李 倩，夏杏洲，周 偉 ，廖良坤，李積華，彭芍丹，郭長青

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088;2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東湛江524001;3.農(nóng)業(yè)部熱帶作物產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東湛江524001;4.河南金辣木生物科技有限公司，河南鶴壁458000)

辣木(Moringa oleifera)是一種具有獨特經(jīng)濟價值的熱帶植物，含有豐富的蛋白質(zhì)，維生素，礦物質(zhì)［1］等。辣木也含有多種天然抗氧化物質(zhì)，如類胡蘿卜素，酚類、黃酮類、植物甾醇、苷類、多糖等［2－4］，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗癌、降血脂、降血壓等生物學功能［5－6］。

乳酸菌是一種能將糖類轉(zhuǎn)化為乳酸的益生菌，被廣泛的應用于發(fā)酵食品的行業(yè)。乳酸菌發(fā)酵能產(chǎn)生獨特的風味。例如趙福利等［7］利用植物乳桿菌發(fā)酵燕麥，得到一款風味獨特、感官評價高的發(fā)酵燕麥型飲料。乳酸菌發(fā)酵制品還具有許多益生功能，如抗氧化活性、抑菌活性、抗血栓、抗高血壓，降低膽固醇等功能。劉海燕［8］研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的豆粕抗氧化能力比未發(fā)酵的有顯著提高(p＜0.05)。Upadhyay等［9］選取5株乳酸菌進行單增李斯特菌對腸細胞的粘附和侵襲的試驗，結(jié)果顯示5株乳酸菌均有抗菌效果。因此，選用乳酸菌作為發(fā)酵劑，不僅天然、安全，還能開發(fā)出具有更高生物活性的產(chǎn)品。目前辣木主要應用在保健食品及藥品，禽畜飼料，水質(zhì)凈化，日化用品上［10－11］。目前研究辣木發(fā)酵物功能活性國內(nèi)外已有報道。Joung等［12］報道，發(fā)酵辣木提取物能降低高脂飲食誘導的肥胖小鼠的肝臟肥胖和改善葡萄糖耐受量。劉佩佩等［13］研究了辣木發(fā)酵物對大鼠生長發(fā)育，骨骼代謝的影響。但對辣木發(fā)酵物的活性物質(zhì)和抗氧化能力的研究未見報道。

本研究對乳酸菌發(fā)酵辣木葉提取液過程中pH，固形物含量，總酸等基本理化性質(zhì)進行檢測，分析了發(fā)酵過程中還原糖、黃酮、多酚、有機酸等營養(yǎng)成分的變化，研究了乳酸菌發(fā)酵對辣木DPPH清除能力，羥自由基清除能力，超氧陰離子清除能力的影響，為辣木發(fā)酵制品的研發(fā)提供了技術(shù)指導，同時也拓展了辣木精深加工產(chǎn)業(yè)的領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣木葉 由河南金辣木生物科技有限公司提供;植物乳桿菌S35 購于中國工業(yè)微生物菌株保藏管理中心;MRS營養(yǎng)肉湯、MRS培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、碳酸鈉、無水乙醇、酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉 廣東光華科技股份有限公司;草酸(純度≥99.0%)、檸檬酸(純度≥99.5%)、琥珀酸(純度≥99.5%)、丙酮酸(純度≥99.0%)，乳酸(純度≥91.2)、乙酸(純度≥99.9%)、沒食子酸(純度≥99.9%)、葡萄糖(純度≥99.5%)、蘆丁(純度≥99.5%)、福林酚 美國Sigma公司;酚酞、磷酸、DPPH(純度≥97.0%)、3，5 二硝基水楊酸、苯酚 美國阿拉丁工業(yè)公司;羥自由基測定試劑盒、抗超氧陰離子自由基測試盒 南京建成生物有限公司。

萬能高速粉碎機 上海菲力博食品有限公司;HG－50全自動高壓蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama公司;ZHJH－C1115B超凈工作臺 上海智城分析儀器制造公司;Atago PAL－3糖度計 日本Atago公司;梅特勒FE20－FiveEasy PlusTMp H計 美國Mettler Toledo公司;UV－1780型紫外可見分光光度計 日本Shimadzu公司;3－30K型低溫高速離心機 德國Sigma公司;LC－20A高效液相色譜 日本島津公司;Benson有機酸分離色譜BP－OA Waters中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 辣木速溶粉制備工藝:干燥辣木葉→揀選→粉碎→過篩→加水→蒸煮→濃縮→過濾→辣木葉提取液→真空干燥

選取無斑點、無蟲蛀的辣木葉，經(jīng)過粉碎機粉碎5 min后過80目篩，然后以辣木粉∶水為1∶15(質(zhì)量比)進行蒸煮提取，提取1 h，再將辣木汁過濾，取上清液得到辣木葉提取液，濃縮液在60℃下真空干燥24 h后得到辣木葉速溶粉。

1.2.2 辣木葉提取液的制備 稱取干燥好的辣木葉速溶粉∶蒸餾水=1∶25(質(zhì)量比)制成辣木葉提取液，于121℃下滅菌15 min。在超凈工作臺中接入1%的植物乳桿菌S35，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)培養(yǎng)72 h。分別在接種后 0、8、16、24、32、40、48、56、64、72 h定時無菌操作取出50 mL，以10000 r/min，15℃條件下離心15 min，取上清液，于4℃冰箱備用。

1.2.3 基本理化性質(zhì) 檢測辣木葉提取液發(fā)酵過程中p H、總酸、可溶性固形物含量的變化，利用p H計來測定辣木液發(fā)酵過程中的pH。利用糖度計來測定發(fā)酵期間的可溶性固形物含量?？偹岬臏y定按照GB/T 12456－2008《食品安全國家標準食品中總酸的測定》［14］。

1.2.4 營養(yǎng)成分

1.2.4.1 還原糖測定 采用DNS試劑法［15］測定樣品中的還原糖。標準曲線的制作:精密稱取預先干燥至恒重的葡萄糖0.1 g，用雙蒸水定容至100 mL，得到1 mg/mL的葡萄糖母液，再進一步梯度稀釋成0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05 mg/mL 的標準品工作液。取2 mL不同濃度的標準溶液加入25 mL的具塞試管中，再加入2 mL的DNS試劑搖勻，置沸水浴中加熱煮沸7 min，取出流水冷卻，用雙蒸水定容至25 mL，于540 nm波長下檢測，記錄吸光度。以葡萄糖的含量來測定樣品中還原糖含量，按照標準曲線線性方程y=0.9488x－0.0434(R2=0.9954)來測定還原糖的含量，其中 x為樣品質(zhì)量濃度(mg/mL)，Y為吸光度。

樣品的測定:精密的吸取辣木葉提取液2 mL，按照上述的方法進行操作并測定吸光度，每個實驗重復三次。

1.2.4.2 總黃酮的測定 標準曲線的制作:精密稱取預先干燥至恒重的蘆丁10 mg，加甲醇定容至100 mL，得到100 mg/L的蘆丁母液，再進一步梯度稀釋成60、48、36、24、12 mg/L 的標準品工作液。取0.5 mL不同濃度的工作液于10 mL的容量瓶中，加入少量的雙蒸水，先加入0.5 mL濃度為5 g/100 mL的NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min，再加入0.5 mL濃度為0.1 g/mL Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min后，加入4 mL濃度為4 g/100 mL的NaOH溶液，然后用蒸餾水定容至10 mL，于510 nm處檢測［16］。以蘆丁標準品計算總黃酮含量，按照標準曲線線性方程y=0.0077x+0.0549(R2=0.999)來測定黃酮含量，其中x為樣品質(zhì)量濃度(mg/L)，Y為吸光度。

樣品的測定:精密的吸取辣木葉提取液0.5 mL，按照上述的方法進行操作并測定吸光度，每個實驗重復三次。

1.2.4.3 多酚的測定 采用福林酚法［17］測定多酚含量。標準曲線的制作:精密稱取預先干燥至恒重的沒食子酸 2 mg，加雙蒸水定容至 100 mL，得到20 mg/L的沒食子酸母液，再進一步梯度稀釋成6.0、4.0、3.2、2.4、1.6、0.8 mg/L 的標準品工作液。取 1 mL不同溶度的標準溶液于25 mL容量瓶中加入10 mL 10%的福林酚。再加入8 mL的7%NaCO3溶液，放置1 h，在765 nm處測吸光值。以沒食子酸標準品計算總多酚含量，按照標準曲線線性方程y=0.0988x－0.0099(R2=0.9992)來測定總酚含量，其中x為樣品質(zhì)量濃度(mg/L)，Y為吸光度。

樣品的測定:精密的吸取辣木葉提取液1 mL，按照上述的方法進行操作并測定吸光度，每個實驗重復三次。

1.2.4.4 有機酸的測定 采用HPLC法并參照馬麗娜等［18］測定方法略作修改，色譜條件:流動相為0.8%的磷酸水溶液，等梯度洗脫，流速0.5 mL/min，紫外檢測器，檢測波長210 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL，柱子:BP－OA 2000－0(300 mm ×7.8 mm)。

標準溶液的制備:準確的稱取10.0 mg草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酮酸、琥珀酸，加入超純水定容到10 mL，得到1 mg/mL的有機酸母液，再進一步梯度 稀 釋 成，0.8 mg/mL，0.6 mg/mL，0.4 mg/mL，0.2 mg/mL;樣品的測定:吸取辣木葉提取液5 mL，10000 r/min離心15 min，取1 mL上清液，并用流動相稀釋3倍，過0.22μm尼龍膜過濾，上機分析。

1.2.5 體外抗氧化活力

1.2.5.1 DPPH清除能力 參照岳秀潔［19］的方法并加以改進，將19.72 mg的DPPH溶于250 mL無水乙醇中，配制成DPPH工作液，將1 mL樣品加入2 mL進行反應，于517 nm處測定，吸光值為A1，以無水乙醇代替DPPH加入樣品中，扣除樣品溶液的本底吸收，吸光值為A2。用相同體積的蒸餾水代替樣品作為對照組，吸光值為A0，DPPH清除率計算公式如下:

清除率(%)=［1－(A1－A2)/A0］×100

1.2.5.2 羥自由基清除能力 將發(fā)酵過程中各個階段的辣木葉提取液在10000 r/min，15℃條件下離心15 min，合并上清液，并用超純水稀釋80倍后得到待測樣品，采用羥自由基測定試劑盒測定羥自由基清除率。

1.2.5.3 超氧陰離子清除能力 將發(fā)酵過程中各個階段的辣木葉提取液在10000 r/min，15℃條件下離心15 min，合并上清液，并用超純水稀釋10倍后得到待測樣品，采用抗超氧陰離子自由基測試盒測定超氧陰離子清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復三次取平均值，實驗結(jié)果以平均值±標準差表示，實驗數(shù)據(jù)采用Origin 8軟件進行數(shù)據(jù)分析作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 辣木葉提取液發(fā)酵特性動態(tài)研究

pH和總酸是乳酸菌發(fā)酵的重要參數(shù)，同時直接影響著微生物的生長和代謝過程［20］。從圖1可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，pH和可溶性固形物含量整體呈下降的趨勢，總酸呈現(xiàn)整體上升的趨勢。p H在0～24 h下降幅度較大，由5.8降至4.2，24 h之后下降幅度減小，最終p H為3.7?？偹嵩诎l(fā)酵過程中呈上升趨勢，在發(fā)酵時間為0～32 h之間上升較快，從3.17 g/L上升至5.88 g/L?？扇苄怨绦挝锖繌?.5%下降至3.6%。在發(fā)酵時間0～32 h，由于底物充足，乳酸菌利用碳源和氮源快速繁殖，并在生長的過程中產(chǎn)生各種有機酸，尤其是乳酸，使得pH迅速下降，總酸不斷上升，可溶性固形物含量減少。32 h之后，隨著發(fā)酵時間的增加，總酸的不斷累積以及底物的消耗，使得這種酸性環(huán)境不適宜乳酸菌的大量生長，發(fā)酵速度減慢，發(fā)酵液的可溶性固形物含量和p H下降幅度逐漸減緩，總酸緩慢增加［21］。

圖1 發(fā)酵時間對辣木葉提取液pH、可溶性固形物、總酸的影響Fig.1 Effect of fermentation time on pH，soluble solids and total acid of Moringa oleifera leaf extract

2.2 發(fā)酵對辣木葉提取液營養(yǎng)成分的影響

2.2.1 發(fā)酵過程中還原糖含量的變化 如圖2所示，在辣木葉提取液的發(fā)酵過程中，還原糖的含量呈下降的趨勢，在0～16 h，乳酸菌生長迅速，大量消耗還原糖，尤其是葡萄糖;在16～32 h，由于菌種達到穩(wěn)定期，消耗速率減慢。而在32～40 h還原糖出現(xiàn)短暫的上升趨勢，這與丁艷如等［22］在對紅茶發(fā)酵過程中還原糖的含量變化相似。在發(fā)酵40 h之后，還原糖又開始下降，這是可能是由于還原糖的大量減少，使得乳酸菌將辣木葉提取液中的多糖轉(zhuǎn)化為還原糖供其生長［23］。

圖2 發(fā)酵時間對辣木葉提取液還原糖含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on reducing sugar content of Moringa oleifera leaf extract

2.2.2 發(fā)酵過程中黃酮含量的變化 由圖3可知，辣木葉提取液中黃酮含量整體隨發(fā)酵時間的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在整個發(fā)酵過程中，黃酮均高于未發(fā)酵的辣木葉提取液，其含量在發(fā)酵24 h達到最高，此時含量為 223.11 mg/L，相比未發(fā)酵的提高了45%，這是由于發(fā)酵過程生成黃酮糖苷類物質(zhì)。隨著發(fā)酵時間的延長，黃酮含量開始迅速下降，最終黃酮含量下降至170 mg/L，這是由于乳酸菌分泌了β－葡萄糖苷酶、β－葡萄糖醛酸苷酶、葡萄糖碳苷酶等多種糖苷酶，使得黃酮糖苷物分解為苷元，導致黃酮含量急劇下降［24］。在發(fā)酵48～72 h后黃酮含量下降趨勢變緩，可能是有機酸的大量積累，pH降低，導致發(fā)酵液中分解黃酮的酶類活力降低。

圖3 發(fā)酵時間對辣木葉提取液黃酮含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on flavonoid content of Moringa oleifera leaf extract

2.2.3 發(fā)酵過程中多酚含量的變化 微生物發(fā)酵是生產(chǎn)抗氧化酚類化合物的重要途徑［25］。如圖4所示，在整個發(fā)酵過程中，辣木葉提取液的多酚含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，多酚含量均高于未發(fā)酵的辣木葉提取液，其含量在發(fā)酵32 h達到最高，為100.60 mg/L，比未發(fā)酵的提高了21%，這由于微生物的生長繁殖過程代謝產(chǎn)生了多酚類物質(zhì)。在發(fā)酵32～48 h，可能是乳酸菌代謝中會產(chǎn)生分解多酚的酶類如多酚氧化酶，這些酶類將多酚分解成更小的物質(zhì)，而引起多酚濃度降低。在48～72 h，多酚含量趨于平穩(wěn)，這是由于發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物尤其是有機酸的累積，使得環(huán)境中分解多酚酶催化能力減弱。此結(jié)論與李雪等［26］關(guān)于仙人掌果酒發(fā)酵過程中總酚變化的結(jié)論一致。

圖4 發(fā)酵時間對辣木葉提取液多酚含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on polyphenol content in Moringa oleifera leaf extract

2.2.4 發(fā)酵時間對辣木葉提取液有機酸的影響 從表1可知，草酸在整個發(fā)酵過程中呈現(xiàn)波動性變化，經(jīng)發(fā)酵的草酸濃度均高于未發(fā)酵的辣木提取液。檸檬酸在發(fā)酵過程中先上升后下降，在8 h達到最高，這可能是乳酸菌將丙酮酸代謝成檸檬酸的速度大于檸檬酸進入三羧酸循環(huán)的速度。在發(fā)酵32 h，檸檬酸已代謝消失，這是由于檸檬酸經(jīng)檸檬酸脫氫酶代謝為乙酸、2，3－丁二酮等物質(zhì)。丙酮酸在發(fā)酵過程中先下降后趨于平穩(wěn)，在發(fā)酵0～24 h期間急劇下降，在這段期間乳酸菌產(chǎn)生乳酸脫氫酶，直接將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸［27］。琥珀酸是未發(fā)酵辣木葉提取液中主要的有機酸，初始含量達410.65 mg/L。在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)下降的趨勢，經(jīng)發(fā)酵32 h，琥珀酸已代謝消失，這可能是琥珀酸在三羧酸循環(huán)經(jīng)琥珀酸脫氫酶形成延胡索酸并產(chǎn)生能量供乳酸菌生長［28］。從表1可知，在經(jīng)過發(fā)酵16 h之后，乳酸變成辣木葉提取液中含量最多的有機酸，當發(fā)酵40 h時，乳酸含量達到最大值，為135.43 mg/L，這是由于乳酸菌在生長繁殖的過程中，葡萄糖經(jīng)糖酵解成為丙酮酸，后者被乳酸脫氫酶還原為乳酸，導致乳酸不斷增加［29］。乳酸是由乳酸菌發(fā)酵所產(chǎn)生的，不僅可以改善辣木葉提取液的風味，而且也是發(fā)酵制品中重要的風味物質(zhì)。

表1 發(fā)酵時間對辣木葉提取液有機酸的影響Table 1 Effects of fermentation time on organic acids in Moringa oleifera leaf extract

2.3 發(fā)酵對辣木葉提取液抗氧化活力的影響

2.3.1 發(fā)酵對辣木葉提取液DPPH清除能力的影響 DPPH是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，常用于抗氧化成分的體外活性評價。如圖5所示，整個發(fā)酵過程，DPPH清除能力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，經(jīng)發(fā)酵的辣木葉提取液DPPH抗氧化能力均高于未發(fā)酵的。發(fā)酵32 h，DPPH清除能力達到最高，清除率為89%，比未發(fā)酵的提高了16%，這與發(fā)酵中產(chǎn)生的酚類物質(zhì)有關(guān)。酚類物質(zhì)能很容易地給出1個氫離子，并通過共振雜化而穩(wěn)定，這是具有高自由基清除能力的主要原因［28］。隨著發(fā)酵的繼續(xù)，DPPH清除能力開始下降，最終降至79%左右，可能是黃酮類物質(zhì)的不穩(wěn)定性和發(fā)酵過程中產(chǎn)生了分解酚類物質(zhì)的酶，導致 DPPH 清除率下降［30］。

圖5 發(fā)酵時間對辣木葉提取液DPPH清除能力的影響Fig.5 Effects of fermentation time on the DPPH scavenging ability of Moringa oleifera leaf extract

2.3.2 發(fā)酵對辣木葉提取液羥自由基清除能力的影響 羥自由基系活性氧的一種，具有極高的氧化能力，可以殺死紅細胞、降解DNA、破壞細胞膜和多糖化合物。由圖6可知，在整個發(fā)酵的過程，羥自由基清除能力為先上升后下降的趨勢，且發(fā)酵過后的羥自由基清除能力均高于未發(fā)酵辣木葉提取液。在發(fā)酵時間8 h，羥自由基清除率達到最高，清除率為64%，相比于未發(fā)酵時提高了27%。在8～48 h，清除率開始呈現(xiàn)波動式下降。最終，在48 h之后趨于平穩(wěn)，清除率最終為43%左右。這與束文秀等［31］研究發(fā)酵時間對胡柚汁的羥自由基清除率的整體變化一致。羥自由基的清除能力與總酚有一定的關(guān)系，清除率隨總酚含量而增加，但也與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的的抗氧化酶類能清除自由基有關(guān)，如SOD酶。由于抗氧化活性取決于清除自由基化合物的結(jié)構(gòu)，羥自由基清除率的下降，可能是在微生物的發(fā)酵過程中活性強的物質(zhì)被結(jié)構(gòu)修飾成活性低的物質(zhì)［32］。由于整個抗氧化體系太過復雜，不能確定是被簡單的某一個因素所影響。

圖6 發(fā)酵時間對辣木葉提取液羥自由基清除能力的影響Fig.6 Effect of fermentation time on hydroxyl radical scavenging ability of Moringa oleifera leaf extract

2.3.3 發(fā)酵對辣木葉提取液超氧陰離子清除能力的影響 發(fā)酵時間對辣木葉提取液超氧陰離子清除能力的影響如圖7所示。在整個發(fā)酵過程中，發(fā)酵后的辣木葉提取液的超氧陰離子清除能力均高于未發(fā)酵的，在發(fā)酵32 h，達到最高，清除率為60%，比未發(fā)酵的清除率提高了19%，這是由于發(fā)酵過程中乳酸菌產(chǎn)生了多酚，強化了辣木葉提取液的超氧陰離子清除能力。由于在32～72 h時多酚開始被乳酸菌分解成更小的物質(zhì)，超氧陰離子清除能力呈現(xiàn)波動下降，最終停留在53%左右。張曉松等［33］研究也發(fā)現(xiàn)，總酚與清除超氧陰離子能力有明顯的量效關(guān)系。在整個發(fā)酵過程中，超氧陰離子清除能力都高于未發(fā)酵條件下，說明乳酸菌發(fā)酵能提高辣木葉提取液的抗氧化活力。

圖7 發(fā)酵時間對辣木葉提取液超氧陰離子清除能力的影響Fig.7 Effects of fermentation time on the scavenging ability of superoxide anion in Moringa oleifera leaf extract

3 結(jié)論

辣木葉在發(fā)酵過程中，p H和可溶性固形物有不同程度的下降，總酸呈現(xiàn)上升的趨勢。還原糖整體呈現(xiàn)下降的趨勢。檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸、乙酸隨著發(fā)酵時間的延長整體呈下降趨勢，乳酸則整體上升。在整個發(fā)酵過程中，黃酮和多酚的含量均高于未發(fā)酵的辣木葉提取液，其含量分別在發(fā)酵24 h和32 h達到最高，相比未發(fā)酵的提高了45%和21%，結(jié)果顯示這種乳酸菌發(fā)酵辣木有利于黃酮和多酚的積累。DPPH清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子清除能力都是先上升后下降的趨勢。在發(fā)酵32 h時，DPPH清除能力、超氧陰離子清除能力達到最高，清除率分別為89%和60%。在發(fā)酵8 h時，羥自由基清除能力達到最大值，清除率為54%，說明乳酸菌發(fā)酵能提高辣木葉提取液的抗氧化能力。綜上，辣木葉經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，黃酮和多酚含量，以及其抗氧化能力均有所提高。