宋國紅，李 卿，尹小玲

（1.重慶市中藥研究院，重慶 400065； 2.重慶三峽中心醫(yī)院，重慶 404000）

益陰消渴原劑型為膠囊劑，功能主治為益氣養(yǎng)陰、清熱生津，用于氣陰不足所致消渴及2型糖尿病見上述證候者。由于原制劑中有效成分葛根素在水中溶解度較差，口服后吸收緩慢，選用的普通膠囊制劑采用部分藥物粉碎后直接入藥的方式，影響其臨床療效的發(fā)揮和患者的順應性。本研究中采用先進提取純化技術，提取分離益陰消渴處方中有效成分，提高有效成分含量，采用固體分散技術研制成現(xiàn)代速釋制劑，既能降低血糖，又能改善糖尿病癥狀，減少糖尿病并發(fā)癥，保護糖尿病受損靶器官，劑型先進，釋藥速度快，生物利用度高。本研究中采用L9（34）正交試驗設計，以處方中君藥葛根的主要成分葛根素為測評指標，優(yōu)化益陰消渴方的提取工藝，為其工業(yè)化生產提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：LC-2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SB-5200D型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH-S型水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

試藥：葛根、野苦瓜、荔枝核、山藥藥材均購自重慶市菜園壩中藥材市場，經重慶市中藥研究院肖銘玉副研究員分別鑒定為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）ohwi的干燥根，葫蘆科植物野苦瓜Momordica charantiaL.的成熟果，無患子科植物荔枝Litchi chinensisSonn.的干燥成熟種子，薯蕷科植物薯蕷Dioscorea oppositeThunb.的干燥根莖；葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號為752-200108）；甲醇為色譜純，水為一級水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 葛根素含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗［1］

色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -水（28 ∶72）；流速：1 mL ／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：250 nm。在此條件下的色譜圖見圖1。葛根素色譜峰與相鄰峰分離度良好。

2.1.2 溶液制備

取葛根素對照品18.64 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液。照樣品處方比例，取野苦瓜2.5 g，葛根15.5 g，荔枝核1.0 g，山藥1.0 g，共9份，按正交試驗方案回流提取，濾過，濃縮至適量，用乙醇定容至250 mL，搖勻；精密量取2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲提?。üβ蕿?00 W，頻率為50 kHz）15 min，冷至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。照樣品處方比例，稱取缺葛根的其余3味藥材，照供試品溶液制備方法制備缺葛根陰性對照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密吸取葛根素對照品貯備溶液 0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取10 μL，進樣，按擬訂色譜條件測定，以葛根素進樣量（X，g）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝7131295X-34632，r＝0.9999（n＝5）。結果表明，葛根素進樣量在 0.3728 ～3.728 0 g范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液10 μL，在擬訂色譜條件下連續(xù)進樣6次，測定。結果的RSD為0.78%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，1，4，8，16 h時進樣測定，結果峰面積值的RSD為0.94%（n＝6），表明供試品溶液在16 h內較穩(wěn)定。

重復性試驗：取制備的同一樣品6份，照2.1.2項下供試品溶液制備方法中“精密量取2.0 mL”起，制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，測定峰面積，計算含量。結果的RSD為1.06%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一樣品6份，精密加入葛根素對照品適量，照2.1.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 葛根素加樣回收試驗結果（n＝6）

2.2 提取試驗單因素考察

以乙醇為提取溶劑，采用回流法進行提取，以葛根素的含量為考察指標，設置單因素試驗分別考察料液比、提取時間和提取次數(shù)對葛根素的影響。

料液比：按處方比例，稱取5份樣品，分別加入4，6，8，10，12 倍量 65% 乙醇，提取 2 次，每次 60 min，濾過，合并濾液，加乙醇定容至 250 ml，搖勻。照 2.1.2 項下供試品溶液制備方法中“精密量取2.0 mL”起，制備供試品溶液，進樣測定。

提取時間：按處方比例，稱取5份樣品，分別加入10倍量 65% 乙醇，提取 2 次，時間為 30，40，60，70，80 min，濾過，合并濾液，加乙醇定容至250 mL，搖勻。照2.1.2項下供試品溶液制備“精密量取2.0 mL”起，制備供試品溶液，進樣測定。

提取次數(shù)：稱取5份樣品，加入10倍量65%乙醇，分別提取 1，2，3，4 次，時間為 60 min，濾過，濾液加乙醇定容至250 mL，搖勻。照2.1.2項下供試品溶液制備“精密量取2.0 mL”起，制備供試品溶液，進樣測定。

試驗結果：隨著料液比的增加，葛根素含量增加，在8倍量時達最大值，再增大提取溶劑用量，含量不再增加。因此提取溶劑的用量以6，8，10倍量作為正交試驗料液比的3個水平；回流提取時間試驗結果表明，試驗前段隨著提取時間的增加，葛根素含量增加，60 min后葛根素含量趨于穩(wěn)定，故選擇回流50，60，90 min作為正交試驗提取時間的3個水平；提取次數(shù)試驗結果表明，葛根素含量在提取2次后維持在相對平穩(wěn)狀態(tài)，故選擇1，2，3次作為正交試驗提取次數(shù)的3個水平。

2.3 提取工藝優(yōu)化

正交試驗：以提取液中的葛根素為考察指標，因素A為乙醇濃度，因素B為溶劑用量，因素C為提取時間，因素D為提取次數(shù)，采用L9（34）正交試驗進行試驗。結果見表2和表3?？梢姡绊懱崛⌒Ч囊蛩仨樞驗镈＞A＞C＞B，以D3A3C3B2組合最佳。因素A與因素D影響較大，因素C與因素B影響較小，故從節(jié)能、低成本考慮，生產中采用70%乙醇提取3次，乙醇用量為藥材量的6倍，第1次回流1.5h，第2，3次回流1 h。

2.4 驗證試驗

為驗證優(yōu)選工藝的合理性，根據(jù)擬訂提取方法，稱取野苦瓜20 g，葛根124 g，荔枝核8 g，山藥8 g，共3份，采用70%乙醇提取3次，乙醇用量為藥材量的6倍，第1次回流1.5 h，第2次、第3次回流1 h，濾過，合并濾液，回收乙醇，并用乙醇定容至適量，測得葛根素含量分別為 0.846%，0.851%，0.848%，RSD為 0.30% （n＝3）。表明益陰消渴滴丸新的提取工藝能達到提取要求，符合實際生產需要，提取工藝條件穩(wěn)定可行。

表2 正交試驗因素水平及結果（n＝9）

表3 方差分析

3 討論

本試驗中通過影響提取效率的單因素考察與正交試驗相結合的方式，優(yōu)化了益陰消渴方的初步提取工藝，為后續(xù)分離純化提供了數(shù)據(jù)分析基礎。篩選優(yōu)化工藝參數(shù)時，不僅考慮了葛根素的提取率，且充分注重提取方法在工業(yè)化大生產中的實際應用，即生產成本，人力、物力消耗，溶劑損耗，提取周期的設置等，節(jié)省各項生產中消耗支出，極大地增強了企業(yè)的產品競爭力。

參考文獻［2-10］，葛根含多種化學成分，包括黃酮類、三萜類、甾體類、香豆素類，其提取方法有乙醇回流提取法、乙醇超聲提取法、微波法、超臨界提取法、水煎煮提取法等；野苦瓜主要化學成分包括三萜、甾類、生物堿；荔枝核含皂苷；山藥含游離氨基酸，尿囊素，膽堿，麥角甾醇等，以上各藥所含主要有效成分在水和乙醇中均能較好地溶解。前期預試中，對處方中藥材的提取方法進行了初步篩選，結果發(fā)現(xiàn)，以葛根素為代表的檢測指標采用水煎煮法進行制備，其含量為0.65%；采用乙醇回流法進行提取，葛根素含量為0.82%。2種提取方法差異明顯，故本研究選用乙醇回流法進行制備工藝優(yōu)化。

采用正交試驗優(yōu)化中藥類產品提取工藝時，多采用含量檢測結合浸膏收率的多指標試驗優(yōu)選工藝參數(shù)，由于浸膏收率不但不能突出表明該工藝的優(yōu)越性，各項影響因素及水平對浸膏收率的影響不盡相同，反而可能阻礙其含量檢測指標對試驗結果的分析和判斷。而本試驗中制備高效富集處方的有效部位群要為下一步純化提供數(shù)據(jù)基礎，故未選擇浸膏收率作為該優(yōu)化提取工藝參數(shù)的指標。益陰消渴原制劑為部分葛根藥材粉碎入藥，葛根中主要成分葛根素溶出較慢［11-14］，在人體內吸收和利用較差。本試驗中選用乙醇回流提取法進行制備，野苦瓜、葛根等有效成分相當部分都能從藥材中提取，再經大孔樹脂富集、純化，中間固形物收率減少，日服用量降低，利用固體分散技術制成滴丸劑，藥物中有效成分溶出速度加快，生物利用度提高。