王鐵良,魏亮亮,劉冰杰,郭 潔,賀 平，周曉華,魏 紅,汪 紅

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，鄭州 450002； 2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(鄭州)，鄭州 450002； 3.河南省糧食質(zhì)量安全與檢測重點(diǎn)實驗室，鄭州 450002)

蛋白質(zhì)是大豆重要的組成成分之一，大豆蛋白所含的必需氨基酸較為豐富，是植物性的完全蛋白，因其基因結(jié)構(gòu)最接近人體氨基酸，所以是最具營養(yǎng)價值的植物蛋白，同時也是大豆重要的營養(yǎng)評價指標(biāo)之一。水溶性蛋白是大豆蛋白的重要組成部分，約占大豆總蛋白含量的70%，主要由7S組分和11S組分組成[1]。大豆水溶性蛋白極易被人體吸收，具有良好的功能性質(zhì)如凝膠性、乳化性、發(fā)泡性等，在大豆的加工利用中有著重要作用[2]。大豆水溶性蛋白含量(SPC)是評價大豆品質(zhì)及衡量其價值的重要指標(biāo)[3-5]，同時也是大豆是否適宜儲存的重要判定指標(biāo)[6-8]。因此，開展大豆水溶性蛋白的快速、準(zhǔn)確分析方法研究具有重要的現(xiàn)實意義。

目前，大豆水溶性蛋白的測定方法主要有凱氏定氮法[9-11]、考馬斯亮藍(lán)法[12-13]及偶氮胭脂紅G比色法[14-15]。凱氏定氮法是大豆水溶性蛋白檢測現(xiàn)行有效的唯一標(biāo)準(zhǔn)方法[10-11]，也是目前研究機(jī)構(gòu)和檢驗檢測機(jī)構(gòu)測定大豆水溶性蛋白的主要分析方法。然而，該方法試驗過程煩瑣，對操作人員要求較高，且試樣消解過程會產(chǎn)生酸氣、強(qiáng)堿溶液等對人體和環(huán)境有毒有害的“三廢”物質(zhì)，不太適合大批量試樣的分析檢驗?？捡R斯亮藍(lán)法和偶氮胭脂紅G比色法試驗消耗小、成本低，且靈敏度較高，適用于蛋白質(zhì)含量較低的樣品。然而，大豆水溶性蛋白含量較高，考馬斯亮藍(lán)法和偶氮胭脂紅G比色法線性范圍較窄，減小稱樣量或增加稀釋倍數(shù)均會引入更大的不確定度，影響分析結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，不適合大批次大豆試樣的水溶性蛋白分析工作。

本研究建立了一種杜馬斯燃燒定氮法測定大豆水溶性蛋白的分析方法，通過優(yōu)化大豆水溶性蛋白的提取方法和杜馬斯燃燒定氮儀的儀器試驗條件，快速、準(zhǔn)確、無污染測定大豆中水溶性蛋白含量，以期為大豆水溶性蛋白的分析檢驗提供一種新的可行方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

大豆-1、大豆-2、大豆-3、大豆-4、大豆-5(均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物科學(xué)研究所提供)。

實驗用超純水(電阻率>18.2 MΩ·cm)，鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW081127,c=0.100 0 mol/L)，氫氧化鈉(優(yōu)級純)，混合催化劑(瑞典FOSS)，濃硫酸(優(yōu)級純)，甲基紅指示劑(分析純)，溴甲酚綠指示劑(分析純)，氮?dú)狻⒀鯕?、氦?≥99.999%，北京普萊克斯)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DT-Dumatherm杜馬斯燃燒定氮儀(德國Gerhard);2300全自動凱氏定氮儀(丹麥FOSS)；2040消化爐(丹麥FOSS)；Mettler-Toledo萬分之一電子天平;EH20B電熱板；JK-APG-50高速粉碎機(jī);Cyclotec 1093旋風(fēng)式樣品磨(丹麥FOSS);HY-5數(shù)顯調(diào)速多用振蕩器;TG16-WS臺式高速離心機(jī)；Milli-Q Syhthesis超純水系統(tǒng)(美國密理博)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試樣制備

大豆試樣按四分法縮分，用高速粉碎機(jī)粉碎后過Φ0.25 mm網(wǎng)篩；或者直接使用安裝了Φ0.25 mm網(wǎng)篩的旋風(fēng)式樣品磨粉碎大豆試樣。

1.2.2 杜馬斯燃燒定氮法測定大豆水溶性蛋白含量

稱取大豆試樣(1±0.1)g于50 mL離心管，加入30 mL(20±2)℃去離子水，振搖使試樣不結(jié)塊，均勻分散，然后控制溫度在(20±2)℃恒溫振蕩40 min，3 500 r/min離心10 min，將上層水溶性蛋白提取溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中；再加入30 mL去離子水，重復(fù)上述恒溫振蕩、離心試驗操作1次，將提取液全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶后定容、混勻。用快速濾紙過濾至100 mL燒杯中，棄去最初的5～10 mL的濾液。準(zhǔn)確吸取濾液3～4 mL于錫箔杯中，置于150℃的電熱板上加熱蒸發(fā)、干燥，近干時加入硅藻土少許，吸附剩余水分，擠出錫箔杯中空氣后放入杜馬斯燃燒定氮儀樣品盤中分析測定。

杜馬斯儀器試驗條件：氧化燃燒溫度980℃，還原溫度600℃，氧氣流速300 mL/min,氧氣因子1.4 mL/mg。

1.2.3 凱氏定氮法測定大豆水溶性蛋白含量

依據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1205—2006分析測定大豆試樣水溶性蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 凱氏定氮法分析結(jié)果

試樣“大豆-1”水溶性蛋白含量測定結(jié)果為31.95%(n=5)，試驗精密度(RSD)為0.9%。

2.2 杜馬斯燃燒定氮法試驗條件選擇

2.2.1 不同固液比對水溶性蛋白提取率的影響

稱取大豆試樣1 g至50 mL離心管中，按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50固液比，恒溫振蕩提取2次，每次提取40 min，離心后的上層水溶性蛋白提取溶液全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容、混勻。同時處理5個平行試樣，用杜馬斯燃燒定氮儀按1.2.2條件進(jìn)行分析測定,結(jié)果見表1。

表1 不同固液比時大豆水溶性蛋白試驗結(jié)果

由表1可以看出，不同的固液比對測定結(jié)果有明顯影響。在提取過程中，大豆試樣質(zhì)量和水的比例在1∶10和1∶20時，試驗精密度(RSD)差且大豆水溶性蛋白提取不充分；固液比在1∶30、1∶40和1∶50時，試驗精密度(RSD)較好且大豆水溶性蛋白提取率在100%左右。

本研究在固液比1∶30、1∶40和1∶50時，準(zhǔn)確度和精密度均較好的情況下，考慮到使用50 mL提取容器的操作便捷性，同時考慮到固液比在1∶30條件下提取溶液蛋白含量最低，引入測量不確定度最小，所以固液比采用1∶30。

2.2.2 不同提取次數(shù)和提取時間對大豆水溶性蛋白提取率的影響

稱取大豆試樣1 g，按照1∶30的固液比，采用1、2、3、4次不同的提取次數(shù)和20、40、60 min不同的提取時間處理試樣，離心后的上層水溶性蛋白提取溶液全部轉(zhuǎn)移至100 mL或200 mL容量瓶，定容，混勻，用杜馬斯燃燒定氮儀分析測定，所有設(shè)計方案均處理5個平行。試驗結(jié)果見表2。

表2 不同提取次數(shù)和提取時間時大豆水溶性蛋白試驗結(jié)果

由表2可以看出,隨著提取次數(shù)的增加和提取時間的延長大豆水溶性蛋白的提取率也隨之增加。提取次數(shù)為1次時，提取時間20、40、60 min時的提取率分別為75.5%、86.8%、90.4%，提取率雖然逐漸提高，但60 min時仍未將目標(biāo)成分提取完全；提取次數(shù)為2次時，提取時間20 min時的提取率達(dá)到92.7%，40 min時提取率已達(dá)到100.6%，即目標(biāo)成分提取完全，60 min時提取率與40 min一致。提取時間為20 min時，提取至少3次才能達(dá)到完全提取的效果；而提取時間為40 min或60 min時，提取2次即可實現(xiàn)目標(biāo)成分完全提取。

綜合考慮工作效率、試驗準(zhǔn)確度和精密度，本研究選擇試驗條件為：提取次數(shù)2次，提取時間40 min。

2.2.3 提取液吸取量和干燥溫度的選擇

杜馬斯燃燒法在分析過程中需要盡量去除水蒸氣，否則會影響熱傳導(dǎo)檢測器(TCD)的定量結(jié)果，所以對于試驗試樣要盡可能預(yù)干燥，使試樣處于近干狀態(tài)，更有利于分析檢測。對于本研究，要解決大豆水溶性蛋白提取溶液如何實現(xiàn)蒸發(fā)、干燥達(dá)到適宜于杜馬斯燃燒儀器分析的狀態(tài)問題。

在大豆試樣1 g、固液比1∶30、提取次數(shù)2次、提取時間40 min的試驗條件下，分別吸取大豆水溶性蛋白提取溶液2、3、4 mL，與干燥溫度120、150、180℃ 3個試驗條件做交叉試驗，將提取溶液預(yù)干燥至近干狀態(tài)，所需時間見表3。

表3 不同提取液吸取量和不同干燥溫度條件下所需時間

由表3可以看出，當(dāng)提取液吸取量2 mL、干燥溫度180℃時所需時間為20 min，耗時最短。但是考慮到稱樣質(zhì)量、定容體積和大豆水溶性蛋白的含量范圍等因素，對于水溶性蛋白含量較低的大豆試樣，當(dāng)提取溶液吸取量為2 mL時會因氮元素分析質(zhì)量較小的緣故而影響試驗結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，同時也會引入較大的不確定度。當(dāng)干燥溫度設(shè)定為180℃時，對于乳濁態(tài)提取溶液會存在爆沸現(xiàn)象，會有少量溶液濺出錫箔杯，使分析結(jié)果偏低。當(dāng)干燥溫度設(shè)定為120℃時，干燥時間過長，影響工作效率。綜合考慮，本研究選擇試驗條件為：提取液吸取量3～4 mL，干燥溫度150℃。

2.2.4 杜馬斯燃燒定氮儀儀器條件的選擇

杜馬斯燃燒定氮儀儀器分析時需要根據(jù)不同的試樣類型設(shè)置不同的氧氣流速和氧氣因子兩個參數(shù)條件。以選定的大豆水溶性蛋白提取試驗條件，設(shè)定氧氣流速為200、300 mL/min和400 mL/min，與氧氣因子1.0、1.2、1.4 mL/mg和1.6 mL/mg 4個設(shè)定條件做交叉試驗，分析試樣大豆-1水溶性蛋白的試驗結(jié)果見表4。

表4 不同氧氣流速和氧氣因子下大豆水溶性蛋白分析結(jié)果(n=5)

由表4可見，氧氣流速和氧氣因子較低時，會導(dǎo)致大豆水溶性蛋白分析結(jié)果偏高，且試驗精密度(RSD)較差。這可能是因為在氧氣流速和氧氣因子較低條件下，氧氣供應(yīng)不足，燃燒不充分，加上本試驗樣品與一般干基試樣比較含水量較高，燃燒過程會有部分一氧化碳?xì)怏w生成，而杜馬斯燃燒定氮儀沒有除去一氧化碳?xì)怏w的設(shè)計，一氧化碳?xì)怏w會和氮氧化物(NOX)的還原物氮?dú)庖黄疬M(jìn)入熱傳導(dǎo)檢測器(TCD)。一氧化碳和氮?dú)庠?℃時的熱導(dǎo)率系數(shù)分別為22.71×105g·J/(cm·℃·s)、23.78×105g·J/(cm·℃·s)[16]，非常接近，其與高純氦氣(He)熱導(dǎo)率系數(shù)(140.64×105g·J/(cm·℃·s),0℃)[17]的差值也較接近，被檢測器定量為氮?dú)庥嬎悖罱K導(dǎo)致大豆水溶性蛋白分析結(jié)果虛高。在氧氣流速過高(400 mL/min)及氧氣因子偏低(1.0 mL/mg)時，也會造成分析結(jié)果偏高，這可能是因為氧氣流速較快時燃燒時間短引起的不充分燃燒所致。如果氧氣流速和氧氣因子設(shè)置過高時，超過燃燒化學(xué)計量數(shù)的氧氣(O2)會消耗還原銅粉，造成儀器部件耗材的非正常消耗。交叉試驗結(jié)果顯示，儀器試驗條件設(shè)定氧氣流速為300 mL/min、氧氣因子為1.2～1.6 mL/mg或氧氣流速為400 mL/min、氧氣因子為1.2～1.4 mL/mg時，試驗結(jié)果精密度(RSD)較高、與凱氏定氮法一致性較好。

綜合考慮，本研究選擇試驗條件為：氧氣流速300 mL/min，氧氣因子1.4 mL/mg。

2.3 本研究建立方法與凱氏定氮法的分析結(jié)果比較

以本研究建立的杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法分別測定5個大豆試樣的水溶性蛋白含量，每個試樣處理5個平行，試驗結(jié)果見表5。

由表5可見，本研究建立的分析方法與凱氏定氮法的試驗精密度(RSD)符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》(GB/T 27404—2008)中“檢測方法確認(rèn)過程中實驗室變異系數(shù)(CV)”的技術(shù)要求。由于杜馬斯燃燒法儀器分析實際試樣量較小的緣故，該方法的試驗精密度略差于凱氏定氮法。對兩種分析方法的測試結(jié)果進(jìn)行t檢驗分析，統(tǒng)計分析表明，5個大豆樣品的杜馬斯燃燒法測試結(jié)果和凱氏定氮法測試結(jié)果之間無顯著性差異(P=0.89)。

表5 本研究建立方法與凱氏定氮法的測試結(jié)果比較

2.4 討論

由試驗數(shù)據(jù)分析可以看出，本研究建立的杜馬斯燃燒定氮法的測定結(jié)果比凱氏定氮法高0.8%～1.8%。這是由于兩種方法分析原理及測定試樣中的氮元素存在形態(tài)的范圍不同所致。杜馬斯燃燒定氮法是通過高溫灼燒的方式將包括硝態(tài)氮在內(nèi)的所有形態(tài)的氮元素參與燃燒、催化并定量檢測，測定數(shù)值表征的是試樣中的所有氮元素；而凱氏定氮法在試樣消解過程中會有硝態(tài)氮逸失。所以最終試驗結(jié)果前者略高于后者。

在我國現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)體系中，凱氏定氮法是大豆水溶性蛋白檢測現(xiàn)行有效的唯一標(biāo)準(zhǔn)方法。近幾年隨著氮元素檢測技術(shù)的不斷發(fā)展、成熟，杜馬斯燃燒定氮儀在國內(nèi)檢驗檢測和科研機(jī)構(gòu)得到推廣應(yīng)用。而且該儀器在運(yùn)行過程中不向環(huán)境釋放有毒有害物質(zhì)，屬于環(huán)境友好型化學(xué)分析方法，是化學(xué)儀器分析未來的研究、發(fā)展趨勢。

本研究建立的杜馬斯燃燒法測定大豆水溶性蛋白的方法相對于目前的凱氏定氮法而言，因其商品化儀器設(shè)備標(biāo)配自動進(jìn)樣器，以及其提取、蒸發(fā)、干燥、儀器分析等試驗過程消耗時間短于凱氏定氮法提取、硫酸消解、儀器分析等所消耗的時間，所以本研究建立方法的工作效率和標(biāo)準(zhǔn)化程度優(yōu)于現(xiàn)有的凱氏定氮法。雖然本研究創(chuàng)新性地引入蒸發(fā)、干燥程序，解決了杜馬斯燃燒定氮儀只能進(jìn)樣硅藻土吸附后的0.1～0.5 mL液體試樣的局限，使提取液體試樣進(jìn)樣量達(dá)到3～4 mL，保證了試驗結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性，但鑒于水溶性蛋白提取溶液的特殊性，如若能設(shè)計、研發(fā)一種專用性的蒸發(fā)、干燥設(shè)備，將進(jìn)一步提升該方法試驗過程的自動化、標(biāo)準(zhǔn)化程度。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種杜馬斯燃燒定氮法測定大豆水溶性蛋白的分析方法，該方法的試驗精密度符合GB/T 27404—2008中“檢測方法確認(rèn)過程中實驗室變異系數(shù)(CV)”的技術(shù)要求，與現(xiàn)行采用凱氏定氮法方法標(biāo)準(zhǔn)的測定結(jié)果無顯著性差異(P=0.89)。而且該方法屬于環(huán)境友好型化學(xué)分析方法，可以滿足大豆水溶性蛋白的無污染、快速、準(zhǔn)確檢測工作。