孫 佳，王春燕，皮若冰，李 桐，劉 飛，姜瞻梅

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030)

乳清是生產(chǎn)干酪或干酪素的副產(chǎn)物，從乳清中制得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品有乳清濃縮蛋白(WPC)和乳清分離蛋白(WPI)，乳清蛋白因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性被廣泛應(yīng)用在食品工業(yè)中［1］。WPI具有良好的凝膠性，但其凝膠保水性較差，在食品工業(yè)上的應(yīng)用具有一定的局限性。目前，常見(jiàn)的蛋白改性方法主要有物理方法、化學(xué)方法和酶法。比較而言，酶法改性條件溫和，副產(chǎn)物較少。在食品酶改性方面，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶已經(jīng)成功地運(yùn)用到大豆分離蛋白、小麥面筋蛋白等蛋白的改性［2－3］。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase，EC2.3.2.13)是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，它可以催化肽結(jié)合的賴氨酸殘基的ε－氨基和肽結(jié)合的谷氨酰胺殘基的γ－羧酰胺基之間的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，導(dǎo)致形成ε－(γ－谷氨酰胺)賴氨酸共價(jià)鍵［4］。TGase對(duì)蛋白質(zhì)的主要作用有催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，從而改變蛋白質(zhì)的功能特性，如凝膠性、乳化性、起泡性和熱穩(wěn)定性等［5－6］。Wang 等［7］研究表明，含有 TGase 的小麥面筋蛋白凝膠在離心后可以保留住更多的水分，添加TGase可以顯著改善凝膠的保水性。此外，Lorenzen［8］研究表明，在預(yù)熱和 TGase交聯(lián)的加工條件下，復(fù)原脫脂乳和乳清蛋白的功能特性(如表觀粘度、保水性和熱穩(wěn)定性)增加。但是，由于WPI的主要成分α－乳白蛋白(α－La)和 β－乳球蛋白(β－Lg)的剛性球狀結(jié)構(gòu)，TGase交聯(lián)的位點(diǎn)以及空間位阻等原因，WPI不是TGase作用的良好底物，因此需要用物理手段處理WPI，以促進(jìn)TGase的交聯(lián)反應(yīng)。新興的物理改性手段主要有超聲、高壓和微波等方法［9－10］，超聲處理作為一種新興的技術(shù)，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的展開，減少蛋白粒徑，暴露出更多的游離巰基和疏水性基團(tuán)［11］。同時(shí)，通過(guò)超聲處理可以有效暴露酶交聯(lián)反應(yīng)位點(diǎn)，促進(jìn)交聯(lián)程度的提高及增加交聯(lián)產(chǎn)物的產(chǎn)量［12］。

本研究采用超聲波與TGase交聯(lián)相結(jié)合的方法，研究?jī)烧叩穆?lián)合作用對(duì)WPI的分子量分布、粒徑大小、熒光強(qiáng)度和凝膠保水性的影響，建立物理結(jié)合酶技術(shù)，生產(chǎn)具有優(yōu)良凝膠保水性的改性蛋白質(zhì)的工藝過(guò)程，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

WPI(蛋白質(zhì)含量93.5%) 美國(guó)Mullins Whey公司;轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(酶活100 U/g) 江蘇一鳴生物股份有限公司;Marker(14～120 kDa) 上海Novoprotein公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、β－巰基乙醇和8－苯胺－1－萘磺酸(ANS) 美國(guó)Sigma－Aldrich公司;丙三醇 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;濃鹽酸 哈爾濱理工化學(xué)試劑有限公司;溴酚藍(lán) 天津市永大化學(xué)試劑有限公司;其他試劑 均為分析純。

DY－1200Y超聲細(xì)胞破碎儀 中國(guó)上海德陽(yáng)儀邦儀器有限公司;Nano－ZS90激光粒度儀 英國(guó)Malvern公司;1658050Bio－Rad電泳儀 美國(guó) Bio－Rad公司;F4500熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超聲和TGase聯(lián)合處理WPI樣品的制備 將乳清分離蛋白(WPI)12.5 g溶于100 mL去離子水中，室溫下置于磁力攪拌器攪拌2 h使蛋白充分溶解，得到濃度為125 mg/mL的蛋白溶液。將所得WPI溶液用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)整pH為7.0。將溶解好的WPI溶液在400 W(20 kHz)的條件下超聲處理 0、10、20、30、40 min(工作時(shí)間為 2 s，間歇時(shí)間4 s)，樣品溶液超聲過(guò)程中置于冰水浴中，以保證樣品溫度不超過(guò)30℃。分別添加35 U/g的TGase于預(yù)處理好的蛋白溶液中，于50℃水浴鍋中分別反應(yīng)4 h，取出后立即置于75℃水浴鍋中滅酶15 min，于室溫冷卻，將酶反應(yīng)后的蛋白溶液凍干，所得凍干粉于－20℃冰箱中冷凍以備后續(xù)測(cè)定?？瞻捉M是單獨(dú)超聲處理的WPI。

1.2.2 分子量分布 根據(jù)Cura等［13］的方法進(jìn)行了改進(jìn)，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)估算樣品的分子量分布。在實(shí)驗(yàn)中使用4%的濃縮膠與12.6%的分離膠。用去離子水將樣品溶液稀釋至濃度為2.5 mg/mL，取10μL的5×SDS樣品緩沖液(0.6 mL濃度為1 mol/L的Tris－HCl緩沖液(p H6.8)，2.0 mL濃度為100 mg/mL的 SDS溶液，5.0 mL濃度為50%的甘油，1.0 mL濃度為10 mg/mL的溴酚藍(lán)，0.5 mLβ－巰基乙醇，0.9 mL去離子水)加入到40μL的樣品中，混合均勻，進(jìn)行沸水浴處理5 min，冷卻后上樣。用10μL微量進(jìn)樣器吸取蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)行上樣。蛋白質(zhì)條帶通過(guò)考馬斯亮藍(lán)R250染色。

1.2.3 粒徑分布 樣品按質(zhì)量比為1∶50用去離子水稀釋，稀釋至濃度為1 mg/mL，通過(guò)0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾，采用粒度分布儀測(cè)定樣品中粒子大小及其體積分布情況。

1.2.4 熒光光譜掃描 根據(jù)Liu等［14］的方法進(jìn)行了改進(jìn)，通過(guò)熒光分光光度計(jì)對(duì)樣品進(jìn)行固有熒光掃描。樣品用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(p H7.0)稀釋至終濃度為1 mg/mL。掃描的激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為290～420 nm。激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm，掃描速率為240 nm/s。

1.2.5 表面疏水性的測(cè)定 根據(jù)Chandrapala等［15］的方法進(jìn)行了改進(jìn)，以1－苯胺基－8－萘磺酸鹽(ANS)為熒光探針，測(cè)量蛋白的表面疏水性值。用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)為1～5 mg/mL，然后將20μL的 ANS(8 mmol/L在0.01 mol/L p H為7.0的磷酸鹽緩沖液中)加入到4 mL蛋白質(zhì)稀釋液中，并在黑暗中保持15 min，然后進(jìn)行測(cè)量。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)為390、470 nm。激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5 nm。熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度線性回歸的初始斜率為表面疏水性。

1.2.6 凝膠保水性(WHC)的測(cè)定 根據(jù)Yuan等［16］的方法測(cè)定樣品的凝膠保水性。取15 mL反應(yīng)后的蛋白溶液于25 mL燒杯，用保鮮膜封口，之后置于95℃的水浴鍋中加熱30 min，取出后立即放入冰水浴中冷卻30 min，存放在4℃冰箱中過(guò)夜。將上面制備的乳清分離蛋白酶改性凝膠置于離心管中，在8000 r/min條件下離心30 min。離心后倒置排出水分，殘留的水分使用干燥濾紙小心去除。裝有凝膠樣品的離心管在離心前后都進(jìn)行準(zhǔn)確稱量，兩者差值作為釋放的液體重量，WHC計(jì)算如下:

式中，Wt表示樣品中的液體的總質(zhì)量;Wr表示樣品離心后去除液體后的總質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素分析，Duncan多重分析，p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲處理對(duì)TGase交聯(lián)WPI產(chǎn)物分子量分布的影響

在還原條件下，通過(guò)SDS－PAGE研究超聲處理對(duì)WPI的TGase催化的交聯(lián)反應(yīng)的影響。由圖1泳道1～5可以看出，超聲處理對(duì)WPI的分子量分布并沒(méi)有明顯的影響;泳道6～10加入TGase后，在分子量為120 kDa處有新的條帶生成，并且WPI的主要成分 α－乳白蛋白(α－La)和 β－乳球蛋白(β－Lg)的含量較未加TGase組相比明顯減少，證明加入TGase后有新的大分子聚合物生成。同時(shí)，由圖1泳道6～10可以看出，隨著超聲處理時(shí)間從0 min增加至40 min，分子量為120 k Da附近的條帶顏色逐漸加深。且在超聲30 min(條帶9)和超聲40 min(條帶10)后TGase交聯(lián)的WPI，由于聚合物相對(duì)分子量的增加，交聯(lián)后產(chǎn)物的溶解度降低，生成了少量不溶性的大分子聚合物，以至于不能很好進(jìn)入濃縮膠界面(即圖中泳道6～10頂端黑色條帶)。證明超聲處理能夠更好地促進(jìn)TGase交聯(lián)，且隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，生成的大分子聚合物的量逐漸增多。這可能是超聲的空化效應(yīng)作用于蛋白質(zhì)分子，使蛋白質(zhì)分子的粒度減小(由圖2A可以看出)，能夠暴露出更多的反應(yīng)位點(diǎn)，更有利于 TGase交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行［17－18］。

圖1 超聲處理后的TGase交聯(lián)WPI產(chǎn)物的SDS－PAGEFig.1 SDS－PAGE of the TGase－catalyzed cross－linking of WPI products with the ultrasound pretreatment注:條帶M為Marker;泳道1～5分別是WPI超聲處理0、10、20、30、40 min;泳道6～10 分別是 WPI超聲處理0、10、20、30、40 min 后進(jìn)行 TGase 交聯(lián)。

2.2 超聲處理對(duì)TGase交聯(lián)WPI產(chǎn)物粒徑分布的影響

將WPI溶液超聲處理后再進(jìn)行TGase交聯(lián)，得到的樣品溶液稀釋一定的倍數(shù)后，測(cè)定其粒徑體積分布情況。由圖2(A)可以看出，超聲處理會(huì)導(dǎo)致WPI分子的粒徑減小，并且隨著超聲處理時(shí)間延長(zhǎng)至40 min，WPI的粒徑達(dá)到最小。這可能是因?yàn)?，超聲處理的空化效?yīng)產(chǎn)生的微流束作用、高剪切力、湍流和渦旋等作用，減弱了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，從而降低了蛋白質(zhì)分子的聚集程度［19－20］。由圖2(B)可以看出，TGase交聯(lián)后WPI的粒徑均呈增大的趨勢(shì)，并且超聲處理后TGase交聯(lián)的WPI的粒徑明顯高于未經(jīng)超聲處理的蛋白的粒徑。這是因?yàn)?，TGase交聯(lián)后生成了大分子聚合物，并且隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，生成的大分子聚合物的量逐漸增多，從而證明超聲處理能夠暴露出TGase作用的反應(yīng)位點(diǎn)，更有利于交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行，從而生成粒徑較大的交聯(lián)產(chǎn)物。

圖2 超聲處理對(duì)TGase交聯(lián)WPI產(chǎn)物的粒徑分布的影響Fig.2 Effect of ultrasound pretreatment on partical size distribution of TGase－catalyzed WPI cross－linking product注:A是超聲處理WPI的粒徑分布圖;B是WPI超聲處理后TGase交聯(lián)的粒徑分布圖。

2.3 超聲處理對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)乳清分離蛋白產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的影響

將WPI溶液超聲處理后再進(jìn)行TGase交聯(lián)，得到的樣品溶液稀釋一定的倍數(shù)后，測(cè)定其熒光強(qiáng)度和表面疏水性的變化情況。對(duì)反應(yīng)前后的樣品進(jìn)行熒光掃描，通過(guò)疏水性氨基酸的發(fā)射峰強(qiáng)度(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)來(lái)判斷蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況。由圖3可以看出，隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)(0～40 min)，TGase催化交聯(lián)的WPI和未經(jīng)TGase催化交聯(lián)的WPI的熒光強(qiáng)度均呈增加的趨勢(shì)，在超聲時(shí)間為40 min時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。同時(shí)，由圖4可以看出，隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，未經(jīng)TGase交聯(lián)的 WPI的表面疏水性逐漸增加，超聲處理10、20 min的疏水性差異不顯著(p＞0.05);加入TGase后表面疏水性顯著增加(p＜0.05)，并且表面疏水性隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，但在超聲處理10、20和30 min時(shí)差異不顯著(p＞0.05)。這可能是因?yàn)椋曁幚砟軌驈牡鞍踪|(zhì)分子內(nèi)部暴露出更多的疏水性氨基酸殘基，主要是色氨酸殘基(蛋白質(zhì)分子中發(fā)生了從酪氨酸殘基到色氨酸殘基之間的能量轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致酪氨酸殘基的熒光猝滅和色氨酸殘基的熒光增強(qiáng)［21］)。同時(shí)由于超聲處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子一定程度的展開，從而導(dǎo)致更多的疏水基團(tuán)和分子內(nèi)部區(qū)域暴露于極性更強(qiáng)的環(huán)境中，蛋白質(zhì)分子的表面疏水性增強(qiáng)［22］。此外，TGase催化交聯(lián)的WPI的熒光強(qiáng)度明顯高于未經(jīng)TGase催化的乳清分離蛋白，且加TGase后熒光峰發(fā)生了紅移(由338 nm移到342 nm)，這可能是因?yàn)?，TGase交聯(lián)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的伸展，芳香族氨基酸的極性環(huán)境增大，從而導(dǎo)致更多的疏水性氨基酸的暴露和表面疏水性的增加［23］。

圖3 超聲處理對(duì)TGase交聯(lián)WPI產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of ultrasound pretreatment on fluorescence intensity of TGase－catalyzed WPI cross－linking product

圖4 超聲處理對(duì)TGase交聯(lián)WPI產(chǎn)物的表面疏水性的影響Fig.4 Effect of ultrasound pretreatment on surface hydrophobicity of TGase－catalyzed WPI cross－linking product

2.4 超聲處理與TGase交聯(lián)對(duì)WPI產(chǎn)物凝膠保水性的影響

將WPI溶液超聲處理后再進(jìn)行TGase交聯(lián)，得到的樣品溶液在加熱條件下形成凝膠，測(cè)定其凝膠保水性。由圖5可以看出，隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，TGase催化交聯(lián)的WPI和未經(jīng)TGase催化交聯(lián)的WPI的凝膠保水性均呈一定程度的增加。未經(jīng)TGase催化交聯(lián)的WPI的凝膠保水性在超聲處理20、30和40 min時(shí)沒(méi)有顯著差異(p＞0.05)，但與超聲0 min的樣品相比，超聲處理20、30、40 min均能顯著增加蛋白的凝膠保水性(p＜0.05)。加入TGase后，TGase催化交聯(lián)的WPI的凝膠保水性顯著增加(p＜0.05)，且超聲處理40 min后，交聯(lián)的WPI的凝膠保水性較超聲處理后未經(jīng)TGase催化交聯(lián)的WPI提高了約39.66%。超聲處理40 min后，TGase交聯(lián)產(chǎn)物凝膠保水性的增加可能是因?yàn)椋宦?lián)反應(yīng)的進(jìn)行使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露出了疏水性基團(tuán)，且WPI經(jīng)超聲預(yù)處理后暴露出的疏水性基團(tuán)的量更多(圖4)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間非共價(jià)作用得到了增強(qiáng)，從而形成了更為致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)具有更小的孔隙，可以集合更多的水，且能夠更緊密結(jié)合，進(jìn)而增加了凝膠的保水性［24－26］。

圖5 超聲處理對(duì)TGase交聯(lián)WPI產(chǎn)物的凝膠持水性(WHC)的影響Fig.5 Effect of ultrasound pretreatment on gel water holding capacity of TGase－catalyzed WPI cross－linking product

3 結(jié)論

WPI經(jīng)超聲預(yù)處理后，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)(0～40 min)，TGase交聯(lián)程度逐漸變大，生成的大分子聚合物逐漸增多;TGase催化交聯(lián)的WPI產(chǎn)物具有較好的凝膠保水性，并且隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，凝膠保水性逐漸提高，在超聲30、40 min時(shí)，交聯(lián)產(chǎn)物的凝膠保水性最高;WPI在超聲處理后TGase酶交聯(lián)能夠使熒光強(qiáng)度增加，暴露出更多的疏水性基團(tuán)，表面疏水性增大，且隨著超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表面疏水性逐漸升高，在超聲時(shí)間為40 min時(shí)，產(chǎn)物的表面疏水性最高，暴露出的疏水性氨基酸的量最大，更有利于形成均勻、致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)，提高WPI的凝膠保水性。