李玉嬌， 王紅英， 張峰波， 劉 斌， 楊 妍， 沙 桐， 龐楠楠， 丁劍冰,3

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院， 烏魯木齊 830054； 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 3省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011)

細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcosis granulosus，Eg)慢性感染會(huì)造成宿主肝臟進(jìn)行性的損害，該寄生蟲以糞-口途徑為主感染宿主[1-2]，該病的主要傳染源是犬類和狐貍等野生動(dòng)物[3-4]。疫苗是預(yù)防包蟲病最經(jīng)濟(jì)又有效的方式，保護(hù)性抗原的尋找成為研究的熱點(diǎn)[5]。曹春寶等[6]首次克隆并擴(kuò)增存在于細(xì)粒棘球蚴中的新基因EgG1Y162，該抗原基因已送登基因庫(Genebank:AB462014)。經(jīng)過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，EgG1Y162重組抗原是一類有效的針對(duì)包蟲的終末宿主-犬的疫苗。本實(shí)驗(yàn)室篩選的這一新的保護(hù)性抗原EgG1Y162，有自主使用權(quán)。馬秀敏等[7]用BCG結(jié)合EgG1Y162進(jìn)行重組構(gòu)建也發(fā)現(xiàn)該疫苗具有比較好的免疫原性，能夠激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。ZHANG等[8]運(yùn)用生信學(xué)的方法對(duì)EgG1Y162抗原進(jìn)行T-B聯(lián)合表位的預(yù)測(cè)，定位了優(yōu)勢(shì)T-B聯(lián)合表位的位置，根據(jù)其位置將該基因片段重組構(gòu)建為EgG1Y162-1和EgG1Y162-2，本研究旨在進(jìn)一步驗(yàn)證和對(duì)比這兩段基因構(gòu)建的重組蛋白的免疫應(yīng)答的反應(yīng)，為表位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及包蟲包囊 6～8周齡雌性SPF級(jí)的BALB/C小鼠，質(zhì)量18～22 g，購自于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。包蟲病患者的細(xì)粒棘球蚴包囊由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽包蟲外科提供。

1.1.2 儀器設(shè)備和相關(guān)試劑 酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，費(fèi)氏完全佐劑(FCA)、費(fèi)氏不完全佐劑(FIA)和刀豆蛋白A(ConA)(美國SIGMA公司)，RPMI-1640(美國GIBCOBRL公司)，F(xiàn)ITC試劑盒(KGA108)(美國BD公司)，pET-EgG1Y162-1和pET-EgG1Y162-2重組蛋白(本室制備并凍存，在-80℃保存?zhèn)溆?。

1.2方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立 將實(shí)驗(yàn)小鼠60只隨機(jī)平均分為5組，EgG1Y162-1組、EgG1Y162-2組、GST對(duì)照組、佐劑組和正常對(duì)照組，這5組小鼠分別注射pET32a-EgG1Y162-1重組蛋白+佐劑、pET32a-EgG1Y162-2重組蛋白+佐劑、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GSTs)+佐劑、PBS+佐劑和生理鹽水。注射小鼠的疫苗初始劑量均為100 μL(其中蛋白含量為50 μg)，與佐劑1∶1混合后進(jìn)行注射，在免疫的第1次用費(fèi)氏完全佐劑(0周)，后3次用費(fèi)氏不完全佐劑(2、4、6周)，生理鹽水組直接注射即可。最后一次免疫后的2周對(duì)小鼠進(jìn)行感染攻擊，腹腔內(nèi)注射活原頭蚴數(shù)量約為2 000只的100 μL原頭蚴液。

1.2.2 收集檢測(cè)標(biāo)本 四次免疫前后均通過小鼠眼內(nèi)眥采血的方式采集血液100～150 μL，將離心后的血清20～25 μL凍存于-20℃冰箱內(nèi)。原頭蚴感染攻擊小鼠后的第20周剖殺小鼠，摘眼球大量取血，并對(duì)小鼠內(nèi)臟和腹腔內(nèi)的囊性病灶進(jìn)行稱重并保存。

1.2.3 檢測(cè)抗體滴度 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)檢測(cè)EgG1Y162-1組和EgG1Y162-2組小鼠抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化水平。用EgG1Y162-1和EgG1Y162-2重組蛋白分別包被96孔板在4℃條件下過夜。第2天用洗板液(PBS-Tween20)洗板3次，用樣本稀釋液將采集到的免疫后小鼠血清按照1∶100～1∶20 480的稀釋梯度進(jìn)行逐一稀釋，每個(gè)標(biāo)本設(shè)兩個(gè)復(fù)孔，同時(shí)再單獨(dú)設(shè)1個(gè)空白對(duì)照孔，1個(gè)陰性對(duì)照孔和1個(gè)陽性兔血清對(duì)照孔。該板在37℃條件下溫育1 h，用洗板液洗板3次。用辣根過氧化物酶(HRP)羊抗小鼠IgG(濃度為1∶3 000)為二抗對(duì)96孔板進(jìn)行37℃條件下孵育1 h，洗板3次。加顯色液10 min后終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(OD490 nm)測(cè)定各孔的吸光度值。

1.2.4 鑒定脾細(xì)胞亞群 無菌條件下取小鼠的脾臟研磨均勻，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整為5×107/L濃度的懸液分裝，EgG1Y162-1組、EgG1Y162-2、GST對(duì)照組、佐劑組和正常對(duì)照組五組各設(shè)置2個(gè)平行管，分別加入1 μL大鼠抗小鼠CD3、CD4單克隆抗體和大鼠抗小鼠CD3、CD8單克隆抗體，4℃避光孵育30 min，洗滌細(xì)胞3次后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T、CD8+T細(xì)胞亞群的百分比。

1.2.5 檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖 無菌條件下制脾細(xì)胞懸液，將已調(diào)整好濃度的懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將EgG1Y162-1組、EgG1Y162-2組、GST對(duì)照組、佐劑組和正常對(duì)照組5組細(xì)胞分別設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，復(fù)孔中分別加入ConA刺激液和無刺激原液，pET32a-EgG1Y162-1和pET32a-EgG1Y162-2。ConA刺激液濃度為5 μg/mL，EgG1Y162-1、EgG1Y162-2的刺激濃度均為10 μg/mL。加樣后將該板置于37℃ 5% CO2的條件下培養(yǎng)72 h，距離培養(yǎng)結(jié)束4 h前，每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)結(jié)束后在1 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清，每孔分別加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)置于低速振蕩的搖床上，室溫條件下?lián)u10 min，待結(jié)晶物充分溶解后用酶標(biāo)儀(OD570 nm)測(cè)定各孔的吸光度。

1.2.6 檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞凋亡率 取制備好濃度的脾細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別設(shè)置為EgG1Y162-1組、EgG1Y162-2組、GST對(duì)照組、佐劑組和空白對(duì)照組，這5組各設(shè)置兩個(gè)復(fù)孔分別加入濃度為10 μg/mL的ConA和無刺激的原液，在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)20～24 h后收集脾細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀分析脾細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 小鼠囊重抑制率的測(cè)定 在對(duì)小鼠感染攻擊的20周后剖殺小鼠，分離5組小鼠腹腔和肝臟內(nèi)的細(xì)粒棘球蚴囊性灶并進(jìn)行稱重，計(jì)算每組相應(yīng)的囊重抑制率。免疫保護(hù)力計(jì)算公式：囊重抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組平均包囊濕重/對(duì)照組平均包囊濕重×100%。

2 結(jié)果

2.1小鼠抗體滴度動(dòng)態(tài)變化的檢測(cè)結(jié)果EgG1Y162-1組和EgG1Y162-2組血清抗體效價(jià)均逐步提高，在初次免疫后的第10周，EgG1Y162-1組的血清抗體效價(jià)值達(dá)到1∶5 120時(shí)開始下降，EgG1Y162-2組血清抗體滴度則達(dá)到1∶20 480開始下降。經(jīng)過酶標(biāo)儀對(duì)OD值的測(cè)定結(jié)果表明，GST對(duì)照組、佐劑組和正常對(duì)照組的OD值在同一滴度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但EgG1Y162-1組與佐劑組、GST對(duì)照組及正常對(duì)照組在1∶100～1∶5 120抗體稀釋倍數(shù)上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，EgG1Y162-2組與佐劑組、GST對(duì)照組及正常對(duì)照組在1∶100～1∶20 480抗體稀釋倍數(shù)上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.2CD4+T細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化檢測(cè)結(jié)果顯示，EgG1Y162-1組、EgG1Y162-2組在免疫后均有CD4+T細(xì)胞不同程度的升高，明顯觀察到EgG1Y162-2組在免疫2周后持續(xù)進(jìn)行性的增高，到第6周達(dá)到最高水平，而EgG1Y162-1組也在免疫后的第2周開始逐漸增高，并于第6周時(shí)達(dá)到最高水平，且CD4+T細(xì)胞亞群比例明顯低于EgG1Y162-2組。在免疫第8周后的原頭蚴攻擊感染之后，CD4+T細(xì)胞亞群隨著時(shí)間的延長(zhǎng)開始逐步降低。GST對(duì)照組、佐劑組也在免疫后2周開始升高，但CD4+T細(xì)胞亞群變化幅度很小，而正常對(duì)照組基本沒有變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，經(jīng)過免疫和包蟲感染攻擊，EgG1Y162-1/2組與GST對(duì)照組、佐劑組與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GST對(duì)照組、佐劑組和正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

2.3CD8+T細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)EgG1Y162-1組、EgG1Y162-2組在免疫后均有CD8+T細(xì)胞的改變，EgG1Y162-2組在蛋白免疫2周后出現(xiàn)持續(xù)進(jìn)行性增高，到第8周時(shí)達(dá)到最高水平，而EgG1Y162-1組也在免疫后的第2周開始逐漸增高，并于第6周時(shí)達(dá)到最高水平，與CD4+T細(xì)胞變化規(guī)律相似：EgG1Y162-2組的CD8+T細(xì)胞亞群數(shù)量也明顯增高。在免疫第8周后的原頭蚴攻擊感染后，CD8+T細(xì)胞亞群隨著時(shí)間的增長(zhǎng)開始逐步降低。GST對(duì)照組、佐劑組也在免疫后2周開始升高，但CD8+T細(xì)胞亞群比例波動(dòng)較小，正常對(duì)照組基本數(shù)值沒變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，經(jīng)過蛋白免疫和原頭蚴的感染攻擊，EgG1Y162-1/2組與GST對(duì)照組、佐劑組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GST對(duì)照組、佐劑組和生理鹽水對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

2.4脾細(xì)胞CD4+T/CD8+T細(xì)胞亞群比值的動(dòng)態(tài)變化EgG1Y162-1組的CD4+T/CD8+T細(xì)胞比值在免疫后2周時(shí)開始升高，第10周達(dá)到峰值后降低。EgG1Y162-2組的CD4+T/CD8+T細(xì)胞比值也在免疫后2周時(shí)開始升高，第10周達(dá)到峰值后降低，但比值明顯高于EgG1Y162-1組。CD4+T/CD8+T細(xì)胞亞群比值在2周時(shí)逐步升高，第4周達(dá)到峰值。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，EgG1Y162-1/2組與GST對(duì)照組、佐劑組和正常對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

2.5MTT法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況刀豆蛋白ConA刺激5組小鼠脾淋巴細(xì)胞后，與無刺激物刺激相比發(fā)生了顯著增殖，前期分為5組的小鼠脾淋巴細(xì)胞均在刀豆蛋白ConA的刺激下產(chǎn)生增殖能力。用EgG1Y162-1和EgG1Y162-2重組蛋白抗原刺激各組小鼠脾淋巴細(xì)胞后，EgG1Y162-1組和EgG1Y162-2組與GST對(duì)照組、佐劑組和正常對(duì)照組的差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而GST組、佐劑組和正常對(duì)照組之間的差異性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示EgG1Y162-1和EgG1Y162-2免疫的小鼠脾淋巴細(xì)胞在體外能被該抗原特異性刺激增生，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的產(chǎn)生(表1)。

2.6小鼠脾細(xì)胞凋亡率結(jié)果EgG1Y162-1組和EgG1Y162-2組小鼠脾細(xì)胞原液組和ConA刺激組脾細(xì)胞凋亡率均明顯低于GST對(duì)照組、佐劑組和正常對(duì)照組，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，GST組和佐劑組的脾細(xì)胞凋亡率也低于正常對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且每組中ConA刺激組脾細(xì)胞凋亡率都對(duì)應(yīng)高于同組脾細(xì)胞原液凋亡率(P<0.01)(表2)。

表1 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果(OD490 nm, ±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

表2 EgG1Y162-1/2重組蛋白免疫小鼠后脾細(xì)胞凋亡率(%, ±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.7疫苗對(duì)小鼠的免疫保護(hù)作用經(jīng)過對(duì)剖殺5組小鼠后體內(nèi)的細(xì)粒棘球蚴包囊進(jìn)行稱重后，計(jì)算的囊重抑制率顯示EgG1Y162-1組與EgG1Y162-2組小鼠囊重抑制率分別為58.10%和64.10%，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GST組與佐劑組小鼠囊重抑制率為7.54%和8.16%，和正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 免疫小鼠的原頭蚴攻擊實(shí)驗(yàn)減囊率比較

注： 與對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討論

新疆是地處偏遠(yuǎn)的畜牧業(yè)大省，包蟲病高發(fā)對(duì)地區(qū)經(jīng)濟(jì)和牧民的生活都造成了重大的影響[9]。本課題組[10]在前期克隆和擴(kuò)增EgG1Y162基因時(shí)，就對(duì)EgG1Y162重組蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該抗原上分布有優(yōu)勢(shì)的線性T細(xì)胞表位和構(gòu)象性表位B細(xì)胞表位[11-12]。理論上認(rèn)為含表位豐富的抗原具有較強(qiáng)的免疫原性，本研究旨在驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的優(yōu)勢(shì)表位區(qū)域所在的抗原是否在免疫應(yīng)答中也具有更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。

根據(jù)Zhang等[8]的研究，EgG1Y162重組蛋白具有優(yōu)勢(shì)的T-B聯(lián)合表位位于6～19、64～82，106～119三段氨基酸位點(diǎn)區(qū)域，根據(jù)該預(yù)測(cè)結(jié)果將EgG1Y162基因截短為2段，分別命名EgG1Y162-1和EgG1Y162-2，其中EgG1Y162-1具有1個(gè)T-B聯(lián)合優(yōu)勢(shì)表位，即6～19氨基酸片段。而EgG1Y162-2上有2個(gè)T-B聯(lián)合優(yōu)勢(shì)表位64～82、106～119。表位是位于抗原上的柔性氨基酸片段，正是這些片段的存在，能夠高效的和抗體結(jié)合，激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)。本研究在免疫小鼠的過程中發(fā)現(xiàn)EgG1Y162-2誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生更高的抗體效價(jià)，說明機(jī)體在抗原的刺激下產(chǎn)生了更強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。本研究在用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠CD4+T和CD8+T細(xì)胞亞群的百分比中發(fā)現(xiàn)，EgG1Y162-2的T輔助細(xì)胞/T抑制細(xì)胞的比值明顯高于EgG1Y162-1，說明T輔助細(xì)胞的活性在該抗原的刺激下增強(qiáng)了，進(jìn)一步的MTT實(shí)驗(yàn)的原理是通過脾淋巴細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱反映機(jī)體免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱[13]。為了解這兩段重組蛋白疫苗對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的作用[14-15]，本研究開展了該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果顯示EgG1Y162-1/2抗原都能特異刺激脾淋巴細(xì)胞增殖，說明這兩段重組蛋白抗原均能直接被免疫細(xì)胞識(shí)別并引起免疫應(yīng)答，但通過統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)EgG1Y162-2比EgG1Y162-1具有更強(qiáng)的刺激脾淋巴細(xì)胞增殖的能力。脾細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn)中EgG1Y162-2減少了脾細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，這一系列的實(shí)驗(yàn)均證明EgG1Y162-2這個(gè)包含了2個(gè)預(yù)測(cè)后的T-B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位的重組蛋白激發(fā)小鼠產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，在激活機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的過程中，EgG1Y162-2具有更優(yōu)勢(shì)的免疫作用。本實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步驗(yàn)證抗原的免疫保護(hù)作用，將免疫后的小鼠進(jìn)行Eg的感染，在最終的囊重抑制率計(jì)算中發(fā)現(xiàn)2組有差別，EgG1Y162-2的囊重抑制率要高于EgG1Y162-1，這個(gè)結(jié)果與本研究最初的預(yù)測(cè)結(jié)果相符。說明該抗原進(jìn)入小鼠體內(nèi)后高效地與抗體結(jié)合，誘導(dǎo)了較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，在后期遇到大量的包蟲感染后，能夠及時(shí)的產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，對(duì)Eg包囊的寄生和進(jìn)行性發(fā)展起到了抑制作用。

生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)是近年來的熱門方向[16-17]，研究者們一直采用各種分析方法來證明結(jié)果的可靠性,本實(shí)驗(yàn)基于前期生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)的驗(yàn)證[18-20]，結(jié)果表明符合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果。在今后的科研工作中，合理地運(yùn)用生物信息學(xué)的分析不僅能節(jié)約大量的實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，還能更加便捷準(zhǔn)確地篩選出所需的多肽，讓研究者們把更多的時(shí)間和精力用在后期對(duì)表位肽深入的醫(yī)學(xué)研究中，進(jìn)一步明確免疫應(yīng)答特異性和免疫保護(hù)作用。本研究結(jié)合了生物信息學(xué)的分析，不僅縮短了尋找高效保護(hù)性的疫苗抗原的時(shí)間，還提高了確定候選分子的準(zhǔn)確度，為進(jìn)一步優(yōu)質(zhì)疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。