王婉蓉，代 科，馬小雨，楊 振，曹三杰，黃小波，趙 勤，伍 銳，文翼平

(四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院豬病研究中心，四川 成都611130)

副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)是一種條件性致病菌，隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，HPS病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的典型細菌性疾病之一，該病近年來給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失[1]。使用抗生素是目前控制和治療HPS病的重要措施，但也引起了HPS耐藥性的問題。該致病菌極易對鏈霉素(Streptomycin，SM)產(chǎn)生耐藥。SM通過與結(jié)核分枝桿菌和球形芽孢桿菌等16S rRNA(rrs基因編碼)和核糖體蛋白S12(rpsL基因編碼)結(jié)合造成其核糖體合成異?；虍a(chǎn)生無功能的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細菌新陳代謝等生命活動障礙[2]。目前關(guān)于SM抗性的研究報道主要見于結(jié)核分枝桿菌，大多數(shù)SM抗性突變體的產(chǎn)生是由于rpsL基因錯義突變造成的，其中，K43R和K88R是較常見的突變，與高水平的耐藥性有關(guān)[3-7]。本研究采用甲基磺酸乙酯(EMS)對HPS進行化學誘變。EMS是一種廣泛用于誘導(dǎo)植物和細菌整個基因組隨機突變的化學誘變劑，可以導(dǎo)致單一堿基對改變而形成點突變[8]。利用EMS的高頻隨機突變特性和相應(yīng)的篩選、測序方法，可能會發(fā)現(xiàn)造成相應(yīng)表型差異的分子基礎(chǔ)(基因突變位點)，例如Redfield團隊采用EMS對低自然轉(zhuǎn)化頻率的流感嗜血桿菌KW20進行誘導(dǎo)和篩選，多次發(fā)現(xiàn)了提高自然轉(zhuǎn)化頻率的基因突變位點[9-10]。

現(xiàn)已有較多關(guān)于細菌對SM耐藥性分子機制的相關(guān)報道，而關(guān)于HPS SM耐藥性的分子機制還鮮有報道。本研究通過EMS誘導(dǎo)并篩選SM抗性突變體，然后對轉(zhuǎn)化子的rpsL和rrs基因進行測序分析，鑒定SM抗性突變位點，與文獻報道的其它細菌的SM抗性點突變位置進行比對，判斷HPS的SM抗性位突變來源是否與研究的其它細菌的突變情況一致；采用位點引導(dǎo)性點突變技術(shù)及自然轉(zhuǎn)化法對HPS的rpsL基因進行定點突變，并通過對該突變株SM抗性水平檢測以進一步驗證篩選出的點突變與SM抗性的關(guān)聯(lián)性，為完善HPS耐SM分子機制的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑HPS SC1401由四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院豬病研究中心分離、鑒定并保存；pK18mobSacB自殺質(zhì)粒培養(yǎng)在大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中；胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購自美國BD公司；LA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基購自Hopebio公司；新生牛血清購自Gibco公司；添加有新生牛血清和NAD的胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA++)、添加有新生牛血清和NAD的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB++)均購自Difco公司；硫酸卡那霉素(100 mg/mL)、鏈霉素(100 mg/mL)購自TIANGEN公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD)購自 TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒(E.Z.N.ATMPlasmid Miniprep Kit)、細菌基因組提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；誘導(dǎo)劑甲基磺酸乙酯(EMS)購自BIOSHARP公司；點突變試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 HPS野生型菌株對SM最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)的測定無菌配制16 384 μg/mL的SM儲存液，參照文獻[11]，采用96孔板和2倍倍比稀釋法測定HPS SC1401對SM的MIC、MBC值，其中，測定MBC時SM的濃度梯度為8 μg/mL～8 192 μg/mL。

1.3 HPS最適EMS誘變濃度的篩選無菌條件下，將HPS SC1401菌株劃線接種于TSA++平板過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于3 mL TSB++，置于空氣搖床過夜培養(yǎng)制成菌懸液。配制2.68 nmol/L的EMS，將 3 mL菌懸液分別與濃度為 0(對照組)、1.34 nmol/L、2.68 nmol/L、4.02 nmol/L、5.36 nmol/L(實驗組)的EMS混和，于37℃搖床過夜培養(yǎng)。觀察HPS的生長情況，以不抑制細菌生長的最大EMS濃度作為其最適誘變濃度。

1.4 誘導(dǎo)后的SM抗性突變菌株rpsL和rrs基因的擴增及序列分析在SC1401菌液中加入EMS，使其終濃度為1.3中測定的最適誘變濃度，于37℃搖床培養(yǎng) 12 h～24 h，取 200 μL誘變的第一代細菌(F1)接種到2 mL新鮮無抗性的 TSB++中使細菌的活力得以恢復(fù)，于37℃搖床培養(yǎng)12 h～24 h。采用相同方法誘導(dǎo)得到F2、F3等，一直誘導(dǎo)到F11代。每誘導(dǎo)一代，取150 μL菌液涂布于SM濃度為60 μg/mL(按 1.2中測定的 MIC結(jié)果)的 TSA++平板上(TSA++SM)，37℃培養(yǎng)12 h～24 h。隨機挑取平板中的單菌落，進一步培養(yǎng)在SM濃度為100 μg/mL的TSB++肉湯中(TSB++SM)，置37℃搖床培養(yǎng)12 h，對篩選的能在TSB++SM中生長的疑是SM突變菌株進行突變位點分析。

根據(jù)GenBank登錄的HPS SC1401菌株全基因組(CP015099)中rpsL和rrs基因序列，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計rpsL和rrs基因擴增引物(表1)，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取上述篩選出的不同代次SM抗性突變菌株的基因組。以該基因組為模板分別PCR擴增rpsL基因和rrs基因，反應(yīng)程序為：98℃ 3 min；98℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 8 min。PCR產(chǎn)物由海英駿公司測序。用DNAMAN 6.06軟件對SM抗性突變菌株的rpsL基因、rrs基因與未突變的HPS SC1401菌株的相應(yīng)基因序列進行比對分析，鑒定突變位點，對突變位點與抗性水平之間的關(guān)系進行初步分析。

表1 HPS菌株SC1401的rpsL和rrs基因擴增引物Table 1 Primers sequence used in this study

1.5 SM抗性定點突變株的構(gòu)建和PCR測序分析根據(jù)1.4對SM抗性菌株rpsL基因與rrs基因的測序結(jié)果分析后，針對篩選出來的SM抗性菌株的rpsL基因點突變位置進行人工定點突變，以驗證突變菌株產(chǎn)生SM抗性的基因。以HPS SC1401的基因組DNA為模板，采用rpsL-P1/P2引物擴增整個rpsL基因序列并連接到自殺載體pK18mobSacb中，構(gòu)建野生型質(zhì)粒pkrpsL。參照點突變試劑盒說明書，采用primer 5.0設(shè)計突變引物rpsL-43-P1/P2和rpsL-88-P1/P2(表 1)，并通過反向 PCR獲得用于構(gòu)建rpsL基因特定位點(128號和263號位堿基，即rpsL基因ORF第43號和第88號位密碼子)突變質(zhì)粒pkrpsL43(A128G)和 pkrpsL88(A263G)。采用自然轉(zhuǎn)化的方法將以上兩種突變型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到親本株中，產(chǎn)生SM抗性點突變菌株1401D43和1401D88。使用TSA++SM篩選培養(yǎng)，對該兩株抗體菌株進行rpsL基因的PCR擴增，并對PCR產(chǎn)物進行測序驗證。

1.6 SM抗性突變菌株MIC、MBC測定及抑菌環(huán)試驗采用1.2的方法對EMS誘導(dǎo)產(chǎn)生的F7-1和F8-1(隨機選取EMS誘導(dǎo)的第7代和第8代SM抗性菌株的其中一株)以及SM定點抗性突變的菌株1401D43、1401D88分別測定 MIC、MBC。并將其與野生型HPS SC1401MIC、MBC進行比較分析。

對親本株 SC1401和各突變株 CF7-1、F8-1、1401D43及1401D88上適當稀釋，保證各組OD600nm相同。取上述100 μL稀釋菌液涂布于TSA++平板，靜置數(shù)分鐘后將平板劃分為兩部分，將牛津杯垂直輕放于區(qū)域中心的瓊脂表面，輕壓使之無縫接觸。分別將 8 192 μg/mL、4 096 μg/mL的 SM 溶液各100 μL加入牛津杯中，置 37℃培養(yǎng) 12 h～24 h。觀察并測量各個菌株抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPS野生菌株SC1401的MIC、MBC測定結(jié)果通過二倍倍比稀釋法測定HPS親本株SC1401對SM的MIC和MBC，結(jié)果顯示SC1401的MIC為24 μg/mL，MBC 為 32 μg/mL，因此，在后續(xù)試驗中使用濃度為60 μg/mL的 SM對 HPS SC1401篩選SM抗性突變菌株。

2.2 HPS SC1401最適EMS誘變濃度的篩選將系列梯度濃度EMS和HPS混合培養(yǎng)，結(jié)果顯示高濃度EMS具有較強的抗菌活性。EMS濃度為2.68 nmol/L、4.02 nmol/L、5.36 nmol/L的離心管中未見到絮狀菌，濃度為1.34 nmol/L的離心管中可見絮狀菌，但菌濃度(比濁法)比對照組(EMS濃度為0)低。表明當EMS終濃度高于2.68 nmol/L時，對HPS的生長具有抑制作用，因此誘導(dǎo)HPS SC1401突變的EMS最適濃度為1.34 nmol/L。

2.3 SM抗性突變菌株的篩選及耐藥基因測序分析以最適濃度1.34 nmol/L的EMS間斷誘導(dǎo)HPS SC1401菌株，經(jīng)過TSA++SM篩選，顯示 F1、F2、F3和F7至F11代的HPS均產(chǎn)生了SM抗性，對陽性轉(zhuǎn)化子進行基因組提取、rpsL和rrs基因PCR擴增以及測序分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)1、F2、F3代的耐藥菌的rpsL和rrs基因并未發(fā)生突變，而 F7～F11代的SM耐藥菌株均僅rpsL基因發(fā)生突變，突變位點為rpsL基因的第43號位密碼子和88號位的密碼子，未發(fā)現(xiàn)其它位點發(fā)生突變，并且也未發(fā)現(xiàn)43號和88號密碼子同時發(fā)生突變的耐藥菌株。突變位點的密碼子由AAA突變?yōu)锳GA，其對應(yīng)編碼的氨基酸由Lys(賴氨酸)突變?yōu)锳rg(精氨酸)，這與報道的結(jié)核分枝桿菌結(jié)果一致[3]。也未發(fā)現(xiàn)rrs基因發(fā)生突變。盡管HPS與結(jié)核分枝桿菌的rpsL基因僅有58.67%相似性，但其抗SM的分子機制(突變位點及類型)卻呈現(xiàn)出高度的相似性，表明這兩種細菌抗SM的分子機制類似。

根據(jù)測序結(jié)果統(tǒng)計分析(表2)，在誘變產(chǎn)生的耐藥菌中，rpsL基因中這兩個區(qū)域比rrs和其它基因位點更容易發(fā)生突變，由此推測rpsL基因第43號位和第88號位密碼子突變是阻礙SM與細菌核糖體結(jié)合的主要突變位點。雖然有關(guān)報道表明rrs基因也與SM抗性有關(guān)，但本研究并未在rrs基因中發(fā)現(xiàn)任何突變，這可能是由于該基因突變未能引起高耐藥水平而低于本實驗檢測限；或該基因突變效率不高而未能有效篩選出來，因此在HPS中，rrs基因突變是否引起SM耐藥水平的提高以及具體的突變位點和突變類型有待進一步研究。F1、F2和F3代SM耐藥菌基因測序結(jié)果提示，使用EMS誘導(dǎo)得到的前幾代耐藥菌產(chǎn)生的抗性可能不穩(wěn)定，容易回復(fù)至SM敏感水平。

2.4 HPS SM抗性定點突變株的構(gòu)建及突變位點測序驗證對TSA++SM篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子進行測序分析。采用表1中的引物擴增1401D43和1401D88的rpsL基因，并對PCR產(chǎn)物進行測序驗證。結(jié)果顯示，篩選得到的抗性菌株1401D43和1401D88分別在預(yù)期密碼子位置(rpsL基因ORF第43號和第88號位)發(fā)生了點突變，均由AAA突變成了AGA，其編碼的氨基酸殘基由Lys(賴氨酸)變成了Arg(精氨酸)。表明，通過人工定點突變試驗構(gòu)建了SM抗性定點突變株，其突變位置與EMS誘變突變菌株一致。

表2 SM抗性菌株rpsL、rrs基因測序結(jié)果分析Table 2 Analysis of the sequence of rpsL and rrs of SM resistant strains

2.5 SM抗性突變菌株MIC、MBC及抑菌環(huán)試驗結(jié)果經(jīng)檢測，EMS誘導(dǎo)的抗性突變株F7-1和F8-1的MIC和MBC均高于8 192 μg/mL，表現(xiàn)出對SM完全耐藥(表 3)；抗性突變菌株 1401D43、1401D88的 MIC和 MBC同樣高于 8 192 μg/mL，二者表型相符。表明不論是EMS誘變突變菌株還是定點點突變菌株均對SM完全耐藥。由此判斷HPS的SM耐藥性與rpsL基因突變相關(guān)。1401D43和1401D88與EMS誘變突變菌株表型一致，進一步驗證了rpsL基因第43號位和第88號位密碼子突變與SM抗性產(chǎn)生有關(guān)。

表3 HPS對SM的MIC、MBC測定結(jié)果Table 3 Detection of MIC and MBC of H.parasuis strains to SM

抑菌環(huán)試驗結(jié)果顯示抗性突變菌株F7-1、F8-1、1401D43和1401D88可以在置有SM溶液濃度為8 192 μg/mL 和 4 096 μg/mL 牛津杯的 TSA++上形成完整的菌苔，而親本菌株SC1401則形成了直徑為40 mm的抑菌環(huán)(圖1)，表明突變菌株比親本株SM的抗性更高。由此推測rpsL基因第43號位密碼子和第88號位密碼子的突變和高SM抗性有關(guān)，這與巴塞羅那地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌的研究結(jié)果類似[12]。這兩個位點的突變很有可能是導(dǎo)致SM耐藥的主要原因。

圖1 SM抗性突變菌株抑菌環(huán)試驗結(jié)果Fig.1 Inhibition ring test of SM resistant strains

本研究建立了EMS間歇誘導(dǎo)HPS突變的方法，并篩選出導(dǎo)致HPS對SM完全耐藥的主要突變位點。結(jié)果顯示，HPS的SM抗性主要由HPSrpsL基因第43號和第88號密碼子突變引起，初步判斷這種突變導(dǎo)致HPS核糖體蛋白S12翻譯異常，致使HPS對SM耐藥性的產(chǎn)生。本實驗對HPS采用EMS誘導(dǎo)產(chǎn)生SM抗性菌株的方法和定點突變產(chǎn)生SM抗性菌株的方法為該菌的遺傳操作提供了新的參考，同時為完善HPS SM耐藥性的分子研究提供一定的參考依據(jù)。