郭 靜 于 宵 張 軍

子宮內(nèi)膜癌(carcinoma of endometrium)在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤前三位，占女性生殖道惡性腫瘤的1/3左右，占女性癌癥總數(shù)的8%左右[1-2]。子宮內(nèi)膜癌的具體發(fā)病機制還不明確，病因包括遺傳、長期雌激素刺激、體質(zhì)因素等[3-4]。人類的端粒是端粒DNA和端粒蛋白的復合物，其組成是染色體末端的幾千個雙鏈TTAGGG重復序列，有利于維護染色體末端穩(wěn)定性。端粒功能異常將導致細胞衰老和染色體不穩(wěn)定，也可導致機體腫瘤發(fā)生[5-6]。端粒酶是1種能將端粒DNA加以延長的酶，其功能是合成染色體端粒的重復序列，以維持端粒長度的穩(wěn)定性[7]。基礎研究表明，端粒長度和結構的維持及端粒酶活性受到端粒結合蛋白的調(diào)控，正常體細胞不表達或僅低表達端粒酶活性，人類腫瘤細胞和永生化細胞系端粒酶活性表達增高[8-9]。人端粒重復序列結合因子(telomeric repeat binding factor 1，TRF1)是端粒長度的負調(diào)控因子，是最重要的端粒結合蛋白之一，其也通過干擾端粒酶與染色體末端的結合，從而對端粒長度進行調(diào)控[10]。TRF1表達的相關性研究有助于豐富子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制與臨床特征，從而指導治療[11]。本試驗采用免疫組織化學技術檢測TRF1在子宮內(nèi)膜癌組織與癌旁組織中的表達，探討其與子宮內(nèi)膜癌患者臨床病理特征參數(shù)的相關性，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

采用回顧性、總結研究方法，2013年9月到2017年6月選擇在我院婦產(chǎn)科進行手術診治的子宮內(nèi)膜癌患者120例的癌組織標本與癌旁組織標本作為研究對象，納入標準：術前未接受放療、化療及激素治療；有完整的臨床病理資料；病理檢查診斷為子宮內(nèi)膜癌；癌旁組織與離癌組織距離≥3 cm；手術方式為子宮內(nèi)膜癌分期手術(廣泛子宮切除術、雙附件切除及盆腔淋巴結清掃術)；醫(yī)院倫理委員會批準了此次研究。排除標準：婦科內(nèi)分泌疾病及生殖道炎癥；妊娠與哺乳期婦女標本。

在120例患者的組織標本中，年齡45～78歲，平均年齡(65.33±4.21)歲，年齡≥60歲60例；分化程度：高分化80例，中分化20例，低分化20例；臨床分期：Ⅰ期60例，Ⅱ期40例，Ⅲ期20例；病理類型：子宮內(nèi)膜腺癌70例，漿液性乳頭狀腺癌30例，透明細胞癌20例；淋巴結轉(zhuǎn)移30例；肌層浸潤50例；形態(tài)：局灶型50例，彌漫型70例。

1.2 免疫組化方法

兔抗人TRF1多克隆抗體(ab1423)來自北京中杉金橋生物技術有限公司，DAB酶底物顯色劑來自廣州深達生物制品技術有限公司，Tris-EDTA抗原修復液購自北京博士德公司，EnvisionTM+加強型免疫組化試劑盒(兔/鼠雙標)購自DACO公司。

所有患者的癌組織標本與癌旁組織標本取材后，甲醛固定、石蠟包埋，制成石蠟切片(4 μm厚)。將切片組織37 ℃烤24 h，3 % H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，抗原修復后加入一抗，濕盒內(nèi)4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育30 min。DAB顯色，脫水封片后在光學顯微鏡觀察。取已知陽性組織切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 觀察指標

TRF1蛋白表達陽性為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細顆粒，染色強度陰性為0分、染色強為3分、染色清晰為2分、染色弱但強于陰性對照為1分。陽性細胞數(shù)<10%為0分，>60%為3分，31%～60%為2分，10%～30%為1分。上述二種評分相加0～1分為(-)，2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)。鏡下順序放大200倍，每張切片隨機選取10 個視野，(++)例數(shù)+(+++)例數(shù)/組內(nèi)例數(shù)×100.0%=陽性率，都由病理科醫(yī)院進行判定。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 TRF1表達陽性率對比

子宮內(nèi)膜癌組織中TRF1表達陽性率分別為90.8%，癌旁組織為28.3%，對比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同組織中TRF1表達陽性情況

2.2 TRF1表達與臨床病理特征參數(shù)的相關性

在子宮內(nèi)膜癌組織中，TRF1的表達陽性率隨著分化程度的降低、臨床分期的增加、肌層浸潤深度的加深、淋巴結的轉(zhuǎn)移而顯著增高(P<0.05)；TRF1表達陽性率與患者年齡、大體類型、組織類型無關(P>0.05)，見表2。

2.3 相關性分析

在子宮內(nèi)膜癌組織中，Spearman等級相關分析顯示：TRF1表達與臨床分期、肌層浸潤、淋巴結轉(zhuǎn)移呈顯著正相關性(P<0.05)，與分化程度呈顯著負相關性(P<0.05)，見表3。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是嚴重危害女性健康的疾病，當前在我國的發(fā)病率有上升趨勢，已對女性的生命和健康造成了嚴重的威脅[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌患者存在血糖異常，多伴隨有肥胖、高血壓、糖尿病等基礎疾病[13]。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展的確切的分子生物學機制還不明確，細胞增殖與凋亡的失衡是宮內(nèi)膜癌發(fā)生的重要機制[14]。

表2 TRF1表達與臨床病理特征參數(shù)的相關性(例，%)

表3 子宮內(nèi)膜癌組織TRF1表達的相關性分析

端粒是調(diào)節(jié)細胞增殖與凋亡的重要分子結構之一，端粒、端粒酶及端粒調(diào)節(jié)系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生中起重要作用。有研究顯示接近90 %的惡性腫瘤的端粒酶活性高于正常組織，且增高的程度可能與患者的病情與預后有關端粒是存在于真核生物線性染色體末端，端粒的主要作用在于維持染色體的穩(wěn)定與完整，其功能的發(fā)揮主要是依靠端粒長度和端粒結構的保持[15]。端粒酶、端粒結合蛋白和核糖基轉(zhuǎn)移酶等共同調(diào)控細胞端粒長度，其中端粒酶是RNA依賴的1種特殊的DNA多聚酶，能以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA序列并添加至染色體末端，從而延長端粒[16]。端粒調(diào)控除端粒酶的作用外，TRF1是另外的1個端粒結合蛋白。TRF1分子量約60 kD，由439個氨基酸組成，過表達TRF1可導致端粒逐漸和持續(xù)性縮短。基礎研究表明當TRF1高表達時，可保護端粒末端；而當TRF1下降時，從而降低了對端粒末端的保護，導致細胞具有了永生性[17]。本研究顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中TRF1表達陽性率分別為90.8%，癌旁組織為28.3%，對比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。有學者通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)TRF1蛋白的表達在慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者逐漸增強，特別是在肝癌患者中的TRF1蛋白表現(xiàn)為強陽性[18]。不過也有學者對顱腦腫瘤進行免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)TRF1的表達陽性率明顯低于正常組織、炎癥及良性腫瘤[19]。

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生是1個相對復雜的過程，也是多種因素綜合作用導致的病變。端粒酶是維持端粒長度的主要途徑，端粒酶活性又受到端粒結合蛋白的調(diào)控[20]。TRF1是第1個被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物的端粒結合蛋白，它與端粒雙鏈DNA結合，可阻止端粒酶與端粒的結合，改變端粒的結構，從而阻止端粒的延長。基礎研究表明TRF1是端粒延長的1個抑制因子，呈負反饋調(diào)節(jié)端粒的長度，TRF1變異或缺失會造成端粒延長并延長細胞壽命[21]。不同腫瘤組織中的TRF1表達水平結果不盡一致，但是均以表達在細胞漿為主。本研究顯示，在子宮內(nèi)膜癌組織中，TRF1的表達陽性率隨著分化程度的降低、臨床分期的增加、肌層浸潤深度的加深、淋巴結的轉(zhuǎn)移而顯著增高(P<0.05)。Spearman等級相關分析分析顯示TRF1表達與臨床分期、肌層浸潤、淋巴結轉(zhuǎn)移呈顯著正相關性(P<0.05)，與分化程度呈顯著負相關性(P<0.05)。從機制上分析，如果癌細胞的端粒比較長，表明具有比較高的端粒酶活性和高TRF1表達；如果癌細胞的端粒比較短，表明具有比較低的的端粒酶活性和低TRF1表達[22]。特別是在細胞有絲分裂過程中，端粒的長度逐漸縮短，如果細胞內(nèi)的某些抑癌基因如P53、Rb突變，細胞周期就會發(fā)生變化，導致端粒繼續(xù)縮短，最終導致細胞死亡[23]。但有如果有部分細胞在此階段激活端粒酶，染色體形態(tài)得到穩(wěn)定，端粒酶功能恢復，可導致正常細胞發(fā)展成為腫瘤細胞[24]。不過對于TRF1與子宮內(nèi)膜癌關系的研究還很有限，具體的機制還有待進一步分析。

綜上所述，TRF1在子宮內(nèi)膜癌組織中呈現(xiàn)高表達狀況，與臨床病理特征有很好的相關性，可用于指導進行臨床診斷與治療。