石 浩，丁仁惠，黃 謙，王文龍，李紅波，何小娥

(1.湖南應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，湖南 常德 415100; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，長沙 410128;3.岳陽市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，湖南 岳陽 414000)

油茶籽油是從山茶科(Camellia)油茶(CamelliaoleiferaAbel)樹種子中獲得的，是我國最古老的木本食用植物油之一[1-2]。油茶籽油中含有很多功效物質(zhì)，如山茶皂苷、山茶苷、茶多酚、角鯊烯、VE、不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸、亞麻酸)等[3-4]；長期食用或使用油茶籽油相關(guān)產(chǎn)品能起到改善血液循環(huán)、降血脂，抗氧化及免疫調(diào)節(jié)功能，預(yù)防肥胖，保肝護(hù)肝，抗紫外線，抗菌等作用[5]。

自由基是一種高能物質(zhì)，具有很強(qiáng)的氧化性，能破壞細(xì)胞，對蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等產(chǎn)生一系列不可逆的傷害作用，影響細(xì)胞正常代謝，加速機(jī)體衰老[6]。隨著人民生活水平的提高，現(xiàn)代飲食方式和結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化，長時(shí)間、大劑量的食用高脂肪、高熱量、高蛋白的食物，將會促使人體內(nèi)氧自由基快速增加[7]；同時(shí)隨著工作壓力的增大、生活環(huán)境條件的日益惡化，都將會導(dǎo)致人體免疫力下降，清除體內(nèi)自由基的能力下降[8]。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，油茶籽油在抗氧化、抗衰老等功效方面亦有部分研究，但是研究不夠深入，抗氧化指標(biāo)多為體外活性測定，并不能完全反應(yīng)生物學(xué)信息。本文以我省富硒油茶籽油為材料，HaCaT細(xì)胞(人永生化表皮細(xì)胞)為試驗(yàn)對象，進(jìn)行多指標(biāo)深入分析油茶籽油對人體細(xì)胞抗氧化能力的效果，探索其抗氧化作用機(jī)理，為今后油茶籽油類抗氧化食品、保健品、化妝品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

油茶籽油，學(xué)校油茶基地油茶果經(jīng)純物理壓榨所得(油茶籽油中硒含量為57 μg/kg)。HaCaT細(xì)胞(中科院細(xì)胞所)、H2O2(雙氧水)、1640高糖培養(yǎng)基、胰酶消化液(Gibco)、BCA Protein Assay Kit(康為世紀(jì)生物科技有限公司)、Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物)、胎牛血清(FBS)、DMSO(二甲基亞砜)、胰酶消化液(Gibco)、MTT(美國Sigma)、BCA Protein Assay Kit(康為世紀(jì)生物科技)；GSH-PX/SOD檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)、S0033活性氧檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

PW-812全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)，MB-530多功能酶標(biāo)分析儀，L530自動(dòng)平衡離心機(jī)，DH-160I直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱，DHP-500恒溫培養(yǎng)箱，DSZ2000X倒置生物顯微鏡， FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀(美國BD公司)，冷凍干燥儀(Thermo Savznt)，H1650R高速冷凍速離心機(jī)，搖床，精密電子天平。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理

HaCaT 細(xì)胞的培養(yǎng)：將存有HaCaT細(xì)胞的凍存管取出，置于37℃水浴融化后，離心去上清，置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)基，細(xì)胞密度達(dá)80%左右，消化傳代，用于以下試驗(yàn)。

細(xì)胞分組處理：將細(xì)胞分空白對照組、100 μmol/L H2O2模型損傷組、50 μg/mL VC陽性對照組、試驗(yàn)組(不同質(zhì)量濃度油茶籽油處理組)。

1.2.2 油茶籽油對細(xì)胞的預(yù)保護(hù)作用

1.2.2.1 油茶籽油劑量的篩選

細(xì)胞活性檢測(MTT法)[9]。取對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，接種于96孔板，每孔200 μL。細(xì)胞貼壁后以無血清培養(yǎng)基靜置24 h，換含藥培養(yǎng)基(油茶籽油質(zhì)量濃度分別為5、10、30、50、100、200、300、400、500 μg/mL)，各組均設(shè)4復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，用完全培養(yǎng)基替換，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入二甲基亞砜150 μL/孔，輕搖，于酶標(biāo)儀490 nm處檢測吸光度A。按下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.2.2 油茶籽油對HaCaT細(xì)胞氧化損傷的預(yù)保護(hù)作用

細(xì)胞處理、分組見1.2.1。在1.2.2.1試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，篩選出合適質(zhì)量濃度的油茶籽油先對HaCaT細(xì)胞進(jìn)行預(yù)保護(hù)24 h，吸出保護(hù)液后再加入100 μmol/L H2O2誘導(dǎo)損傷24 h，考察油茶籽油對H2O2損傷的HaCaT細(xì)胞活性的影響。計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 ROS的熒光強(qiáng)度測定

采用二氯熒光素(DCFH-DA)標(biāo)記法[10]。DCFH-DA是一種熒光探針，能夠與ROS特異性結(jié)合。按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm處測定ROS的平均熒光強(qiáng)度。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測

按照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作。用不含EDTA的胰酶消化液收集、用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次2 000 r/min離心5 min，收集約1×105～5×105細(xì)胞，加入500 μL的Binding buffer(鏈接緩沖液)懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后，加入5 μL Propidium Iodide(碘化丙啶)，混勻，室溫、避光反應(yīng)5～15 min，1 h內(nèi)，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。按下式計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 SOD、GSH-PX酶活性測定

BCA法測定蛋白質(zhì)濃度： 蛋白質(zhì)的肽鏈在堿性條件下能與Cu2+結(jié)合形成絡(luò)合物，并將Cu2+還原成Cu+，BCA試劑可特異性地與Cu+結(jié)合，生成穩(wěn)定且有色的復(fù)合物。按照BCA蛋白質(zhì)濃度試劑盒操作制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)濃度。

GSH-PX活性測定：試驗(yàn)按照GSH-PX測試盒操作，用酶標(biāo)儀在412 nm處測定，并計(jì)算GSH-PX的活性。

1.2.6 細(xì)胞Nrf2基因表達(dá)的影響

(1)引物序列

Human actin-F：5′- ACCCTGAAGTACCCCATCGAG-3′；Human actin-R：5′-AGCACAGCCTGGATAGCAAC-3′；product length：224 bp。Human Nrf2-F：5′-TCAGCGACGGAAAGAGTATGA-3′；Human Nrf2-R：5′-CCACTGGTTTCTGACTGGATGT-3′；product length：174 bp。

(2)體系組成

實(shí)時(shí)定量PCR分析。每個(gè)樣本每個(gè)指標(biāo)3個(gè)孔，共30 μL。反應(yīng)體系為Template(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)1 μL、10 mmol/L Primer A/B(引物)各0.5 μL、PCR H2O 13 μL、2X SYBGREEN PCR Master Mix(實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混液)15 μL。

(3)定量PCR擴(kuò)增程序

95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析60～95℃。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用“x±s”表示。P<0.05為差異有顯著性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶籽油對HaCaT細(xì)胞存活率的影響

油茶籽油對HaCaT細(xì)胞存活率的影響如圖1所示。

注：圖中不同大寫字母表示差異顯著，P<0.05。

由圖1可知，不同質(zhì)量濃度的油茶籽油對細(xì)胞存活率有較大的影響。當(dāng)油茶籽油質(zhì)量濃度超過300 μg/mL時(shí)，對細(xì)胞存活率影響較大，400 μg/mL處理時(shí)細(xì)胞存活率僅為42.13%，相對于300 μg/mL處理組呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。油茶籽油質(zhì)量濃度在5～300 μg/mL時(shí)對細(xì)胞存活率的影響較小，細(xì)胞存活率在90%～120%之間，可選擇上述質(zhì)量濃度進(jìn)行細(xì)胞保護(hù)處理。當(dāng)油茶籽油質(zhì)量濃度超過300 μg/mL后細(xì)胞存活率出現(xiàn)顯著降低情況，可能是高濃度油茶籽油不利于細(xì)胞生長、代謝[11]。

2.2 油茶籽油對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HaCaT細(xì)胞活性的影響

細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度油茶籽油及50 μg/mL VC提前預(yù)保護(hù)后，再采用100 μmol/L H2O2誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞，細(xì)胞存活率如表1所示。

表1 油茶籽油對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HaCaT細(xì)胞存活率的影響

注：表中不同大寫字母代表與模型組相比有顯著性差異，P<0.05。

由表1可知，H2O2模型損傷組細(xì)胞存活率較低，僅為43.38%，VC處理組細(xì)胞存活率提高了52.28%，說明VC對HaCaT細(xì)胞具有較強(qiáng)的預(yù)保護(hù)作用。當(dāng)油茶籽油質(zhì)量濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率達(dá)到了70.04%，其效果已超越VC處理組，質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，細(xì)胞預(yù)保護(hù)效果最佳，此時(shí)細(xì)胞存活率達(dá)到了81.94%，這可能是因?yàn)橛筒枳延椭卸嗖伙栔舅岷械妮^多不飽和雙鍵可有效清除H2O2產(chǎn)生的自由基，另有可能是因?yàn)橛筒枳延透灿诩?xì)胞膜表面，降低膜極性，阻礙自由基損傷[12]。但在300 μg/mL質(zhì)量濃度處理時(shí)，細(xì)胞存活率有略微的下降(P>0.05)，這可能是因?yàn)檫^高的油茶籽油質(zhì)量濃度將會導(dǎo)致細(xì)胞毒害所致。油茶籽油具有較強(qiáng)預(yù)保護(hù)HaCaT細(xì)胞的作用，且作用效果強(qiáng)于VC陽性對照組。

2.3 油茶籽油對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

不同質(zhì)量濃度油茶籽油及VC預(yù)處理對H2O2損傷的HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響如表2所示。

表2 油茶籽油對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

注：表中小寫字母代表與空白對照組相比，P<0.05；大寫字母代表與模型組相比，P<0.05，下同。

由表2可知，空白對照組ROS水平較低，平均熒光強(qiáng)度僅為37.98，H2O2模型損傷組ROS水平非常高，平均熒光強(qiáng)度達(dá)到了88.27，說明H2O2具有較強(qiáng)損傷HaCaT細(xì)胞的能力。但經(jīng)過油茶籽油及VC預(yù)處理后，細(xì)胞損傷的效果有所減緩，對于模型損傷組均表現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。50 μg/mL VC處理組ROS水平相對于模型損傷組降低了32.65%，50、200 μg/mL油茶籽油處理組ROS水平相對于模型損傷組分別降低了37.66%、45.24%。這可能是因?yàn)橛筒枳延涂捎行ьA(yù)防細(xì)胞來自H2O2的損傷，一方面油茶籽油清除細(xì)胞外自由基的能力較強(qiáng)，另一方面細(xì)胞自身所產(chǎn)生的自由基少，這與Chang等[13]的研究結(jié)果基本一致。說明油茶籽油及VC對HaCaT細(xì)胞具有較強(qiáng)預(yù)保護(hù)作用，可較大程度降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，且油茶籽油處理效果較VC處理更佳。

2.4 油茶籽油對H2O2 誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響

不同質(zhì)量濃度油茶籽油及VC預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響如表3所示。

表3 油茶籽油對H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響 %

注：UR為細(xì)胞晚期凋亡率，LR為細(xì)胞早期凋亡率，UR+LR為細(xì)胞總凋亡率。

由表3可知，空白對照組細(xì)胞總凋亡率非常低，僅為2.97%，而H2O2模型損傷組細(xì)胞總凋亡率則較高，達(dá)到了8.13%。細(xì)胞經(jīng)50 μg/mL VC預(yù)處理后總凋亡率為5.12%，相對于H2O2模型損傷組降低了37.02%，可能是因?yàn)閂C是一種較強(qiáng)的還原劑，可有效清除H2O2所產(chǎn)生的自由基[13]，從而對HaCaT細(xì)胞具有較強(qiáng)的預(yù)保護(hù)作用。油茶籽油對HaCaT細(xì)胞同樣具有較強(qiáng)的預(yù)保護(hù)作用，且作用效果好于相同質(zhì)量濃度的VC，在油茶籽油質(zhì)量濃度50、200 μg/mL時(shí)，細(xì)胞總凋亡率相對于模型損傷組分別降低了44.77%、53.38%。

2.5 油茶籽油對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷HaCaT細(xì)胞的SOD及GSH-PX活性的影響

不同質(zhì)量濃度油茶籽油及VC預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷HaCaT細(xì)胞的SOD及GSH-PX活性的影響如表4所示。

表4 油茶籽油對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷HaCaT細(xì)胞的SOD及GSH-PX活性的影響 U/mg

由表4可知，空白對照組SOD酶、GSH-PX酶活性均較高，分別達(dá)到了26.82、71.66 U/mg，此時(shí)細(xì)胞具有較強(qiáng)的生命力，可較大程度地清除氧自由基和過氧化氫自由基。細(xì)胞進(jìn)行H2O2誘導(dǎo)氧化損傷后SOD酶、GSH-PX酶活性顯著下降，分別僅為15.06、39.41 U/mg，細(xì)胞采用VC、油茶籽油進(jìn)行預(yù)保護(hù)后，SOD酶、GSH-PX酶活性降低有所延緩，50 μg/mL VC陽性對照組分別達(dá)20.90、57.65 U/mg，相對于相同質(zhì)量濃度VC組，50 μg/mL油茶籽油處理組效果略佳，分別達(dá)22.09 U/mg、64.50 U/mg。細(xì)胞體中氧自由基清除酶活性的增加，可能是油茶籽油可有效增強(qiáng)某些抗氧化基因的表達(dá)所致[14]，從而加強(qiáng)了相應(yīng)抗氧化酶的數(shù)量和活性。50 μg/mL和200 μg/mL油茶籽油處理組對SOD酶、GSH-PX酶活性影響差別不大，不具有顯著性差異。

2.6 油茶籽油對H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡基因Nrf2表達(dá)量的影響

抗氧化基因Nrf2表達(dá)量的多少直接決定了細(xì)胞抗氧化能力的大小，是有效反映細(xì)胞活性大小的指標(biāo)之一。不同質(zhì)量濃度油茶籽油及VC預(yù)處理對H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡基因Nrf2表達(dá)量的影響如表5所示。

由表5可知，細(xì)胞經(jīng)過H2O2誘導(dǎo)氧化損傷后Nrf2相對基因的表達(dá)量明顯降低，僅為0.56，50 μg/mL VC陽性對照組和5 μg/mL油茶籽油處理組基因表達(dá)量相差不大(P>0.05)，相對于H2O2模型損傷組分別提高了39.29%和35.71%；50 μg/mL油茶籽油處理組效果最好，基因相對表達(dá)量達(dá)到了1.13，且高于相同質(zhì)量濃度VC陽性對照組處理效果(0.78)，試驗(yàn)結(jié)果剛好應(yīng)對了上文細(xì)胞體內(nèi)SOD酶和GSH-PX酶活性增強(qiáng)和細(xì)胞體內(nèi)ROS自由基含量減少的試驗(yàn)結(jié)果。細(xì)胞體內(nèi)抗氧化基因表達(dá)量的提高可能是因?yàn)榧?xì)胞經(jīng)油茶籽油預(yù)處理后，受H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的程度小，自身活力較強(qiáng)，基因表達(dá)不受影響；另有可能是因?yàn)橛筒枳延涂芍苯哟龠M(jìn)、激發(fā)抗氧化基因的表達(dá)[15-16]。

表5 油茶籽油對H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響

3 結(jié) 論

本文以HaCaT細(xì)胞為研究載體，以VC作為陽性對照，全面分析了油茶籽油對H2O2誘導(dǎo)氧化HaCaT細(xì)胞損傷保護(hù)作用的大小。油茶籽油質(zhì)量濃度在5～300 μg/mL時(shí)對細(xì)胞存活率的影響較小，細(xì)胞存活率在90%～120%之間，故選取此質(zhì)量濃度作為預(yù)保護(hù)試驗(yàn)。油茶籽油質(zhì)量濃度在50～200 μg/mL時(shí)，對細(xì)胞預(yù)保護(hù)的作用最強(qiáng)，可明顯提高細(xì)胞存活率，可有效減緩H2O2給細(xì)胞帶來的損傷與凋亡。50、200 μg/mL油茶籽油處理組，活性氧簇自由基(ROS)的含量相對于H2O2模型損傷組有明顯的降低，分別降低了37.66%、45.24%；細(xì)胞體內(nèi)SOD酶和GSH-PX酶的活性相對H2O2模型損傷組具有較大的提高(50、200 μg/mL油茶籽油處理組間效果P>0.05)，分別提高了50%、63%左右?；騈rf2相對表達(dá)量在50 μg/mL油茶籽油處理時(shí)效果最好，達(dá)到了1.13。同時(shí)各指標(biāo)效果均強(qiáng)于相同質(zhì)量濃度的50 μg/mL VC陽性對照處理組，從而進(jìn)一步說明了油茶籽油具有較好的細(xì)胞保護(hù)作用。目前本文對油茶籽油預(yù)保護(hù)的試驗(yàn)還處在細(xì)胞試驗(yàn)階段，后期研究可對動(dòng)物代謝試驗(yàn)作進(jìn)一步的研究。