.,2013)。同樣，埃及伊蚊中，沉默CAD基因并不影響Cry4Ba的毒性，而沉默CAD基因?qū)е掠紫x對Cry11Aa展現(xiàn)較高的抗性(Rodriguez-Almazanetal.,2012; Soberonetal.,2018)。相反，轉(zhuǎn)染SeCAD細(xì)胞并沒有增加對Cry1Ac的敏感性，但卻導(dǎo)致了對Cry1C蛋白的敏感(Renetal.,2016; Soberonetal.,2018)。

許多昆蟲對Cry蛋白的作用機(jī)制和抗性機(jī)制存在明顯差異，只有深入研究每個(gè)物種的具體情況才能更好地應(yīng)用Cry蛋白進(jìn)行害蟲防治(Fabrick & Wu,2015)。對二化螟CAD蛋白最新研究發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾CAD1或CAD2基因后二化螟幼蟲具有低死亡率和高存活率，表明CAD1或CAD2基因的表達(dá)與Cry2A和Cry1C蛋白在二化螟體內(nèi)的毒性相關(guān)(Zhangetal.,2017)。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)CAD1蛋白可與Cry1Ac和Cry2Aa蛋白相結(jié)合，是它們潛在的受體蛋白，為二化螟體內(nèi)Cry蛋白的結(jié)合蛋白和/或潛在的受體蛋白的研究提供基礎(chǔ)。