高嫚妮 潘忠成 高波 楊宏勃 陳豪 翁婧 李蒲民

摘?要：

從銀杏樹林土壤中分離放線菌，并用生長速率法測(cè)得其對(duì)植物病原菌具有拮抗活性，且抑制率達(dá)到80.00%以上。杯碟法測(cè)量結(jié)果表明菌株MKLFXJ-I發(fā)酵液對(duì)9種植物病原菌均具有抑菌活性。通過菌種培養(yǎng)形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析，初步鑒定菌株MKLFXJ-I為鏈霉菌Streptomyces sp.。

關(guān)鍵詞：

放線菌;拮抗作用;生長速率法;鑒定

中圖分類號(hào)：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191230003

化學(xué)農(nóng)藥制劑長期大量使用促使植物病原菌產(chǎn)生抗藥性的問題已越來越嚴(yán)重，同時(shí)化學(xué)藥劑會(huì)給生態(tài)平衡帶來嚴(yán)重的不良影響，因此開發(fā)高效、低毒、綠色的生物農(nóng)藥產(chǎn)品迫在眉睫。近幾年來，利用微生物資源開發(fā)生物藥劑防治病害成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[1]，放線菌因分布廣泛、種類多樣，可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)豐富的具有抗菌活性的物質(zhì)，且易降解，環(huán)境相容性好，使其在微生物農(nóng)藥開發(fā)中占據(jù)首要位置[2]。放線菌用于植物病害的防治已有很多報(bào)道[3，4]，其中以鏈霉菌的研究最為廣泛和深入，也最具有生防利用價(jià)值。Umezawa H[5]等從日本奈良縣春日神社境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的春日鏈霉菌，經(jīng)研究其代謝產(chǎn)物，開發(fā)出了春雷霉素，廣泛應(yīng)用于水稻稻瘟病、黃瓜枯萎病、大白菜黑腐病等多種病害的防治。后來，沈寅初[6]從江西土良地區(qū)也分離到了1株春雷霉素產(chǎn)生菌，命名為小金色鏈霉菌。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所從海南地區(qū)土壤中分離到1株鏈霉菌，后續(xù)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物防治研究所將其開發(fā)成一種生物農(nóng)藥-中生菌素，通過多年田間試驗(yàn)表明，該抗生素對(duì)水稻白葉枯病、大白菜軟腐病、蘋果輪紋病和蘋果早期落葉病等具有良好的防治效果[7，8]。本研究針對(duì)從銀杏林土壤中分離得到的放線菌MKLFXJ-I，測(cè)定了該菌對(duì)植物病原菌拮抗活性及其代謝物的抗菌活性，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，以期能獲得結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的先導(dǎo)化合物，為開發(fā)新型生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1?材料

植物病原：蘋果輪紋病菌、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌、蘋果褐斑病菌、小麥赤霉病菌、稻瘟病、煙草赤星病菌、蘋果腐爛病菌、水稻白葉枯病菌及柑橘潰瘍病菌，由貴州凱里學(xué)院黔東南民族藥綜合利用工程中心提供。

2?方法

2.1?菌種的分離與純化

從銀杏林取適量土樣，將其自然風(fēng)干，過60目篩。再采用稀釋法，在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上對(duì)菌種進(jìn)行劃線培養(yǎng)，分離，純化。最后從培養(yǎng)基上挑取單菌落接種到斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3d，置于冰箱4℃保存。

2.2?放線菌拮抗活性測(cè)試

在NA培養(yǎng)基上活化柑橘潰瘍病菌和水稻白葉枯病菌，用蒸餾水將其配制成濃度約為106個(gè)/mL的細(xì)菌菌懸液，分別取100μL加入融化的NA培養(yǎng)基中，混勻，倒皿，制成含菌平皿。在PDA培養(yǎng)基上活化菌株，用打孔器取帶有單菌落的菌餅，將菌餅帶菌絲的一面貼在制好的含病原細(xì)菌的培養(yǎng)基表面。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，置于28℃培養(yǎng)2d，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

在PDA培養(yǎng)基上活化植物病原真菌（蘋果輪紋病菌、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌、蘋果褐斑病菌、小麥赤霉病菌、稻瘟病、煙草赤星病菌、蘋果腐爛病菌），分別將病原真菌制成濃度約為106個(gè)/mL的孢子懸液，再分別取100μL孢子懸液與融化的PDA混勻，倒皿。菌餅處理如上，于30℃培養(yǎng)5d，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

2.3?放線菌液體培養(yǎng)及發(fā)酵濾液抑菌活性測(cè)定

將菌株MKLFXJ-I接種在PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，用無菌蒸餾水洗下孢子懸液，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖20g，玉米粉10g，黃豆粉20g，酵母膏1g，（NH4）2SO4 3g，K2HPO4 0.20g，MgSO4 0.25g，NaCl 3.00g，F(xiàn)eSO4 0.01g，CaCO3 5.00g，蒸餾水1L， pH7.0～7.2），28℃，180rpm/min振蕩培養(yǎng)5 d，4000rpm/min離心，收集上清液。

采用生長速率法[9]?測(cè)試發(fā)酵液對(duì)真菌活性，把1mL發(fā)酵液（經(jīng)0.22 μm微孔濾膜）與9mL融化的PDA培養(yǎng)基混勻，倒皿，制成含藥平皿。用打孔器分別取病原真菌菌塊，反面接種在含藥平皿上，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，30℃培養(yǎng)5d，用十字交叉法測(cè)量供試菌菌落直徑，計(jì)算抑制率。

抑制率（%）=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）]×100

采用杯碟法[10]對(duì)菌株MKLFXJ-I發(fā)酵液對(duì)柑橘潰瘍病菌和水稻白葉枯病菌的抑菌活性。將其用蒸餾水其配制成濃度約為106個(gè)/mL的細(xì)菌菌懸液，分別取100μL加入融化的NA培養(yǎng)基中，混勻，倒皿，制成含菌平皿。在含菌平皿上等距放置牛津杯，牛津杯內(nèi)加入250μL發(fā)酵液，每個(gè)處理各設(shè)3個(gè)重復(fù)。30℃培養(yǎng)20～48h，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

2.4?放線菌MKLFXJ-I菌株鑒定

2.4.1?形態(tài)觀察與培養(yǎng)特征

采用插片法[11]，將菌株接種在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)5～7d，參考閻遜初[12]所用的方法，進(jìn)行光學(xué)顯微鏡20倍下觀察菌株基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲的形態(tài)特征。參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[13]，觀察菌株MKLFXJ-I在8種不同培養(yǎng)基上的生長特性。

2.4.2?生理生化特征檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[12]的方法，對(duì)菌株的生理生化特征進(jìn)行測(cè)定，具體分析菌株MKLFXJ-I對(duì)不同碳源和不同氮源利用、對(duì)硝酸鹽的還原、對(duì)牛奶的影響以及是否產(chǎn)酪氨基酸酶和淀粉酶等。

2.4.3?16S rRNA基因序列分析

2.4.3.1?DNA提取

用DNA試劑盒提取菌株MKLFXJ-I的DNA。具體包括：菌株在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d，收集菌絲;向菌體沉淀中加入200μL緩沖液GA，振蕩至菌體徹底懸浮;向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混勻;加入220μL緩沖液GB，振蕩15s，70℃放置10min，溶液變的清亮，簡短離心以除去管蓋內(nèi)壁的水珠;加220μL無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時(shí)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以除去管蓋內(nèi)壁的水珠;將上一步所得溶液和絮狀沉淀加入一個(gè)吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中;向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中;向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中;將吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液;將吸附柱CB3放入干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加60μL洗脫緩沖液TE，室溫放置數(shù)分鐘，12000rpm離心2 min，將溶液收集到離心管中（-20 ℃冰箱保存）。

2.4.3.2?聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增反應(yīng)

采用細(xì)菌16S通用引物[14]進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件見表1。

PCR反應(yīng)流程為：95℃預(yù)變性3min后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min，以保證獲得全長產(chǎn)物。

2.4.3.3?瓊脂糖凝膠的制備

配濃度為1%的膠（30mL 1×TBE緩沖液，0.3g瓊脂糖），加熱至瓊脂糖溶化，混勻;

在制膠槽上放上制膠板，調(diào)整水平插上樣品梳子;

把瓊脂糖溶液倒入膠板中，加入3 μL的4s-Green核酸染料溶液，充分混勻，注意避免氣泡產(chǎn)生;

在凝膠完全凝固后，拔下梳子。

2.4.3.4?DNA樣品檢測(cè)

將凝膠放入電泳槽中，電泳緩沖液要沒過凝膠;

取樣品5μL，加入樣品槽中;

連接電泳儀的正負(fù)極，用120V的穩(wěn)定電壓進(jìn)行電泳，計(jì)時(shí)20min;

將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中掃描，觀察DNA條帶，并拍攝照片;

將目的條帶膠回收，樣品由中科院微生物研究所測(cè)序。

2.4.3.5?系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

先將測(cè)得的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行BLAST相似性分析，再從GenBank中獲得和實(shí)驗(yàn)菌株序列相似的種屬的16S rDNA序列22株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

3?結(jié)果與分析

3.1?放線菌分離

采用劃線法從銀杏林土壤中分離得到1株放線菌，公司將其命名為MKLFXJ-I。

3.2?菌株皿內(nèi)拮抗活性

由表2可知，菌株MKLFXJ-I對(duì)9種供試病原菌生長均具有不同程度的抑制作用，其中對(duì)柑橘潰瘍病菌和水稻白葉枯病菌的抑制圈直徑分別為15.52±0.12mm和8.06±0.22mm;對(duì)蘋果輪紋病菌、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌、蘋果褐斑病菌、小麥赤霉病菌、稻瘟病、煙草赤星病菌、蘋果腐爛病菌的抑菌透明圈均在10cm以上。

3.3?菌株發(fā)酵液抑菌活性測(cè)試

由表3可知，菌株發(fā)酵原液對(duì)7種供試植物病原真菌菌絲生長具有不同程度的抑制作用，對(duì)蘋果腐爛病菌和蘋果斑點(diǎn)落葉病菌的抑制率達(dá)到了98%以上，對(duì)其它病原菌的抑制率均大于60%;由表4可知對(duì)柑橘潰瘍病菌和水稻白葉枯病菌均具有抑制作用，抑菌圈直徑平均值分別為35.23±1.34mm和22.45±0.98mm。

3.4?形態(tài)特征

菌株MKLFXJ-I在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7d，氣生菌絲為白色;基內(nèi)菌絲為豆汁黃色;孢子絲直、柔曲、鉤狀、螺旋形;孢子柱形、橢圓形。

3.5?培養(yǎng)特征

結(jié)果見表5，菌株在8中不同培養(yǎng)基上均不產(chǎn)可溶性色素，氣生菌絲白色或無色，基內(nèi)菌絲淺黃、白色、棕黃或棕色。

3.6?生理生化特征

結(jié)果見表6，菌株MKLFXJ-I能利用葡萄糖、甘露糖、甘露醇、乳糖、山梨糖、山梨醇、麥芽糖、鼠李糖、海藻糖、果糖、木糖、核糖、糖原、阿拉伯糖、水楊苷、苦杏仁苷、赤蘚醇、肌醇、甘油、纖維二糖、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉等碳源，不能利用半乳糖、蔗糖、蜜二糖、松三糖、菊糖、棉籽糖、蘋果酸鈉、葡萄糖酸鈉等碳源;能利用賴氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和丙氨酸。不能還原硝酸鹽，可使牛奶凍化，但不凝凍，能產(chǎn)生淀粉酶水解淀粉，產(chǎn)酪氨基酸酶。

3.7?16S rDNA基因序列測(cè)定結(jié)果

將測(cè)得的16S rDNA序列在NCBI中在線BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示菌株屬于連霉屬放線菌，再從GenBank中獲得和實(shí)驗(yàn)菌株序列相似的種屬的16S rDNA序列22株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。因該菌株與鏈霉屬下面的種16S rDNA序列相似性均較低，因此無法鑒定到種（圖1）。

4?討論

本研究對(duì)銀杏林土壤中的放線菌進(jìn)行分離，并對(duì)其進(jìn)行了皿內(nèi)拮抗試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)柑橘潰瘍病菌和水稻白葉枯病菌以及7種植物病原真菌均具有較強(qiáng)的拮抗活性，表明菌株在培養(yǎng)基上可產(chǎn)拮抗活性物質(zhì)。

發(fā)酵原液的生物活性測(cè)試結(jié)果表明，菌株MKLFXJ-I的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)供試植物病原真菌和細(xì)菌均有一定程度的抑制作用。其中對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌、蘋果輪紋病菌和蘋果腐爛病菌的抑制作用明顯，在農(nóng)藥的開發(fā)和利用方面具有一定的開發(fā)潛力。因此，下一步重點(diǎn)研究將針對(duì)該菌株發(fā)酵產(chǎn)物中活性組分的分離、純化和鑒定。

通過對(duì)菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特征和生理生化特性及分子生物學(xué)的研究，初步鑒定該菌株為鏈霉菌。因?yàn)锽LAST進(jìn)行基因序列比對(duì)分析，打分相似性最高的為97%，從進(jìn)化樹分析看，與距離該菌株比較近的菌株打分低，因此無法鑒定到種，由此表明該菌株可能是1個(gè)新菌種，因此還有待于采用其它生理生化和分子生物學(xué)手段進(jìn)一步進(jìn)行分析。

參考文獻(xiàn)

[1] Sharma N， Sharma S. Control of foliar diseases of mustard by Bacillus from reclaimedsoil[J]. Microbiological Research， 2008， 163（04）： 408-413.

[2]張麗， 紀(jì)明山， 谷祖敏， 田宏哲， 李修偉， 李興海. 印楝內(nèi)生放線菌鑒定及對(duì)稻瘟病菌拮抗作用研究[J].中國生物防治學(xué)報(bào)， 2014， 30（04）： 534-539.

[3]Okami Y， Hotta K. Search and Discovery of NewAntibiotics[M]. Actinomycetes in Biotechnology. 1988：33-67.

[4]胡燕梅， 楊龍. 利用微生物防治植物病害的研究進(jìn)展[J]. 中國生物防治， 2006， 22（Sl）： 190-193.

[5]Umezawa H， Hamada M， Suhara Y， Hashimoto T， Ikekawa T. Kasugamycin， a new antibiotic[J]. Antimicrob Agents Chemother （Berhesda）， 1965（5）： 753-757.

[6]沈寅初. 國內(nèi)外農(nóng)用抗生素研究和發(fā)展概況[J]. 抗生素， 1981（02）： 57-64，48.

[7]謝德齡， 倪楚芳， 朱昌雄， 黃克慧， 孔都. 中生菌素（農(nóng)抗751）防治白菜軟腐病的效果試驗(yàn)初報(bào)[J]. 生物防治通報(bào)， 1990（02）： 74-77.

[8]趙白鴿， 孔健， 申效誠， 王文夕， 程紅梅. 蘋果輪紋爛果病生物防治研究初報(bào)[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 1993， 12（04）： 67-70.

[9]潘金菊， 于婷， 尚玉珂， 慕衛(wèi)， 劉峰. 生防菌BMP-11對(duì)瓜果腐霉病菌的抑制活性及其鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2008， 35（4）： 311-316.

[10]馬海丹， 周文明， 吳紹東. 拮抗放線菌M_（18）的分離鑒定及殺菌活性研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2007， 16（05）： 291-294.

[11]Park， D. H.， Kim， J. S.， Kwon， S. W.， Wilson， C.， Yu， Y. M.， Hur， J. H.， Lim， C. k. Streptomyces luridiscabiei sp. nov.， Streptomyces puniciscabiei sp. nov.and Streptomyces niveiscabiei sp. nov. which cause potato common scab disease in Korea[J]. Intemational Journal Systematic and Evolutionary Microbiology， 2003（06）： 2049-2054.

[12]閻遜初. 細(xì)菌和放線菌的鑒定[M].北京： 科學(xué)出版社， 1958.

[13]中國科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊(cè)[M].北京： 科學(xué)出版社， 1975.

[14]Silvia G Acinas， Francisco Rodriguez-Valera， Carlos Pedrós-Alió. Spatial and temporal variation in marine bacterioplankton diversity as shown by RFLP fingerprinting of PCR amplified 16SrDNA[J]. FEMS Microbiology Ecology， 1997， 24（01）： 27-40.

作者簡介：

高嫚妮（1988-），女，碩士。研究方向：應(yīng)用微生物及生物醫(yī)藥;

潘忠成（1974-），男，博士。研究方向：應(yīng)用微生物及生物醫(yī)藥。