王 鑫，侯 威，趙 磊，*，王成濤，*，盧 松

(1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學，北京100048;2.阜豐集團內蒙古阜豐生物科技有限公司，內蒙古呼和浩特010030)

我國是全球第二大玉米生產國，占世界總產量的20%［1］。玉米黃粉是玉米濕法加工淀粉時產生的副產物，其中含有30%～70%的蛋白質［2］，可分為玉米醇溶蛋白、谷蛋白、球蛋白和白蛋白等成分［3］。但是由于其氣味和色澤獨特，口感粗糙，色氨酸、賴氨酸等人體必需氨基酸組成不充分，大大限制了其在食品行業(yè)中的應用［4］，在我國主要被用作動物飼料或發(fā)酵行業(yè)氮源，極少被綜合開發(fā)利用［5］。而在美、日等發(fā)達國家，一些蛋白加工企業(yè)對玉米黃粉進行了充分挖掘，生產出一系列高附加值產品，玉米黃粉的價值得到了很大提高。

高 F值活性肽(High Fischer ratio peptide，HFRP)是一類由2～9個氨基酸殘基所組成的復合小肽，其顯著特征是支鏈氨基酸(Brand chain amino acid，BCAA)與芳香族氨基酸(Aromatic amino acids，AAA)含量的摩爾數(shù)比值(即F值)較高，一般應大于20［6－7］。其中，BCAA 主要包括:纈氨酸(Val) 、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile);AAA主要包括:色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)［8］。HFRP 是一種重要活性肽，具有抗疲勞、改善肝、腎、腸、胃疾病患者營養(yǎng)的功能［9－10］。玉米黃粉中 BCAA 所占比例為23.79%，BCAA與AAA比值高達4.8，這兩項指標遠高于其他谷類中的稻谷(3.81)、小麥(3.29)、高粱(4.6)和油料作物中的大豆(3.91)、蠶豆(3.97)、扁豆(3.32)［11］，可以有效利用這一天然優(yōu)勢，并在蛋白酶酶解作用下進一步降低芳香族氨基酸含量制備HFRP［12］。鄭喜群等［13］采用堿性蛋白酶和米曲霉固態(tài)發(fā)酵產生的羧肽酶依次水解玉米醇溶蛋白，制備HFRP;Cheison等［14］采用胰蛋白酶作為水解酶，得到制備HFRP的最佳條件。

HFRP經口攝入、進入機體發(fā)揮生理功能，需要面臨胃腸道的物理屏障和生化屏障雙重作用，前者主要包括由消化道粘膜層、細胞分泌系統(tǒng)、上皮細胞間的緊密連接等構成的物理屏障，后者是指胃內低pH、胃腸內多種消化酶等消化降解［15］。因此，采用模擬胃腸消化模型和單層細胞模型，篩選出HFRP中可以被完整、高效吸收的肽。

本研究以玉米黃粉為原料，采用復合酶解法制備HFRP，利用活性炭吸附進一步降低芳香族氨基酸比例，提高F值，并通過分子量、電荷性和疏水性將其分離純化，進一步研究其吸收狀況和胃腸消化狀況，為新型活性肽保健食品的研究開發(fā)提供理論依據和技術支持，為玉米黃粉的綜合利用探索新道路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米黃粉 阜豐集團有限公司;堿性蛋白酶(2×105U/g)、風味蛋白酶(3.37×104U/g) 諾維信(中國)公司;胃蛋白酶(1×104U/g)、胰蛋白酶(1×104U/g) Solarbio公司;Octyl Sepharose 4 Fast Flow、Sephadex－G15、CM FF 16/10、DEAE FF 16/10、酪蛋白、L－酪氨酸 美國 Sigma公司;Caco－2細胞 北京金紫晶生物醫(yī)藥技術有限公司;不完全培養(yǎng)液MEM－EBSS 北京博爾金科技有限公司;胎牛血清、100 U/mL青－鏈雙抗 美國Ameresco公司;AKP檢測試劑盒、BCA微量蛋白檢測試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司;其它試劑 均為分析純或色譜純。

L－8900氨基酸自動分析儀 日本日立公司;UV2450紫外可見光分光光度計 日本島津公司;YS－10小型高速粉碎機 北京燕山正德機械設備有限公司;HQ45恒溫搖床 中國科學院武漢科學儀器廠;Supra高速冷凍離心機 韓國Hanil Science Industrial(翰尼科學產業(yè));ATN－300自動凱氏定氮儀 上海洪紀儀器設備有限公司;Sorvall Legend Micro 17R微量離心機 美國Thermo公司;FD－1B－80冷凍干燥機 南京普森儀器公司;purifier 10 AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國通用公司;Axiovert 200倒置顯微鏡 德國Zeiss公司;STX2跨膜電阻儀 世界精密儀器商貿(上海)有限公司WPI;HH－4水浴鍋 上海藍凱儀器儀表有限公司;Galaxy S CO2培養(yǎng)箱 英國RS Biotech公司;SpectraMax I3多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司;1290－Q－TOF－MS/MS液相色譜－質譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技公司;MLS－3750高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋電機株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 理化指標的測定 根據GB/T 5009.3－2016食品中水分的測定［16］中直接干燥法測定水分含量;根據 GB/T 5009.4－2016 食品中灰分的測定［17］中灼燒稱質量法測定灰分含量;根據GB/T 5009.5－2016食品中蛋白質的測定［18］中凱氏定氮法(F=6.24)測定蛋白質含量;根據GB/T 5009.6－2006食品中脂肪的測定［19］中索氏抽提法測定脂肪含量。將樣品置于水解管中，加入6 mol/L的HCl溶液，110℃真空水解24 h，冷卻后定容，過濾干燥，加入0.02 mol/L的HCl溶液室溫放置30 min，采用氨基酸自動分析儀測定除色氨酸外的氨基酸含量。

1.2.2 HFRP的制備 以玉米黃粉為原料，首先經堿性蛋白進行初次酶解(添加量1.25×104U/g底物、p H9、料液比1∶35、溫度 50 ℃、時間 3 h)，將芳香族氨基酸暴露于肽端，然后通過風味蛋白酶進行二次酶解(添加量1.01×103U/g底物、p H7、溫度45℃、時間2.5 h)，使芳香族氨基酸游離于酶解液中。利用活性炭對酶解液中游離氨基酸進行吸附(添加量7%、pH4、溫度30℃、時間1.5 h)，然后選擇桿菌肽(分子量1422.69 Da)、合成多肽1(分子量912.835 Da)、合成多肽 2(分子量 493.46 Da)、色氨酸(分子量204.213 Da)作為檢測標準物，依據其在 sephadex G－15自裝柱中保留時間的不同，確定所制備的活性肽的分子量范圍(上樣量100μL、樣品濃度10 mg/mL、流速0.3 mL/min、流動相為高純水、檢測波長280 nm)。收集2～9個氨基酸組成的HFRP(＜1000 Da)，對其進行真空冷凍干燥，干燥溫度設為－52℃，時間36 h，－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 不同分子量HFRP的分離 凝膠的預處理:取適量Sephadex G15填料，沸水煮30 min排除膠粒中的空氣，輕輕攪拌，靜置20 min后傾去破損漂浮的粒子，反復數(shù)次。裝柱:保持空柱垂直，沿上壁緩慢倒入凝膠液，保持填料始終處于 Tris－HCl緩沖液(0.5 mol/L，p H8.0)以下，至凝膠沉淀離柱上端1.5～2 cm處，利用緩沖液平衡過夜。加樣與洗脫:樣品質量濃度為35 mg/mL，洗脫液為蒸餾水，洗脫流速0.5～1 mL/min之間，洗脫至 OD280＜0.02。收集各組分，對其進行真空冷凍干燥，干燥溫度設為－52℃，時間36 h，－20℃儲存?zhèn)溆?。選擇合成多肽1(分子量912.835 Da)、合成多肽2(分子量493.46 Da)、色氨酸(分子量204.213 Da)作為分子量界限，對吸附后樣品分子量進行檢測。

1.2.4 不同電荷性HFRP的分離 選用陽離子層析介質CM FF 16/10和陰離子層析介質DEAE FF 16/10裝柱進行試驗，裝柱方法同1.2.3。樣品以2 mL/min的流速上柱，用50 mmol/L p H8.8 Tris－HCl緩沖液以5 mL/min流速洗脫至 OD280＜0.02，隨后用 0～0.5 mol/L NaCl連續(xù)梯度，流速為2 mL/min洗脫。收集各組分，對其進行真空冷凍干燥，干燥溫度設為－52℃，時間36 h，－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 不同疏水性HFRP的分離 選用Octyl Sepharose 4 Fast Flow填料裝柱進行試驗，裝柱方法同1.2.3。配置 2～3個柱體積 0.1 mol/L p H7.0 Na2HPO4溶液，1.7 mol/L(NH4)2SO4與樣品混合，經過填料，使樣品完全吸附，然后按照100%～0%1.7 mol/L(NH4)2SO4梯度洗脫500 mL，洗脫液的流速控制在2 mL/min，洗脫至OD280＜0.02。收集各組分，對其進行真空冷凍干燥，干燥溫度設為－52℃，時間36 h，－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 吸收模型的構建 參考Xie等［20］的方法進行細胞培養(yǎng)。將新購Caco－2細胞置于一次性細胞培養(yǎng)瓶(25 cm2)中，加入完全培養(yǎng)液(不完全MEMEBSS培養(yǎng)液、1%100 U/mL青－鏈雙抗(V/V)、10%胎牛血清(FBS，V/V))，于37℃、90%相對濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液，之后隔天換液。在倒置顯微鏡下觀察，細胞融合度達到90%時，用0.25%胰蛋白酶溶液消化5 min，待培養(yǎng)瓶中細胞成片脫落時加入完全培養(yǎng)液終止消化，利用一次性吸管吹打，將消化液轉入15 mL離心管，于1000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入完全培養(yǎng)基進一步吹散成單個細胞懸液，細胞計數(shù)后，調整細胞濃度為5×104個/mL。向Transwell轉運板膜底側(BL側)小池內加入1.5 mL完全培養(yǎng)基，向膜上側(AP側)小池內加入稀釋好的含有細胞的混合培養(yǎng)液0.5 mL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d，期間每隔2 d更換一次完全培養(yǎng)液，直至Caco－2形成致密完整的單層細胞結構，并且分化成熟，可用于模擬吸收試驗。

1.2.7 吸收模型評價

1.2.7.1 跨膜電阻(TEER)值測定 TEER值是反映細胞單層完整性的一個指標，一般TEER值在200～1000Ω·cm2范圍之內，值越大，細胞單層致密越完整［21］。吸棄培養(yǎng)液，小室內外均加入37℃預熱的PBS溶液，重復三次，其中第三次放于培養(yǎng)箱中孵育30 min后連上細胞電位儀測電阻。

1.2.7.2 熒光黃透過率測定 預熱HBSS(0.4 g/L KCl、60 mg/L KH2PO4、8 g/L NaCl、60 mg/L Na2HPO4、0.35 g/L NaHCO3、1 g/L D－葡萄糖和 2.38 g/L HEPES，pH7.2)溶液到37℃。向 Transwell轉運板AP側加入0.4 mL熒光黃(100 mg/mL)HBSS溶液，BL側加入0.6 mL空白HBSS溶液，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，從BL側取0.5 mL樣品液。利用酶標儀(激發(fā)波長427 nm、發(fā)射波長536 nm)測定吸光值，依據以下公式計算表觀滲透系數(shù)。

式中:dQ/dt是單位時間藥物轉運量(mg/s)，A是轉運膜表面積(cm2)，C0是培養(yǎng)液中熒光黃原始濃度(μg/mL)。

1.2.7.3 堿性磷酸酶活性測定 堿性磷酸酶可分解磷酸苯二鈉，產生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4－氨基安替吡啉作用，經鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據紅色深淺可以測定酶活力的高低［22］。本實驗使用 AKP試劑盒按說明書步驟，分別在Transwell膜的兩側取樣，測定堿性磷酸酶活力。根據標準曲線方程計算堿性磷酸酶活力，結果以金氏單位(37℃時，與基質作用15 min產生1 mg酚為一個金氏單位)表示。

1.2.8 Caco－2細胞模型轉運方法 利用HBSS溶液將不同分子特性的各個活性肽組分溶解、稀釋成20 mg/mL的溶液，并調節(jié)其p H至7.0±0.1，在BL側加入1.5 mL的HBSS溶液，AP側加入0.5 mL的活性肽溶液，1.5 h后收集BL側溶液，對其進行真空冷凍干燥，干燥溫度設為－52℃，時間36 h，－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.9 體外模擬胃腸消化 參考Samaranayaka等［23］和Ruiz等［24］的方法進行。模擬胃液:胃蛋白酶3.2 g、NaCl 2.0 g、濃鹽酸 7 mL、去離子水 1000 mL，調節(jié)p H2.0±0.1。模擬腸液:KH2PO46.8 g、0.2 mol/L NaOH 190 mL、胰蛋白酶10 g、去離子水 1000 mL，調節(jié)p H7.5±0.1。HFRP中可被吸收的多肽+胃液+腸液:用0.01 mol/L鹽酸(pH2.0)將不同分子特性的多肽樣品稀釋至10 mg/mL，按照上述方法配制模擬胃液，分別在37℃的條件下預熱10 min。按照酶與底物之比為1∶35(w/w)分別混合模擬胃液與底物，并于37℃保持2 h。2 h后，用0.9 mol/L NaHCO3將消化液pH調節(jié)至5.3，再用2 mol/L NaOH調節(jié)p H至7.5，按照酶與底物的比例為1∶50(w/w)將配制好的模擬腸液與胃消化液混合，2 h后腸消化完畢，沸水浴滅酶10 min，冷卻至室溫后，真空冷凍干燥至粉末(－52 ℃，36 h)，－80 ℃儲存?zhèn)溆谩?.2.10 多肽結構鑒定 采用HPLC－Q－TOF鑒定經細胞轉運后膜下側(BL側)組分結構，其中液相條件為:Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 2.1×50 mm，1.8μm色譜柱、柱溫30℃、流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)，線性梯度洗脫:0～60 min，B 10% ～60%、流速 1.0 mL/min、進樣量10μL;質譜條件為:電噴霧離子源ESI、正離子模式、毛細管電壓3500 V、噴嘴電壓500 V、碰撞能80 eV、干燥器溫度300℃、流量5.0 L/min、鞘氣(N2)溫度150℃、鞘氣流量 1 L/min、離子掃描范圍 50～1000 m/z;二級質譜碰撞電壓15 eV。正、負離子一級質譜全掃描及二級質譜全掃描分析。

1.3 數(shù)據處理

實驗結果用珚X±SD表示，數(shù)據處理采用Excel軟件。

2 結果與分析

2.1 玉米黃粉的基本成分及氨基酸組成

玉米黃粉常規(guī)測定結果見表1。其中蛋白質含量高達59.17%。進一步利用氨基酸分析儀對玉米黃粉中氨基酸組成進行分析(表2)，可以看出玉米黃粉中Leu、Val、Ile等支鏈氨基酸含量較高，分別為16.96%、4.37%、2.31%，占總氨基酸含量的23.64%，而Tyr和Phe等芳香族氨基酸含量較低，分別為2.83%和4.85%，占總氨基酸含量的7.68%;另外，Ala、Val、Pro、Met、Ile、Leu 和 Phe 屬于疏水性氨基酸，總量占氨基酸總量的54.03%，表明玉米蛋白是一種疏水程度較大的蛋白，這一特殊組成也是造成玉米中蛋白質水溶性差的主要原因。

表1 玉米黃粉的基本成分Table 1 Basic components of corn gluten meal

2.2 不同分子量HFRP的制備結果

由圖1可見，HFRP經Sephadex G15分離后得到SE－F1、SE－F2和 SE－F3，共3個組分。根據凝膠色譜吸附原理［25］，分子量 SE－F1(493.46～912.835 Da) ＞SE－F2(204.213～493.46 Da) ＞SE－F3( ＜204.213 Da)，并且SE－F1組分的含量最多。分別將3個組分多次收集，冷凍干燥后備用。

圖1 高F值活性肽的Sephadex G15凝膠柱分離圖譜Fig.1 The spectrum of high Fischer ratio peptide on a column of Sephadex G－15

2.3 不同電荷性HFRP的制備結果

為分離得到不同電荷特性的活性肽組分，本試驗按照1.2.4中提供的方法，將制備得到的HFRP進行分離，得到帶有不同電荷的組分(CM－Fx和DE－Fx)，陽離子和陰離子層析分離結果分別見圖2和圖3。圖2中HFRP經陽離子層析介質CM FF 16/10分離，得到CM－F1、CM－F2和CM－F3共3個組分。根據陽離子層析原理，固定相本身帶有負電荷，當待分離活性肽的電荷小于所使用平衡液的pH時，多肽帶有負電，因此不被吸附，根據電荷性由弱到強依次被平衡液洗脫下來，而當活性肽所帶的電荷大于平衡液的pH時，多肽帶有正電而被吸附到樹脂的負電荷基團上，這些多肽需要更高強度的鹽溶液下才能洗脫下來［26］。陰離子交換樹脂層析原理與陽離子交換樹脂層析原理相反。圖3中HFRP經陰離子層析介質DEAE FF 16/10分離，得到 DE－F1、DE－F2、DE－F3共3 個組分。分別將6個組分多次收集，冷凍干燥后備用。

圖2 高F值活性肽的陽離子分離圖譜Fig.2 The spectrum of high Fischer ratio peptide on a column of cations

圖3 高F值活性肽的陰離子分離圖譜Fig.3 The spectrum of high Fischer ratio peptide on a column of anions

2.4 不同疏水性HFRP的制備結果

由圖4可知，HFRP經疏水層析填料 Octyl Sepharose 4 Fast Flow洗脫后共出現(xiàn)3個峰，得到OC－F1、OC－F2和OC－F3共3個組分。隨著時間的延長，洗脫液中鹽離子濃度逐漸增大，被洗脫下來的組分，其疏水性越來越強［27］，按照疏水強度排列為OC－F1＜OC－F2＜OC－F3。分別將3個組分多次收集，冷凍干燥后備用。

圖4 高F值活性肽的疏水性層析分離圖譜Fig.4 The spectrum of high Fischer ratio peptide on a column of hydrophobicity interaction chromatography

2.5 吸收模型評價

2.5.1 Caco－2細胞TEER值的測定結果 吸收模型構建成功與否與Caco－2細胞接種量大小密切相關，本試驗通過在相同膜面積的小池中接種1.5、2.5、3.5、4.5、5.5×105個/cm2，選擇最佳接種量。由圖5可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，Transwell轉運板上Caco－2細胞成膜的完整性逐漸趨于完善。接種量為1.5×105個/cm2時，第22 d TEER值仍沒有達到試驗的最低要求(TEER值＞200Ω/cm2)，可見接種量較小，導致細胞沒有形成完整的膜結構。接種量＞2.5×105個/cm2時，第8 d以后TEER值均有增長，第9 d達到400Ω/cm2。但是繼續(xù)培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，接種量為4.5×105個/cm2和5.5×105個/cm2的試驗孔，TEER值在16 d之后呈現(xiàn)下降的趨勢，可能是由于細胞接種量過密導致的局部隆起、破裂產生孔洞，相比之下，接種量為2.5×105個/cm2和3.5×105個/cm2時，TEER值穩(wěn)定增長并能保持在400Ω/cm2左右，說明在此接種范圍內所造模型能夠形成完整的膜結構，綜合考慮選擇2.5×105個/cm2為最佳接種量，雖然在此接種量的條件下，TEER值在第10 d之后已經達到試驗要求，但是Caco－2細胞還只是分裂復制形成單層膜結構，并沒有開始分化形成類似于小腸的微絨毛結構，因此，吸收試驗還應在接種后第21 d后進行試驗。

圖5 不同接種量不同的時間段12孔TransWell培養(yǎng)板細胞的跨膜電阻值Fig.5 TEER curves of the Caco－2 monolayer in a TransWell 12－well plate at different inoculation amounts and different periods

2.5.2 Caco－2細胞熒光黃通透率的測定結果 在21 d培養(yǎng)的Caco－2單細胞層熒光黃轉運的熒光黃通透率(Papp)為(0.086±0.04) ×10－6cm/s，小于轉運實驗規(guī)定的 1.0 ×10－6cm/s［28］，說明所形成的單細胞層完整性符合實驗要求，可用于轉運實驗。

2.5.3 Caco－2細胞堿性磷酸酶活性的測定結果 在21 d培養(yǎng)的Caco－2單細胞層AP、BL側堿性磷酸酶活性 AP/BL＞10［28］，說明吸收模型分化完全。

本實驗建立的 Caco－2細胞模型的 TEER值(200～1000 Ω/cm2)［20］、熒光黃通透率( ＜ 1.0 ×10－6cm/s)［27］和堿性磷酸酶活性(AP/BL ＞ 10)［29］，符合體外模擬胃腸消化實驗要求，可用于HFRP消化吸收特性的研究。

2.6 不同分子特性的HFRP BL側透過多肽一級質譜測定結果

2.6.1 不同分子量的HFRP BL側透過多肽一級質譜測定結果 向BL側加入p H7.2的HBSS 1.5 mL，向AP側加入20 mg/mL、pH7不同分子量的HFRP溶液0.5 mL，1.5 h后收集BL側溶液進行質譜鑒定。通過將BL側多肽排除空白(模擬腸液)，得到寡肽群1(OP1，Oligo－Peptides1)。通過將寡肽群1與 AP側多肽的保留時間和母離子大小對比，來判斷可以完整通過模擬腸壁的多肽，得到寡肽群2(OP2，Oligo－Peptides2)。通過將寡肽群2(OP2，Oligo－Peptides2)與未經模擬腸壁消化的不同分子量的HFRP組分對比，尋找具有相同保留時間和母離子大小的多肽，得到的寡肽群3(OP3，Oligo－Peptides3)，OP3為可完整透過模擬腸壁的HFRP組分，選擇不同分子量的HFRP中具有代表性的譜峰進行研究，數(shù)據分析結果如表3所示。由表3可知，從BL側檢測得到物質的分子量＜500，這一現(xiàn)象與Korhonen等［30］的研究中發(fā)現(xiàn)的通常只有2～6個氨基酸殘基的肽能夠完整通過腸壁，被完整吸收的理論相一致;同時可以發(fā)現(xiàn)，分子量越小的多肽，越容易被完整吸收。同時小腸上皮細胞膜為磷脂雙分子層結構，導致脂溶性和疏水性強的寡肽易于透過細胞層進入機體內環(huán)境［31］。

表3 不同分子量的HFRPBL側透過多肽一級質譜圖表Table 3 First－order mass spectrometry chart of different molecular HFRPthrough BL side

2.6.2 不同電荷性的HFRP BL側透過多肽一級質譜測定結果 向BL側加入p H7.2的HBSS 1.5 mL，向AP側加入20 mg/mL、p H7不同電荷性的HFRP溶液0.5 mL，1.5 h后收集BL側溶液進行質譜鑒定。由此得到寡肽群1(OP1，Oligo－Peptides1)、寡肽群2(OP2，Oligo－Peptides2)和寡肽群 3(OP3，Oligo－Peptides3)。此時得到OP3為可完整透過模擬腸壁的HFRP組分，選擇陽離子組分(CM－FX)和陰離子組分(DE－Fx)具有代表性的譜峰進行研究，數(shù)據分析結果如表4和表5所示。由表4和表5對比可知，溶液中帶有正電荷的多肽比帶有負電荷的多肽更容易透過模擬腸壁，并且正電荷性越強，其透過趨勢越明顯。Shimizu等［30］的研究中發(fā)現(xiàn)的帶有正電荷的物質多數(shù)能夠通過親水的旁路途徑被轉運吸收，而帶有負電的物質不能通過該路徑，這一現(xiàn)象與此研究相符。

表4 不同電荷性(陽離子)的HFRPBL側透過多肽一級質譜圖表Table 4 First－order mass spectrometry chart of different cations HFRP through BL side

表5 不同電荷性(陰離子)的HFRP BL側透過多肽一級質譜圖表Table 5 First－order mass spectrometry chart of different anions HFRPthrough BL side

2.6.3 不同疏水性的HFRP BL側透過多肽一級質譜測定結果 向BL側加入p H7.2的HBSS 1.5 mL，向AP側加入20 mg/mL、p H7不同疏水性的HFRP溶液0.5 mL，1.5 h后收集BL側溶液進行質譜鑒定。由此得到寡肽群 1(OP1，Oligo－Peptides1)、寡肽群 2(OP2，Oligo－Peptides2)和寡肽群 3(OP3，Oligo－Peptides3)。此時得到OP3為可完整透過模擬腸壁的HFRP組分，選擇各疏水性組分(OC－FX)具有代表性的譜峰進行研究，數(shù)據分析結果如表6所示。由表6可知，三種組分的疏水性強弱依次為OC－F3＞OC－F2＞OC－F1，隨著疏水性的增強，靠近細胞膜更加容易，吸收轉運通過細胞膜的多肽種類也依次增多。有研究［32］表明，某些肽的疏水性與其細胞透過率呈正相關，并且主動運輸途徑需要疏水性較高的肽參加才能完成轉運吸收。

表6 不同疏水性的HFRPBL側透過多肽一級質譜圖表Table 6 First－order mass spectrometry chart of different hydrophobicity HFRP through BL side

2.6.4 不同分子特性的高吸收多肽序列鑒定結果

選擇可以被腸壁完整吸收的不同分子特性多肽的寡肽群3，將其進行二級質譜掃描，根據子離子中出現(xiàn)的特征離子峰手動解譜，解譜結果較為復雜，只能鑒定出4種物質，結果見表7。由表7可知，得到的能夠透過模擬腸壁的寡肽結構均為二肽，證明小分子多肽更容易透過腸壁結構而被完整吸收。經過分析，能夠完整透過腸壁的多肽分別為LA、IP、PL、HQ共4條。

表7 目的離子二級質譜圖表Table 7 Secondary ion mass spectrometry chart of target ions

2.6.5 高吸收組分中耐消化結構鑒定結果 經對比找到HFRP中4條多肽能夠完整通過模擬腸壁而結構不被破壞，將這4條多肽與相對應組分模擬胃腸消化后產物對比，即可驗證這4個組分是否能夠耐受胃腸消化酶的裂解作用，經過對比發(fā)現(xiàn)，組分PL和HQ在胃腸消化液中同樣存在，并且出峰時間和母離子大小相當，子離子碎片相同，表明這兩個二肽可以在2 h胃液消化和2 h腸液消化下穩(wěn)定存在。

3 結論

本實驗選用支鏈氨基酸含量高達23.79%的玉米黃粉為底物，通過堿性蛋白酶和風味蛋白酶復合酶解制備得到HFRP，然后按照分子量、電荷性和疏水性進行分離，進行轉運吸收試驗。結果表明，HFRP中短肽LA、IP、PL和HQ能夠以完整形式被吸收，其中短肽PL和HQ既能耐受住胃液的消化，又能夠被腸壁在不破壞結構的條件下完整吸收。由此推測，從此HFRP中分離鑒定出的短肽PL和HQ具有分子量小、在溶液中帶有正電荷、疏水性程度高的特性，且此特性的短肽具有優(yōu)先吸收和耐胃腸消化的特點，為新型活性肽保健食品的研究開發(fā)提供一定理論依據和技術支持。