薛曉暢，李志蘭，張 存，王多寧，王春娟，黨林濤，王增祿

1第四軍醫(yī)大學藥學系生物制藥學教研室，陜西 西安 710032；2西安藍綠卓生物科技有限公司，陜西 西安710000；3西安醫(yī)學院科研中心，陜西 西安 710021

七葉皂苷為七葉樹科植物七葉樹的干燥成熟果實娑羅子中提取得到的總皂苷、β-七葉皂苷或異七葉皂苷等的總稱[1-3]。目前在臨床中應(yīng)用最多的為總七葉皂苷，主要含有七葉皂苷A、B、C和D[4-6]。在我國根據(jù)液相色譜出峰時間的先后，A～D的物質(zhì)分別對應(yīng)escin Ia、escin Ib、isoescin Ia及isoescin Ib[7-8]。其中的七葉皂苷A和B是β-型七葉皂苷，七葉皂苷C和D是七葉皂苷A和B的C21-羥基上乙酸酯轉(zhuǎn)位到C28-羥基的異構(gòu)體，是Crypto-型（異型）七葉皂苷。研究表明，總七葉皂苷具有抗炎、抗?jié)B出和改善血液循環(huán)等生物學特性[9-12]，因此已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于治療各種原因引起的腦水腫、創(chuàng)傷或手術(shù)所致腫脹、靜脈回流障礙或燒傷等疾病[13-14]。

鑒于七葉皂苷的廣泛臨床應(yīng)用前景，分離純化七葉皂苷日益受到重視，然而傳統(tǒng)的方法多采用醇提取、大孔樹脂分離、有機溶劑脫脂和結(jié)晶等方法，制備周期長，操作繁雜、有機溶劑使用過多，使得七葉皂苷的生產(chǎn)成本相對較高且易造成環(huán)境污染。本研究使用醇提或者水提（未發(fā)表數(shù)據(jù)）然后進行離子交換柱層析從七葉樹的果實娑羅子中提取了七葉皂苷，總七葉皂苷純度達到90%以上，層析中使用氯化鈉進行洗脫使得產(chǎn)物為七葉皂苷成鹽，解決了化合物的溶解性難題并降低了七葉皂苷致血管痙攣的毒性。將分離純化的七葉皂苷制備成氣霧劑/噴霧劑用于大鼠組織水腫模型，發(fā)現(xiàn)七葉皂苷對于組織水腫有顯著的療效，表明使用該工藝制備的七葉皂苷生物活性良好，其具良好的開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量200±20 g，購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑和儀器

乙醇、Na2HPO4和NaH2PO4等常規(guī)化學試劑（西安紅巖試劑廠），乙腈、磷酸（美國Fisher）?；钚蕴浚ū本┦泄馊A晶科活性炭有限公司），0.45 μm過濾膜（Millipore）。離子交換層析柱及介質(zhì)（美國GE）。Purifier層析儀（美國GE）、HPLC十八烷基硅烷鍵合硅膠層析柱（美國迪馬）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）、高效液相色譜儀（美國Waters 2695和大連伊力特）。

1.3 方法

1.3.1 七葉皂苷的提取和純化 稱取500 g娑羅子，粉碎，將其粉用2500 mL的80%乙醇溶液浸泡1 h、常規(guī)回流提取1 h，溫度控制在70 ℃，過濾，留濾液；向濾渣加入50%的乙醇溶液2000 mL，常規(guī)回流提取1 h，溫度控制在70 ℃，過濾，棄渣。合并兩次濾液，共3000 mL。向濾液中邊攪拌邊加入活性炭至棕紅色消失為止，靜置20 min，將脫色液在3500 r/min離心15 min，去沉淀，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮回收乙醇，濃縮液用0.45 μm膜抽濾，得濾液940 mL，備用。

選用 SP-Sepharose F.F 離子交換層析介質(zhì)，將其裝入45×300 mm柱，柱床高100 mm，連接到AKTA Purifier色譜儀（GE），以10 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液pH5.69為平衡液平衡柱子，流速10 mL/min，檢測波長為220 nm。向濾液中加入115 mL的200 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4pH5.69緩沖液，為上樣液。待柱子平衡后上樣，流速8 mL/min，收集穿過峰；上完樣后，用平衡液洗去末吸附物，收集洗滌末吸附物液體，將該液體與穿過峰合并為穿過液；線性梯度洗脫，洗脫液A即平衡液：10 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液pH5.69；洗脫液B：1 mol/L NaCl-10 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液pH5.69；用洗脫液B洗柱，流速10 mL/min，洗脫體積：1000 mL；平衡液平衡柱子備用。

向穿過液中邊攪拌邊加入乙醇溶液，使乙醇濃度達80%以上，密封4 ℃存放1 h，待沉淀完全，將沉淀物經(jīng)抽濾至干；收集濾液；減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收濾液中乙醇，待有七葉皂苷結(jié)晶出現(xiàn)時停止；靜置待七葉皂苷析出。用3500 r/min離心5 min收集晶體和濃縮母液。向濃縮母液中加入適量無水乙醇，混勻；減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮回收乙醇，濃縮液中結(jié)晶出七葉皂苷時停止，靜置，3500 r/min離心5 min收集晶體。合并收集的晶體，加入無水乙醇脫水，抽濾至干，棄上清，重復(fù)脫水洗滌兩次，繼續(xù)抽濾至干，沉淀物裝于烘盤內(nèi)，干燥箱內(nèi)烘干，箱內(nèi)溫度設(shè)置為45～55 ℃。稱重，得七葉皂苷。

1.3.2 七葉皂苷純度鑒定 按照高效液相色譜法（中國藥典2010年版二部附錄ⅤD）測定。色譜條件，用反相柱（十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑），乙腈-磷酸溶液（取85%磷酸5.5 mL，用水稀釋至1000 mL）（33：67）為流動相，調(diào)節(jié)pH值為2.1，檢測波長為215 nm。

供試品溶液制備：稱取七葉皂苷2.0 mg，加甲醇0.8 mL溶解、過濾，備用，其濃度為2.5 mg/mL。儀器選用Waters公司2695型HPLC儀，采用自動進樣器進樣20 μL，流速1.0 mL/min。

1.3.3 七葉皂苷噴霧劑制備 按照下表的配方制備七葉皂苷噴霧劑（表1）。具體的制備工藝為：首先將A相原料稱量后，加入B相，溶解攪拌均勻；然后將C相原料分別稱量后，溶解；在30 ℃下，將C相混合原料在攪拌下，緩慢加入到A、B相混合原料中；然后加入D相原料繼續(xù)攪拌均勻；最后加入E相原料和F原料，攪拌均勻后靜置24 h，檢驗合格后，灌裝，成品檢驗，入庫備用。

表1 七葉皂苷噴霧劑配方

1.3.4 建立大鼠組織水腫模型、實驗分組 所有SD大白鼠予以標準飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后隨機分為6組：正常組、模型組、云南白藥（陽性藥物）治療組、七葉皂苷鈉噴霧劑治療高、中、低劑量組。采用自制自由落體致傷模型進行，SD大鼠組織水腫造模，對不同打擊力度的模型進行評估分析，總結(jié)最優(yōu)化造模方案。具體方法為：除正常組以外的大鼠，固定架上固定四足后用電動理發(fā)推脫除后腿部毛發(fā)，隨后用自制撞擊器（以10 g砝碼從50 cm處卷筒內(nèi)自由落體掉下，撞擊接觸面直徑約為0.8 cm，撞擊沖量為2 kg/m）在小腿中部外側(cè)同一部位連續(xù)擊打3次，造成大鼠腿部肌肉局部軟組織挫傷。20 min后，裸露的肌肉發(fā)紅紫且腫脹起來形成局部淤血水腫。結(jié)果表明，出模率為100%且操作治療過程中無動物死亡。

1.3.5 大鼠軟組織損傷模型的治療 以云南白藥噴霧劑（市售藥，國藥準字Z53021107，云南白藥集團股份有限公司）為陽性對照藥物，設(shè)立七葉皂苷低（0.5 g/10 mL）、中（1 g/10 mL）、高劑量組（2.0 g/10 mL），分別在大鼠軟組織損傷的紅腫部位進行局部噴霧給藥進行治療。給藥2次/d，給藥日劑量分別為50、100、200 mg。治療4 d后，迅速麻醉處死大鼠，進行取材觀察。

1.3.6 組織取材和切片染色 選取大鼠損傷治療的中心部位組織，10%福爾馬林中固定24 h后，送西安交通大學附屬一醫(yī)院病理科和中國人民解放軍西京醫(yī)院病理科進行常規(guī)的梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（片厚5 μm），并進行HE染色和結(jié)果分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

運用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用雙尾t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 七葉皂苷的制備

采用前述的方法，對七葉皂苷進行了制備。我國不同地域娑羅子經(jīng)過0%～80%乙醇提取，濾液經(jīng)活性炭或中性氧化鋁脫色后進行HPLC鑒定，結(jié)果顯示七葉皂苷的純度達到80.9%以上（圖1）。將脫色后的提取液分別進行離子交換層析、精制和結(jié)晶等步驟，所獲得的七葉皂苷純度＞90%（HPLC分析，圖2）。分析圖譜中有4個主成分峰，分別為七葉皂苷A、B、C和D，其面積占比分別44.96%、26.04%、15.31%和6.48%，4個組分七葉皂苷面積占比之和為92.79%。符合“總七葉皂苷中含七葉皂苷A和七葉皂苷B應(yīng)分別為25.0%～45.0%和20.0%～35.0%”的藥用要求。在此研究基礎(chǔ)上，該項目已經(jīng)申報國家發(fā)明專利1項（一種七葉皂苷鈉的制備方法包含其的外用制劑及其應(yīng)用. ZL201510213030.5）。

圖2 七葉皂苷經(jīng)離子交換色譜純化后的HPLC鑒定圖譜

2.2 七葉皂苷噴霧劑對大鼠水腫模型的治療作用

將制備的七葉皂苷按照前述的配方制備成噴霧劑，對大鼠擠壓傷導致的組織水腫模型進行了治療，云南白藥設(shè)為陽性對照藥物。對大鼠模型制備前后以及治療后的后肢圍度進行測定，結(jié)果如圖3所示，云南白藥對后肢水腫具有良好的治療效果，七葉皂苷低劑量組效果不明顯（與治療前相比，P=0.14），而中劑量組（P＜0.05）和高劑量組（P＜0.01）則具有明顯的療效，可以顯著改善后肢的水腫程度。藥物治療72 h后處死大鼠，取損傷部位組織進行甲醛固定，石蠟包埋并組織切片，HE染色結(jié)果如圖4所示。染色結(jié)果表明正常大鼠腿部肌肉組織中未見肌肉細胞損傷（壞死）及炎性細胞浸潤（圖4A）；模型組大鼠損傷組織中可見大片組織壞死，炎性細胞浸潤明顯，肌間纖維組織中的炎細胞和纖維細胞浸潤明顯（圖4B）。陽性對照藥物云南白藥治療組大鼠損傷組織局部可見小量的炎性細胞浸潤，病灶比較?。▓D4C）；七葉皂苷低、中和高劑量組均可有效改善模型動物癥狀，與模型組相比病灶小、肌間纖維組織中無或僅有極少量的炎性細胞和纖維細胞浸潤，其效果等同或優(yōu)于云南白藥。

圖3 七葉皂苷鈉噴霧劑對組織水腫模型大鼠后肢腫脹程度的影響

圖4 七葉皂苷對組織水腫大鼠模型的治療作用（HE染色，×100）

3 討論

大量研究表明，七葉皂苷在臨床具有廣闊的應(yīng)用前景，總七葉皂苷具有抗炎、抗?jié)B出和改善血液循環(huán)等生物學特性[9-12]，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腦水腫、創(chuàng)傷或手術(shù)所致腫脹、靜脈回流障礙或燒傷等疾病的治療[13-15]。此外，王夢炎等[16]研究表明，β-七葉皂甙鈉可以有效地預(yù)防術(shù)后腸粘連；楊秀偉等[17]報道七葉皂苷-Ia組份可以作為抗腫瘤前藥，其在經(jīng)過人腸內(nèi)細菌和短乳桿菌粗酶轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的去?；呷~皂苷I具有抗腫瘤活性；β-七葉皂苷對于肝癌也具有潛在的治療作用，可以抑制肝癌細胞系的增殖并對其化療有增敏作用[18]。此外，對于七葉皂苷的作用分子機制也日益受到重視。周慶博等[19]研究發(fā)現(xiàn)β-七葉皂甙鈉可以通過調(diào)控超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）而發(fā)揮對大鼠腦出血的治療作用；有報道七葉皂甙鈉能夠通過調(diào)控巨噬細胞的HMGB1而抑制炎性因子的分泌，從而延長LPS誘導的敗血癥小鼠模型的生存期[20]。

考慮到七葉皂苷的諸多臨床用途，七葉皂苷單體及其復(fù)合體的分離純化一直備受關(guān)注。然而，傳統(tǒng)的中藥單體分離方法常常依賴于有機溶劑的萃取以及大孔吸附樹脂等填料的分離純化，具有較大的局限性。有機溶劑造價高、易造成環(huán)境污染、廢水回收處理成本高等；大孔吸附樹脂主要依靠非特異性吸附以及疏水作用進行目標組份的分離，分離度不夠精細，洗滌常常采用乙腈、甲醇等有機溶劑也提高了生產(chǎn)成本。如王緒英等[21]用乙酸乙酯除去脂溶性物質(zhì)、丙酮沉淀、NKA-9大孔樹脂和C18反相柱獲得最終的七葉皂苷，他們還比較了5種大孔樹脂 D4020、D101、NKA-9、H103、201×4和1種硅膠G分離七葉皂苷的效果，數(shù)據(jù)表明，NKA-9對七葉皂苷的吸附和解吸附性能均較好，專一性也較強，在實踐中有一定的開發(fā)和應(yīng)用價值[22]。陳新艷等[23]采用D101大孔樹脂（吸附時間24 h）和硅膠柱層析（需要氯仿和甲醇等有機溶劑洗滌）進行七葉皂苷的分離純化。也有人直接使用反相C18柱進行七葉皂苷的分離制備，如湛建峰等采用制備色譜柱waters HR C18進行了七葉皂苷的制備，然而該工藝造價高，使用了乙腈等有機溶劑作為流動相，且主要可用于A、B組份的制備[24]。

為了對傳統(tǒng)七葉皂苷純化工藝進行改良，本研究開創(chuàng)性地選擇常常用于蛋白質(zhì)等生物大分子分離純化的軟填料Sepharose瓊脂糖進行了七葉皂苷的組份分離。該填料與大孔樹脂比，主要依靠組份的荷電狀態(tài)進行分離純化，目標組份的分離可以選擇磷酸鹽和氯化鈉進行洗滌即可，載樣量大、使用壽命長（100～1000次），填料利用高濃度的氯化鈉溶液洗滌即可方便地再生。實驗結(jié)果表明，利用乙醇萃取出的混合物經(jīng)過一步離子交換色譜分離即可獲得90%以上的含有合乎藥用標準的A、B、C、D 4組份的七葉皂苷，再經(jīng)過乙醇洗滌沉淀、濃縮即可得最終的產(chǎn)物。經(jīng)過我們對傳統(tǒng)七葉皂苷提取工藝的優(yōu)化，獲得了簡便（節(jié)省幾十小時）、經(jīng)濟（使用水提或低濃度醇提代替高濃度醇提）和環(huán)保（去除了氯仿、乙醚等處理步驟）的七葉皂苷提取工藝。此外，分離純化過程中使用了無機鈉鹽使得七葉皂苷直接鰲合Na+成為七葉皂苷鈉鹽，在后期的使用中減少了對于肌肉和粘膜的刺激作用，減輕用藥部位局部疼痛和腫脹。

研究表明七葉皂苷具有消炎、抗組織水腫、抗?jié)B出、和預(yù)防組織內(nèi)水分存積等作用[25-27]，臨床用于腦水腫及創(chuàng)傷性水腫治療，已取得良好效果[28-30]。然而，目前市場上的七葉皂苷注射液不便于攜帶和使用，運輸儲存不便。為了考察提取制備的七葉皂苷是否具有良好的活性，本研究將其制成噴霧劑，并用于處理擠壓傷所致組織水腫動物模型。結(jié)果表明，與陽性對照藥物云南白藥相比[31-32]，中高劑量的七葉皂苷（0.5 g/10 mL）即對擠壓傷所致組織水腫具有良好的療效，高劑量七葉皂苷在抑制炎性細胞浸潤方面的作用優(yōu)于云南白藥。

總之，本研究獲得了利用離子交換層析進行七葉皂苷分離純化的經(jīng)濟高效的工藝，純化產(chǎn)品制備的噴霧劑對擠壓傷后的組織水腫具有良好的治療作用，有望成為一種功能更優(yōu)異、制備更環(huán)保、成本更低廉的組織水腫治療藥物。