李卓瓦，袁曉蕓，趙鑫磊，王曉真，張 倩，尹志成

(1.棗莊學院食品科學與制藥工程學院，山東棗莊277160;2.山東大學藥學院，山東濟南250012)

石榴(Punica granatum L.)為石榴科石榴屬木本植物，原產(chǎn)于地中海至亞洲西部，現(xiàn)在我國南北各省均有栽培，是一種常見的果樹［1］。商業(yè)化的石榴盆景是魯南地區(qū)石榴資源開發(fā)的特色產(chǎn)業(yè)和支撐產(chǎn)業(yè)，自然淘汰的老根外皮只有極少部分作為中藥材“石榴根皮”被利用，絕大多數(shù)石榴根皮資源被浪費。石榴根皮具有收斂止瀉、殺蟲之功效，用于治療腸炎、痢疾、絳蟲等疾?。?］。近年來，大量研究證明植物多酚類成分廣泛存在于石榴植物體的多個部位，而且普遍具有較好的生物活性。例如，鄧娜等［3］研究發(fā)現(xiàn)，石榴皮、石榴籽和石榴瓤中都含有多酚類成分，且均具有較好的抗氧化活性。劉振平等［4］研究證實，石榴葉和石榴汁中沒食子酸、石榴皮鞣素及鞣花酸等多酚類成分含量較高，具有良好的開發(fā)價值。國外已經(jīng)有文獻報道石榴根皮中存在多酚類成分［5］，但是，對其提取工藝及其抗氧化領(lǐng)域的研究，還未見文獻報道。

超聲波輔助提取原料組成成分，是一種物理破碎過程，主要利用超聲波空化效應(yīng)增大物質(zhì)分子運動頻率和速率，增加溶劑穿透力，促進功效成分的溶出。有研究證實［6－7］，超聲波輔助提取植物材料中多酚類成分，具有條件溫和、環(huán)境友好、可操作性強等諸多優(yōu)點，同時，有效避免了活性成分被氧化而使功效喪失，提取效率高。

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化石榴根皮中多酚類成分的提取工藝，并通過測定石榴根皮多酚清除DPPH自由基及ABTS能力，分析其抗氧化活性。為石榴根皮多酚的工業(yè)化生產(chǎn)，促進石榴資源的充分開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴 采自山東嶧城“萬畝石榴園”核心產(chǎn)區(qū)，經(jīng)棗莊學院閆志佩教授鑒定為正品石榴，手工剝?nèi)∈窀?，洗凈、干燥后粉碎到?guī)定粒度，備用;沒食子酸對照品(純度＞99%，批號:110831－201204) 由中國食品藥品檢定研究院提供;DPPH、ABTS 美國Sigma公司;AB－8大孔吸附樹脂 天津波鴻樹脂科技有限公司;福林酚、無水乙醇、碳酸鈉、過硫酸鈉、抗壞血酸 天津大茂化學試劑廠;蒸餾水 棗莊學院生物學省級實驗教學示范中心提供。

HN－CQY型低溫超聲波萃取儀 上海汗諾儀器有限公司;759型紫外－可見分光光度計 上海奧普勒儀器有限公司;AL204型電子分析天平 瑞士梅特勒公司;FW135型多功能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司;RE－2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;HH－6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;RV5型真空泵 英國Edwards公司;標準檢驗篩 浙江上虞華美儀器紗篩廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚提取及純化工藝 準確稱取粉碎至一定粒度的石榴根皮粉末5.0 g，置于250 mL干燥錐形瓶中，加入一定體積分數(shù)的乙醇至一定的料液比例，用保鮮膜封住瓶口。在一定溫度下，按照一定的超聲功率超聲提取一定的時間。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，將濾液濃縮至30 mL，定容至100 mL。取定容后濾液20 mL，用AB－8大孔吸附樹脂80 g(濕重)靜態(tài)吸附，50%乙醇250 mL洗脫，用0.45μm微孔濾膜過濾，減壓蒸干后得到石榴根皮多酚固形物，稱重，備用［8］。

1.2.2 標準曲線的制定 參照文獻［9－10］方法，略有改動。精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對照品25 mg，用無水乙醇定容至25 mL，即得濃度為1 mg/mL的沒食子酸對照品溶液。精密量取沒食子酸對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，依次加入福林酚試劑、Na2CO3試劑后，搖勻并定容至25 mL，于25℃下避光反應(yīng)2 h，在760 nm波長下測定吸光度(A值)，得回歸方程A=0.015C－0.0012(r=0.9996)，濃度在0～48μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3 樣品中多酚的含量測定 準確稱取精制后的石榴根皮多酚1.0 mg，用蒸餾水定容至100 mL，作為樣品溶液，用于含量測定。準確量取1 mL于25 mL具塞比色管中，按照“1.2.2”項下試驗方法測定A值，計算樣品中多酚得率及純度。

1.2.4 單因素試驗設(shè)計 超聲波輔助提取石榴根皮多酚工藝中，主要影響因素有6個，分別為藥材粒度、乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲功率、超聲溫度和超聲時間。通過單因素試驗，考察藥材粒度(10、20、30、40、50、60、70 目)、乙醇體積分數(shù)(0、15%、30%、45%、60%、75%、90%)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35(g/mL))、超聲功率(100、200、300、400、500、600、700 W)、超聲溫度(25、35、45、55、65、75、85 ℃)和超聲時間(5、15、25、35、45、55、65 min)對石榴根皮多酚得率的影響，每個水平重復3次取平均值計算分析。試驗過程中的不變水平值為:藥材粒度40目、乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶20 g/mL、超聲功率400 W、超聲溫度55℃和超聲時間35 min。

1.2.5 篩選試驗設(shè)計－PB設(shè)計 藥材粒度、乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲功率、超聲溫度和超聲時間，依次編碼為 X1、X2、X3、X4、X5和 X6。對于每個因素，在前期大量試驗基礎(chǔ)上，均設(shè)定高(1)、低(－1)兩個水平，以石榴根皮多酚得率(Y)為響應(yīng)值，6個影響因素為自變量，每個試驗號平行試驗3次，取平均值作為試驗結(jié)果，共進行12次試驗。PB試驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 PB設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels used in the PB design

1.2.6 優(yōu)化試驗設(shè)計－CCD設(shè)計 根據(jù)PB試驗分析結(jié)果，選取乙醇體積分數(shù)(X2)、超聲溫度(X5)和超聲時間(X6)作為CCD試驗設(shè)計的3個自變量，以石榴根皮多酚得率(Y)為響應(yīng)值，選用n=20試驗設(shè)計模塊，每個試驗號平行試驗3次，取平均值作為試驗結(jié)果，建立其與自變量之間的函數(shù)關(guān)系，進而尋求石榴根皮多酚提取工藝的最優(yōu)組合。CCD試驗設(shè)計因素水平見表2。

表2 CCD設(shè)計因素水平表Table 2 Factors and levels used in the CCD design

1.2.7 石榴根皮多酚清除自由基能力評價

1.2.7.1 石榴根皮多酚對DPPH自由基的清除作用 參考文獻［11－14］的方法并加以改進，操作方法:準確吸取100μL稀釋至適當濃度的樣品溶液，用重蒸餾水補充至1 mL，加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 mL，避光放置30 min，以無水乙醇作參比在517 nm波長處測定吸光度Ai;以等體積的無水乙醇代替樣品溶液，同法操作，測定吸光度A0;以等體積的無水乙醇溶液代替DPPH溶液，同法操作，測定吸光度Ai0。將純化后的石榴根皮提取物依次配制成2.5、5、10、15、20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL的樣品溶液，用于對DPPH自由基的清除作用測定，求出IC50，并以VC為參照。DPPH自由基清除率按式(3)計算:

1.2.7.2 石榴根皮多酚對ABTS+·的清除作用 參照文獻［15－17］的方法并加以改進，操作方法:將7 mmol/L的ABTS溶液5 mL與140 mmol/L的過硫酸鉀88μL混合，置于暗處反應(yīng)24 h，使用前用無水乙醇稀釋至734 nm波長下吸光度0.70±0.02，即得ABTS+·稀釋液。分別吸取200μL稀釋至適當濃度的樣品溶液，加入4.8 mL ABTS+·稀釋液，避光反應(yīng)15 min，以無水乙醇作參比在734 nm波長處測定吸光度Ai;以等體積的無水乙醇代替樣品溶液，同法操作，測定吸光度A0;以等體積的無水乙醇溶液代替ABTS+·溶液，同法操作，測定吸光度Ai0。將純化后的石榴根皮提取物依次配制成 5、10、15、20、40、80、120、160、200、240、280、320 μg/mL 的樣品溶液，用于對ABTS的清除作用測定，求出 IC50，并以 VC為參照。ABTS+·清除率按式(4)計算:

1.3 數(shù)據(jù)處理

PB試驗設(shè)計和 CCD試驗設(shè)計采用 Design－Expert 8.0.5統(tǒng)計分析軟件，圖形制作采用Excel數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

由圖1可知，藥材粒度小于40目時，藥材粉碎越細，石榴根皮多酚得率越高，當藥材粒度為40目時，多酚得率達到最大值，此后藥材粉碎越細，多酚得率反而降低，因此確定藥材粒度為40目左右。乙醇體積分數(shù)在0～60%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，石榴根皮多酚得率呈上升趨勢，在60%達到最大值，此后隨著乙醇體積分數(shù)的提高，多酚得率反而下降，因此確定乙醇體積分數(shù)為60%左右。料液比在1∶5～1∶20 g/mL范圍內(nèi)，隨著提取溶劑的增加，石榴根皮多酚得率呈上升趨勢，在1∶20 g/mL時達到最大值，此后隨著提取溶劑的增加，多酚得率反而下降，因此確定料液比為1∶20 g/mL左右。超聲功率小于400 W時越大，石榴根皮多酚得率越高，當超聲功率為400 W時，多酚得率達到最大值，此后隨著超聲功率的增大，多酚得率反而降低，因此確定超聲功率為400 W左右。超聲溫度在25～45℃范圍內(nèi)，隨著超聲溫度的提高，石榴根皮多酚得率呈上升趨勢，在45～55℃時達到最大值，此后隨著超聲溫度的提高，多酚得率反而下降，因此確定超聲溫度為45～55℃。超聲時間在25～35 min內(nèi)，超聲時間越長，石榴根皮多酚得率越高，當超聲時間為25～35 min時，多酚得率達到最大值，此后隨著超聲時間的延長，多酚得率反而降低，因此確定超聲時間為25～35 min。

圖1 各因素對石榴根皮多酚得率的影響Fig.1 Effects of factors on the extraction yield of polyphenols from pomegranate root bark

2.2 PB試驗設(shè)計

根據(jù)Design－Expert 8.0.5統(tǒng)計分析軟件所提供的方案安排試驗，結(jié)果見表3。將表3中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合及顯著性檢驗，方差分析結(jié)果見表4。

表3 PB設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 3 Arrangement and corresponding results of PB design

由表4可知，模型的p=0.0029＜0.01，達到極顯著水平，相關(guān)系數(shù) R2=0.9567，決定系數(shù)=0.9048，說明模型可信度高，可以應(yīng)用該模型對試驗結(jié)果進行分析和預(yù)測［18－19］。乙醇體積分數(shù)(X2，p=0.0036＜0.01)、超聲溫度(X5，p=0.0012 ＜0.01)、超聲時間(X6，p=0.0021＜0.01)3個因素均達到極顯著水平，其余因素不顯著(p＞0.05)。因此，在試驗中重點優(yōu)化乙醇體積分數(shù)、超聲溫度和超聲時間3個因素。

表4 PB試驗方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis for PB design

注:p＜0.05為差異顯著，p＜0.0001為差異極顯著，p＞0.05為差異不顯著，表6同。從產(chǎn)物得率及節(jié)能環(huán)保等角度考慮，固定藥材粒度為40目、料液比為1∶20 g/mL、超聲功率為300 W。

2.3 CCD試驗設(shè)計結(jié)果與分析

根據(jù)軟件所提供的方案安排試驗，對X2、X5和X6這3個影響顯著的因素進行優(yōu)化分析，結(jié)果見表5。將表5中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合及顯著性檢驗，方差分析結(jié)果見表6。

利用軟件對表5的數(shù)據(jù)進行非線性回歸得到二次多項式擬合，預(yù)測模型如下:

表5 CCD設(shè)計方案與試驗結(jié)果Table 5 Arrangement and corresponding results of CCD design

表6 CCD設(shè)計方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis for CCD design

由表6可以看出，模型p＜0.0001，達到極顯著水平，失擬項(p=0.0991＞0.05)不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.9945，決定系數(shù) R2Adj=0.9896，變異系數(shù)0.99%，說明該方程擬合度良好，誤差較小，可以應(yīng)用該模型對試驗結(jié)果進行分析和預(yù)測［19］。一次項 X5、X6，二次項及交互項X2X5、X5X6均達到極顯著水平(p＜0.01)。

響應(yīng)面的坡度變化情況和等高線的稀疏程度均能直觀反映各因素之間的交互影響情況，等高線呈圓形時表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形時則表示兩因素交互作用顯著［20－21］。由圖2a可知，超聲溫度的曲面變化比乙醇體積分數(shù)陡峭，同時，等高線圖中等溫曲線變化密集程度高，說明超聲溫度比乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響大。同理，由圖2b和2c可知，超聲時間比乙醇體積分數(shù)對多酚得率的影響大，而超聲時間比超聲溫度對多酚得率的影響大。

超聲波輔助提取石榴根皮多酚的最佳工藝條件為:乙醇體積分數(shù)60.5%、超聲溫度49.4℃、超聲時間31.8 min時，石榴根皮多酚得率模型預(yù)測值為1.650%，實際操作中稍作調(diào)整，確定的最佳工藝條件為:乙醇體積分數(shù)60%、超聲溫度49℃、超聲時間32 min。測得石榴根皮多酚平均得率為1.643%，接近預(yù)測值，說明優(yōu)化結(jié)果可信。

圖2 各因素交互作用對多酚得率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot showing the interactive effects of the yield of polyphenols

2.4 石榴根皮多酚抗氧化活性分析

2.4.1 石榴根皮多酚對DPPH自由基清除作用 石榴根皮純化物純度約為78%。由圖3可知，在2.5～120μg/mL范圍內(nèi)，石榴根皮對DPPH自由基的清除率，隨著自身濃度的增加而逐漸升高，當濃度為120μg/mL時，清除率達到70.3%。多酚濃度與對DPPH自由基清除率之間的擬合的線性方程為y=0.463x+17.05，R2=0.989。通過擬合方程算出清除作用的 IC50=71.166 μg/mL［22］。鄧娜等［3］研究了石榴其它部位中多酚類成分對DPPH自由基清除作用，結(jié)果表明石榴皮、石榴籽和石榴瓤中多酚類成分對DPPH自由基清除作用的 IC50分別為82.161、110.356和171.987μg/mL，均高于本實驗中石榴根皮多酚的71.166μg/mL?？梢姡窀ず褪衿渌课幌啾?，其多酚類成分具有較強的DPPH自由基清除能力。

圖3 石榴根皮多酚及VC對DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of polyphenols from pomegranate root bark and VC on DPPH free radical

2.4.2 石榴根皮多酚對ABTS+·清除作用 由圖4可知，在5～240μg/mL范圍內(nèi)，隨著多酚濃度的增加，其對 ABTS+·的清除率逐漸升高，當濃度為240μg/mL時，清除率達到65.7%。多酚濃度與對ABTS清除率之間的擬合的線性方程為y=0.226x+13.09，R2=0.994。通過擬合方程算出清除作用的IC50=163.319 μg/mL，范金波等［23］研究了白藜蘆醇、蘆丁和根皮素等多酚類成分對ABTS+·的清除作用，結(jié)果表明3種多酚類成分對ABTS+·清除作用的IC50依次為56.0、138.0和160.0μg/mL，而本實驗中石榴根皮多酚的IC50為163.319μg/mL?？梢?，石榴根皮多酚類成分對ABTS+·的清除作用的IC50接近于常見的根皮素類成分，具有一定的ABTS+·清除能力。

圖4 石榴根皮多酚及VC對ABTS的清除作用Fig.4 Scavenging effects of polyphenols from pomegranate root bark and VC on ABTS

3 結(jié)論

本課題以石榴根皮為材料，采用 Plackett－Burman試驗設(shè)計結(jié)合Central Composite Design試驗設(shè)計，優(yōu)選出超聲波輔助提取石榴根皮多酚最佳工藝條件為:乙醇體積分數(shù)60%、超聲溫度49℃、超聲時間32 min，按照此工藝進行試驗操作，得到多酚平均得率為1.643%，這與理論值1.650%相符，表明所選用的回歸模型對試驗結(jié)果擬合較好。石榴根皮多酚抗氧化活性試驗結(jié)果表明，石榴根皮中多酚類成分具有較好的清除DPPH自由基和ABTS+·能力，其IC50相應(yīng)為71.166μg/mL和163.319μg/mL。其在一定的濃度范圍內(nèi)，石榴根皮多酚與抗氧化活性之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，石榴根皮多酚具有一定的抗氧化活性。本研究為石榴根皮的充分開發(fā)利用，助力于石榴資源的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了理論支撐。