黃百海，何 雷，李保林，修塵林，趙運旺

1燕山大學環(huán)境與化學工程學院，河北 秦皇島 066004；2秦皇島市第一醫(yī)院，河北 秦皇島 066000

碳水化合物抗原CA125作為上皮性卵巢癌腫瘤標志物[1]，到目前為止已被廣泛用于肝癌、肺癌、胃癌和乳腺癌的生物標志物[2-3]。人體血清內(nèi)CA125的水平被認為是一種有效的生物標志物上皮細胞的診斷、治療和監(jiān)測的理想指標卵巢癌[4]。目前，檢測CA125的方法主要包括酶聯(lián)免疫分析[5]、化學發(fā)光-毛細管電泳（CL-CE）測定[6]、電化學發(fā)光（ECL）免疫傳感器[7]和熒光免疫分析[8]等。這些CA125檢測的方法仍然有如復雜的實驗程序、靈敏度低、成本高、檢測時間長等缺點，可能會限制檢測效率和實用性。目前需要建立一種簡單，低成本和高效的檢測CA125方法。

核酸適體具有高親和力、強特異性，其自身能折疊成特定的空間結構與靶標分子特異性結合，常被稱為“化學抗體”[9-12]。與蛋白抗體相比，核酸適體具有特異性更高、親和力更強、穩(wěn)定性好、免疫原性和毒性低、易于合成、化學修飾及穿透腫瘤組織等優(yōu)點[13-15]。然而目前核酸適體在腫瘤學檢測方面仍處于研究階段，目前研究未見報道CA125抗原核酸適體的篩選。本研究以CA125抗原為靶標分子，利用消減SELEX技術進行篩選出能與CA125抗原特異性結合的核酸適體，建立一種簡單、快速的基于核酸適體檢測腫瘤血清標志物CA125抗原的分析方法，也為靶向藥物治療研制提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

ssDNA文庫: 5’-GCAATGGTACGGTACTTCCN40-CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'（N=A、G、T、C）；上游引物P7序列：5’-CTATAGCAATGG TACGGTACTTCC-3’（9.6nmol/L，A:2.0）；下游引物P11序列：5’-TTAGCAAAGTAGCGTGCACTTTTG-3’（4.2 nmol/L，A:1.0）及Bio-P11（4.2 nmol/L，A:1.0）引物由上海生工合成。1×Binding buffer（137 mmol/L NaCl， 2.7 mmol/L KCl， 6.5 mmol/L Na2HPO4， 1.8 mmol/L NaH2PO4， 2.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L CaCl2）

1.2 CA125核酸適體篩選

取100 pmol的ssDNA文庫，用1×Binding Buffer稀釋到1 mL，充分混勻，95 ℃、10 min及4 ℃、10 min。將預處理好的ssDNA文庫與CA199抗原-磁珠復合物孵育，37 ℃孵育1 h，分離磁珠，回收上清，將上清與CA125抗原-磁珠復合物孵育，37 ℃孵育1 h。1×Binding Buffer洗磁珠，加入200 μL純水，95 ℃加熱5 min，回收上清。

1.3 鏈霉親和素磁珠法制備次級ssDNA

整個篩選過程中，PCR的控制特別關鍵。在PCR擴增過程中引入有生物素修飾的引物，通過對稱PCR擴增每一輪的次級ssDNA文庫獲得量較大的標記有生物素的dsDNA產(chǎn)物。將擴增獲得的的雙鏈DNA產(chǎn)物通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)與磁珠特異性結合。經(jīng)過5%甲酰胺37 ℃孵育5 min，洗去非特異結合的dsDNA。通過95 ℃熱變性使雙鏈DNA解旋實現(xiàn)其分離。再對其進行磁分離，收集上清液即獲得次級ssDNA文庫。

1.4 ELONA法實時監(jiān)測篩選進程

按照鏈霉親和素磁珠法制備次級ssDNA文庫的方法，利用生物素標記的引物擴增獲得標記有生物素的次級ssDNA文庫。分別取50 μL磁珠于兩個1.5 mLEP管中，分別標記為“1+”、“1-”；“1+”、“1-”EP管分別與200 μL CA125抗原、200 μL CA199抗原，37 ℃孵育1 h；投入每輪標記后的ssDNA文庫，37 ℃孵育30 min，1×Binding Buffer洗3次，然后加入1∶1000稀釋 的 HRP-labeled Streptavidin 37 ℃ 孵 育 30 min，1×Binding Buffer（含1.5% Tween-20）洗3次，200 μL TMB顯色液，避光顯色15 min，50 μL 1 mol/L H2SO4終止反應，置于酶標儀測定A450nm值。

1.5 二代測序及數(shù)據(jù)分析

二代測序文庫送至上海生工生物工程有限公司進行二代測序。預計每個文庫測序得到約10000條序列。

1.6 核酸適體的二級結構分析

二代測序結果進行生物信息學分析。采用Clustal X軟件和DNAman軟件分析二代測序結果，拷貝數(shù)＞1000的核酸適體的保守序列。采用 mfold 軟件（Version 3.2）分析核酸適配體的二級結構。

1.7 ELONA法測定核酸適體CA125抗原的特異性

將包被CA125抗原、CA199抗原、CA125抗體、CA199抗體的磁珠分別與標記有生物素的候選核酸適配體37 ℃孵育30 min，1×Binding Buffer（含1.5%Tween-20）洗3次，然后加入1∶1000稀釋的HRP-labeled Streptavidin 37 ℃ 孵 育 30 min，1×Binding Buffer（含1.5% Tween-20）洗3次，200 μL TMB顯色液，避光顯色15 min，50 μL 1 mol/L H2SO4終止反應，置于酶標儀測定A450nm值。

1.8 核酸適體的解離常數(shù)檢測

將包被CA125抗原的磁珠與不同濃度FAM標記的候選核酸適體避光37 ℃孵育1 h，1×Binding Buffer（含1.5% Tween-20）洗3次。用TBS-380熒光定量儀檢測結合前后核酸適體的熒光強度變化，通過非線性回歸分析得到相應核酸適體的解離常數(shù)Kd。

2 結果

2.1 每輪ssDNA文庫的親和力測定結果

采用消減SELEX技術循環(huán)篩選，利用生物素—鏈霉親和素-辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測1-6輪ssDNA文庫與CA125抗原的親和力。結果表明，親和力在1～5輪明顯上升，第5輪SELEX篩選以后達到飽和。因此在第6輪時終止篩選（圖1）。

圖1 1-6輪ssDNA文庫親和力測定結果

2.2 CA125抗原特異性核酸適體的篩選

以CA125抗原為篩選靶標，CA199抗原作為反篩選靶標，經(jīng)過6輪SELEX篩選獲得飽和的次級ssDNA文庫。以每輪獲得的次級ssDNA文庫為模板通過對稱PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示每一輪的PCR產(chǎn)物片段大小均在100 bp以下出現(xiàn)單一條帶（片段大小為88 bp）（圖2），與初始ssDNA文庫片段大小吻合。第6輪SELEX篩選獲得的次級ssDNA文庫經(jīng)對稱PCR擴增獲得的產(chǎn)物進行二代測序，測序數(shù)據(jù)經(jīng)去掉兩端引物序列和兩端adapter，得到10000條序列，合成拷貝數(shù)＞1000的核酸序列。最終經(jīng)序列比對獲得了3條與CA125抗原高特異性結合的核酸適體。表1為核酸適體測序結果。

圖2 1-6輪ssDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

表1 核酸適體測序結果

2.3 核酸適體的同源性分析和二級結構預測結果

采用消減 SELEX 技術篩選核酸適體，通常對作用力達到飽和的核酸適體次級庫進行二代測序，但是這個SELEX篩選的終止不能反映在篩選過程中DNA的定向進化趨勢。隨著篩選輪數(shù)的增多，會存在一些核酸序列減少，而一些核酸序列增加的趨勢。所以將獲得的核酸適體次級庫進行高通量測序，從而系統(tǒng)分析在整個篩選流程中DNA的富集歷程。隨篩選輪數(shù)的增多，剩下來的核酸序列逐漸減少，到6輪時核酸適體序列數(shù)基本保持不變。

二代測序后，利用DNAman對3條核酸適體經(jīng)多序列比對和同源性分析。圖3所示代表性核酸適體中間區(qū)域之間的同源性，測序結果與預期長度一致，得到的核酸適配體中富含 G、C 堿基，其同源性達68.24%。同時，發(fā)現(xiàn)AGCT、ACCCCT和TGCGCG序列均在這3條核酸適體中存在，因此可以推斷CA125抗原特異識別AGCT、ACCCCT和TGCGCG 3種保守DNA序列，而其余的序列則有一定的變化。

圖3 核酸適體同源性分析結果

由于核酸適配體是利用其形成特殊的、穩(wěn)定的二級結構去識別和結合靶標，因此我們對3條核酸適體的核酸序列進行了二級結構預測。3條核酸適體的二級結構絕大部分為莖環(huán)結構，環(huán)主要為凸環(huán)和圓環(huán)（圖4）。提示，莖環(huán)可能就是核酸適體與CA125抗原結合的結構學基礎，莖起到穩(wěn)定支持適配體空間結構的作用，環(huán)通過堿基堆積、疏水相互作用和氫鍵作用等發(fā)生折疊形成高度結構化的與靶分子結合的位點，不同的結構具有不同的空間結合方式。

ssDNA二級結構其最低自由能代表了DNA空間結構的穩(wěn)定性，其最低自由能越小，核酸適體所形成的二級結構越穩(wěn)定。mfold軟件計算的3條核酸適體的自由能（ΔG）最低能量值見表1。

2.4 核酸適體親和力分析

對篩選得到的3條核酸適體（Apt-1、Apt-2、Apt-3）進行解離常數(shù)Kd的測定。熒光值在一定范圍內(nèi)與3條核酸適體的濃度呈正比關系（圖5），說明3條核酸適體與CA125抗原具有較高的親和力。用GraphPad Prism v5.0 擬合3條核酸適體的解離曲線，在3條核酸適體中Apt-3 Kd值最?。ū?），親和力最高。

2.5 特異性分析

CA199抗原、CA125抗體、CA199抗體對3條核酸適體與靶標分子的特異性結合均無明顯干擾作用，以核酸適體與CA125抗原結合的熒光強度為對照。特異性最強的是核酸適體Apt-3，其次是核酸適體Apt-2（圖6）。

3 討論

核酸適體能與靶標分子高特異地結合，在一定情況下能發(fā)揮某些生物學效應，核酸適體在自診斷和治療領域，將有望與傳統(tǒng)抗體相媲美[9]。Ireson等[16]利用合成的DNA適體與熒光淬滅方法可以高通量地檢測和區(qū)分體液中不同種類的蛋白質(zhì)。CA125是最常見的一種腫瘤血清標志物，而本研究則利用消減SELEX技術，以磁珠為篩選介質(zhì)，其分離效率高，一輪SELEX篩選過程為3 h，縮短了篩選周期。通過6輪快速篩選得到CA125抗原特異核酸適體。并利用該核酸適體建立一種快速檢測CA125的方法。該實驗耗時不足1 h，同時免去ELISA中的反復洗板過程，成為本研究的最大亮點。

圖4 核酸適體二級結構預測結果

圖5 核酸適體親和力檢測結果

圖6 3條核酸適體特異性分析結果

利用消減SELEX技術篩選核酸適體的方法，可將兩個同源的復合靶標中共同分子的核酸適體序列先進行消減[17]，進而快速、高效獲得差異靶分子的特異核酸適體[18-20]。整個實驗流程采用（次級）庫結合磁珠，經(jīng)孵育、洗脫、PCR擴增獲得標記有生物素的dsDNA，鏈霉親和素磁珠孵育制備次級ssDNA文庫，免去不對稱PCR制備過程中產(chǎn)生非特異ssDNA[21]。最后經(jīng)高通量測序確認富集程度和準確獲得較全面的富集核酸適體，避免了克隆后測序，造成核酸適體的丟失和不完整。其優(yōu)點是成本較低、操作簡單、快速、準確、全面等，并且能有效的消減去除非特異ssDNA的富集，篩選效率得到有效提高，篩選得到的核酸適體結構主要以莖環(huán)和凸環(huán)為主，提示可能是CA125與核酸適體結合的結構基礎。另外，還可以通過篩選得到的高特異性的核酸適體組直接通過實時熒光定量-PCR檢測待測樣本血清，該實驗過程耗時不足50 min。

本研究選用的文庫是含40 nt的隨機序列，總長為88 nt的DNA文庫。通過嚴格的篩選條件（孵育時間，金屬離子，洗脫時間，靶標分子濃度等）的優(yōu)化，不斷增加SELEX篩選中的篩選壓力，采用ELONA法實時監(jiān)測篩選進程，最終獲得的Apt-3高特異性、高親和力的核酸適體。后續(xù)的實驗中將通過序列裁減和修飾優(yōu)化，有利于進一步研究篩選得到的功能核酸適體與CA125抗原的結合位點，為腫瘤標志物的檢測提供了一種有效的工具和手段。對抗原與核酸適體相互作用機理的研究提供了理論基礎[22-23]。