孟 嫚，張延杰，楊 哪 ，徐學(xué)明

(1.咀香園健康食品(中山)有限公司，廣東中山528437;2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122;3.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122)

多糖類的化合物廣泛存在于各類植物原料中，它們通常具有降血壓，抗老化及抑制腫瘤細(xì)胞生長的特殊功效，因而能夠作為一種功能性食品原料并廣泛的運(yùn)用在飲料、乳制品和保健產(chǎn)品［1］。松茸是一種珍貴的可食用類真菌，在我國主要分布在東北及西南地區(qū)。松茸香氣宜人，菌肉肥厚，味道鮮美深受人們的喜愛［2］。同時(shí)，松茸多糖來源于松茸(Tricholoma matsutak)的子實(shí)體中，含量較大且氣味芬芳，能起到提高免疫力和降低膽固醇的作用，特別是其中的甘露聚糖能有效抑制腹水癌并有益腸道健康，因而具有較高的藥用價(jià)值及開發(fā)前景［3］。

劉剛采用響應(yīng)面技術(shù)對(duì)松茸多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)水提法的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了影響分析，發(fā)現(xiàn)在95℃下經(jīng)歷3.5 h，最大可獲得12%的多糖提取率［4］。同時(shí)，孫培龍利用微波輔助技術(shù)對(duì)松茸多糖進(jìn)行了提取，發(fā)現(xiàn)于120℃且微波處理10 min，可獲得9%的多糖提取率［5］。另一些酶法輔助提取松茸多糖的研究也有廣泛報(bào)道［6－7］。然而，這些技術(shù)都是采用的傳統(tǒng)水浴提取法(conventional method)［8］。為了實(shí)現(xiàn)多糖類天然產(chǎn)物的高效率提取，近年來對(duì)一些非傳統(tǒng)方法(non－conventional method)也有大量研究報(bào)道，比如超聲波輔助提取［9］，歐姆加熱提?。?0］，微波輔助提?。?1］，超臨界二氧化碳提?。?2］，高壓脈沖電場提?。?3］。磁感應(yīng)的電場是利用交變磁場產(chǎn)生交變電場的原理，在沒有任何金屬電極參與的情況下，對(duì)閉合回路中的樣品生產(chǎn)電效應(yīng)(感應(yīng)電場和感應(yīng)電流)，以便在較短時(shí)間內(nèi)，完成對(duì)植物類原料中天然產(chǎn)物的提取。Jin等［14］首先利用感應(yīng)原理和試驗(yàn)性的變壓器結(jié)構(gòu)對(duì)鹽漬黃瓜漿體中的感應(yīng)電壓和終端電壓進(jìn)行了測量，發(fā)現(xiàn)液態(tài)樣品中的離子濃度越高則終端電壓就越強(qiáng)。Yang等［15］采用多級(jí)串聯(lián)的磁回路作為激勵(lì)源對(duì)流體中的桑葉顆粒進(jìn)行處理并對(duì)多糖得率的變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)勵(lì)磁強(qiáng)度和體系電導(dǎo)率的提高有利于提取加工，而多糖得率則和頻率呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。由于該電場的激勵(lì)源來源于磁場而非金屬極板，因此可避免傳統(tǒng)電場技術(shù)在高溫提取時(shí)，造成的電化學(xué)反應(yīng)，極板腐蝕及金屬離子污染［16］。

本研究采用管式反應(yīng)器并結(jié)合磁感應(yīng)電場來輔助提取松茸中的多糖物質(zhì)，通過單因素試驗(yàn)分析了松茸多糖在提取過程中，水提溫度、時(shí)間、固液比、激勵(lì)電壓、頻率對(duì)其得率的影響，同時(shí)對(duì)比水提法提取時(shí)產(chǎn)物的理化特性差異，期待為松茸多糖的高效利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濃硫酸，95%乙醇，丙酮，乙醚，氯仿，磷酸氫二鈉(均為分析純)，鄰苯三酚，Tris試劑，1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH)(以上試劑均為化學(xué)純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;新鮮松茸 市購。

UV－1900雙波長紫外－可見分光光度計(jì) 普析通用儀器有限責(zé)任公司;HH－4恒溫水浴鍋 常州丹瑞實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司;ZT－150型中藥材粉碎機(jī) 永康市展帆工貿(mào)有限公司;DGG－9070A軍工小烘箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;RW20機(jī)械式攪拌機(jī) 德國 IKA公司;PL602 12106450－CN電子天平 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司;RJ－LDL－50A低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;Free Zone 6L凍干機(jī) 美國Labconco公司;MTC－400磁感應(yīng)電場反應(yīng)裝備 岐昱實(shí)業(yè)(上海)有限公司;FE30K電導(dǎo)率計(jì) 瑞士梅特勒－托利多集團(tuán);FE28臺(tái)式酸度計(jì) 瑞士梅特勒－托利多集團(tuán);65120B采用精密阻抗分析儀 英國Wayne Kerr電子有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 每次稱取約1000 g的松茸，并對(duì)其子實(shí)體進(jìn)行清洗和除雜，將清洗完的子實(shí)體表面水分用紙巾吸干，切片(厚度2 mm)，放進(jìn)60℃烘箱干燥至恒重，粉碎，過120目篩，得到松茸子實(shí)體粉末。

1.2.2 多糖的提取

1.2.2.1 熱水提取 準(zhǔn)確稱取50 g子實(shí)體干粉末，按不同固液比加入蒸餾水，于不同溫度水浴進(jìn)行浸提，期間緩慢攪拌，于一定時(shí)間后在4000 r/min下離心20 min，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于50℃時(shí)將上清液濃縮到原液的20%，緩慢地加入3倍體積的95%乙醇，再于4℃低溫放置 24 h，待棕色絮狀粗多糖析出，于4500 r/min離心20 min，收集沉淀物并采用丙酮+乙醚(1∶3)抽濾兩次，除去脂肪，30℃ 烘干;再將上述得到的固體樣品配制成約1%的溶液，加入其25%體積的Sevage試劑［氯仿∶正丁醇=5∶1(V/V)］，振蕩20 min，4000 r/min離心10 min，分液漏斗分離取含有多糖的上清液，重復(fù)三次。最終，將得到的上清液放于－40℃的冰箱凍塊后再放進(jìn)凍干機(jī)中進(jìn)行干燥得到多糖粉末［4］。

1.2.2.2 磁感應(yīng)電場輔助提取 準(zhǔn)確稱取50 g子實(shí)體干粉末，按不同固液比加入蒸餾水，于一定溫度下以200 mL/min的流量泵入感應(yīng)電場反應(yīng)裝備，原理如圖1所示，磁路為取向硅鋼27QG120，單相O型結(jié)構(gòu)，鐵芯柱直徑220 mm，鐵芯高度685 mm，鐵芯寬度580 mm，鐵芯窗高335 mm，鐵芯窗寬160 mm，樣品管道內(nèi)徑4 mm，功率10 k W)，期間施加一定頻率的勵(lì)磁電壓，處理一定時(shí)間后在4000 r/min下離心20 min，后續(xù)操作同1.2.2.1。

圖1 磁感應(yīng)電場輔助提取原理Fig.1 The auxiliary extraction principle by magneto－induced electric field

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 熱水提取多糖 分別考察:不同溫度(70、80、90、100 ℃)于固液比為1∶30 g/mL 和時(shí)間8 min;不同時(shí)間(4、8、12、16、20 min)于溫度70 ℃和固液比1∶30 g/mL，以及不同固液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)于溫度 70℃和時(shí)間 8 min時(shí)的多糖得率。

1.2.3.2 磁感應(yīng)電場提取多糖 分別考察:不同激勵(lì)電壓(700、800、900、1000、1100 V)于頻率 400 Hz，溫度70℃，固液比1∶30 g/mL和時(shí)間8 min;不同頻率(300、400、500、600、700 Hz)于激勵(lì)電壓 800 V，溫度70℃，固液比1∶30 g/mL和時(shí)間8 min;不同溫度(70、80、90、100 ℃)于激勵(lì)電壓 800 V，頻率 400 Hz，固液比為1∶30 g/mL和時(shí)間8 min;不同時(shí)間(4、8、12、16、20 min)于激勵(lì)電壓800 V，頻率 400 Hz，溫度70℃和固液比1∶30 g/mL，以及不同固液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)于激勵(lì)電壓 800 V，頻率400 Hz，溫度70℃和時(shí)間8 min時(shí)的多糖得率，從而分析磁感應(yīng)電場工藝參數(shù)對(duì)多糖得率的影響規(guī)律。

1.2.4 磁感應(yīng)電場提取多糖的工藝優(yōu)化 通過單因素實(shí)驗(yàn)，將得出的各個(gè)較優(yōu)參數(shù)采用正交試驗(yàn)法對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，建立激勵(lì)電壓、電場頻率、溫度、固液比、提取時(shí)間的5因素4水平正交試驗(yàn)，方案采用L16(45)的設(shè)計(jì)形式，具體參數(shù)選擇見表1所示。

表1 L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及因素水平表Table 1 Factors and levels of L16(45)orthogonal experimental design

1.2.5 多糖含量測定

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用苯酚－硫酸比色法，在490 nm處測定吸光度。以葡萄糖濃度C(0、10、20、30、40、50、60 μg·mL－1)為橫坐標(biāo)，吸光度 A 為縱坐標(biāo)，繪制吸光度－葡萄糖濃度的關(guān)系曲線，步驟參考陳煉紅的方法［17］，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 A=0.5349C+0.0271，相關(guān)系數(shù)R2=0.9941。

1.2.5.2 松茸提取液中多糖含量的測定 將提取后經(jīng)干燥過的多糖用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液定容于500 mL容量瓶內(nèi)，吸取1.0 mL以超純水補(bǔ)至2.0 mL。分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min后于紫外－可見分光光度計(jì)490 nm波長處測吸光度。將測定出的吸光度代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中便可得到多糖提取液中多糖的含量。按下面公式計(jì)算出松茸多糖的得率:

式中:Y為松茸多糖得率，%;M1為松茸粉末樣品，mg;M2為依據(jù)回歸方程計(jì)算出的粗多糖質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.6 介質(zhì)理化特性測定 料液p H和電導(dǎo)率分別采用酸度計(jì)和電導(dǎo)率計(jì)進(jìn)行測定。

1.2.7 流體阻抗測定 采用精密阻抗分析儀對(duì)松茸懸浮液流體阻抗進(jìn)行測量，將其中的流體阻抗探頭進(jìn)口和出口管路連接入系統(tǒng)中，保證其探頭的極板測試距離與系統(tǒng)管道內(nèi)徑一致，測試前分別進(jìn)行開路(空氣)、短路(銅塊)和高頻(100 Ω 電阻，10、100 pF電容于50 Hz～10 MHz)校正，然后測試樣品流體的阻抗［18］。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 16.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 激勵(lì)電壓對(duì)松茸多糖得率的影響

圖2為不同激勵(lì)電壓對(duì)松茸多糖得率的影響，激勵(lì)電壓施加于鐵芯時(shí)，料液體系作為次級(jí)回路(或閉合電路)即出現(xiàn)感應(yīng)電壓，作為水相體系的料液負(fù)載中同時(shí)出現(xiàn)磁感應(yīng)的電流?？梢钥闯觯?dāng)激勵(lì)電壓低于1000 V時(shí)，多糖得率隨激勵(lì)電壓的提升而顯著提高(p＜0.05)，1000 V下的多糖得率相對(duì)于水提組(0 V)則提高了4.9倍。松茸粉水相懸浮液(1∶30 g/mL)的pH為6.3，同時(shí)其電導(dǎo)率為3.4 S/m(表2所示)，內(nèi)部含有大量的自由離子和帶電粒子，料液體系具有一定的導(dǎo)電能力。所有電場加工技術(shù)(歐姆加熱和高壓脈沖電場)，需要反應(yīng)體系具備一定的傳導(dǎo)性(0.1～20 S/m)［19］。電場效應(yīng)能夠有效的通過交變磁場的耦合作用于反應(yīng)介質(zhì)。在交變電場影響下，料液的電導(dǎo)率越高則系統(tǒng)的能量效率越大［20］。這是因?yàn)榻橘|(zhì)中的帶電溶質(zhì)越多則電導(dǎo)率越大，其次級(jí)回路的料液阻抗就降低，根據(jù)焦耳定律，樣品的消耗功率就提高。同時(shí)，在處理過程中施加的電壓會(huì)在傳導(dǎo)性的料液中引發(fā)電流，造成帶電溶質(zhì)的大規(guī)模定向遷徙并隨即產(chǎn)生熱效應(yīng)，使溶質(zhì)的傳質(zhì)效率提高［21］，進(jìn)一步的促進(jìn)松茸多糖的溶出［22］。當(dāng)系統(tǒng)中的磁場磁通密度小于磁飽和水平時(shí)，隨著激勵(lì)電壓的提升，松茸多糖得率也隨之增加，但增幅則逐漸減少。比如，激勵(lì)電壓1000 V相對(duì)于900 V，900 V相對(duì)于800 V，800 V相對(duì)于700 V的處理樣品則多糖得率分別增加了25.3%、23.0%和22.6%。但當(dāng)激勵(lì)電壓超過1000 V時(shí)，系統(tǒng)中的磁場磁通密度超過磁飽和水平，造成磁場的大幅損耗，進(jìn)而引起系統(tǒng)的輸出功率減弱，所以多糖得率反而降低。因此，單因素提取工藝中的最適激勵(lì)電壓為1000 V。

表2 不同固液比下的料液pH和電導(dǎo)率Table 2 The pH－value and conductivity of the medium with various solid－liquid ratio

圖2 激勵(lì)電壓對(duì)松茸多糖得率的影響Fig.2 The effect of excitation voltage on the yield of Tricholoma matsutake polysaccharide

2.2 頻率對(duì)松茸多糖得率的影響

從圖3得知，當(dāng)激勵(lì)電壓頻率提高則松茸多糖的得率出現(xiàn)降低的趨勢。相對(duì)于700 Hz電場頻率，400、500、600 Hz時(shí)的多糖得率分別提高了55.8%、38.6%和24.8%。根據(jù)磁感應(yīng)原理，隨著頻率的提高，料液中的感應(yīng)電壓保持不變，但系統(tǒng)中的磁場密度下降，初級(jí)線圈的阻抗則會(huì)增加，最終造成系統(tǒng)的總磁通量和輸出功率降低，導(dǎo)致多糖的提取效率降低。進(jìn)一步，液態(tài)樣品中的帶電溶質(zhì)在交變電場力作用下會(huì)進(jìn)行定向性的遷徙即形成感應(yīng)電流，使得樣品顆粒經(jīng)受低強(qiáng)度和低頻的“摩擦”作用。系統(tǒng)將勵(lì)磁后的磁能轉(zhuǎn)換為電能后施加于料液體系并轉(zhuǎn)換為焦耳熱能(inductive heating)［23］。同時(shí)，料液中的熱損耗也即歐姆熱，有利于多糖產(chǎn)物從樣品組織的細(xì)胞及其間隙中的溶出。不同的導(dǎo)磁材料具有最適的工作頻率，即在該工作頻率時(shí)的系統(tǒng)磁損耗最小，能量輸入水平最高，故當(dāng)前系統(tǒng)的最適頻率為400 Hz。

圖3 頻率對(duì)松茸多糖得率的影響Fig.3 The effect of frequency on the yield of Tricholoma matsutake polysaccharide

2.3 溫度和時(shí)間對(duì)松茸多糖得率的影響

從圖4a可知，隨著提取溫度的增高其松茸多糖得率也呈現(xiàn)上升的趨勢。磁感應(yīng)的電場加工同歐姆加熱OH(ohmic heating)和中強(qiáng)電場MEF(moderate electric field)技術(shù)一樣，溫度和電場強(qiáng)度是提升反應(yīng)體系傳質(zhì)效率的主要因素，原理上都是增加了對(duì)介質(zhì)的能量輸入進(jìn)而提高了傳質(zhì)效率［24］。例如，當(dāng)傳導(dǎo)性的溶液插入鈍性的金屬電極后，料液體系的溫度迅速提升，因而其帶電溶質(zhì)的傳質(zhì)效率也會(huì)相應(yīng)提高。該研究中不同提取溫度70、80、90、100℃的樣品相對(duì)于水提組(0 V)，施加激勵(lì)電壓后多糖的得率分別提高了287.4%、232.1%、129.3%和100.1%。因此，從多糖得率的提升效率和能耗綜合考慮，最適溫度選為80℃。從圖4b可知，隨著處理時(shí)間的延長松茸多糖的得率(電場組和水提組)也顯著提高(p＜0.05)，但電場組樣品在16 min時(shí)的多糖得率趨于穩(wěn)定即10.33%，同時(shí)電場組的輸出功率也繼續(xù)增加。因此，電場組的處理時(shí)間在16 min較為適宜。

圖4 溫度和處理時(shí)間對(duì)松茸多糖得率的影響Fig.4 The effect of temperature and processing time on the yield of Tricholoma matsutake polysaccharide注:a:溫度;b:時(shí)間。

2.4 固液比和流體阻抗對(duì)松茸多糖得率的影響

從圖5a可知，不同固液比下經(jīng)磁感應(yīng)電場處理的樣品相對(duì)于水提組(0 V)，其多糖的得率分別提高了 171.8%(1∶20 g/mL)，313.4%(1∶25 g/mL)，

257.1 %(1∶30 g/mL)和 187.8%(1∶35 g/mL)。同時(shí)，隨著固液比的提高其松茸多糖得率出現(xiàn)先升高而后下降的趨勢，這可能跟樣品的流體阻抗有關(guān)。流體阻抗水平反映出連續(xù)流的樣品溶液對(duì)特定頻率交變電流的阻礙能力，其值越高則料液的傳導(dǎo)性就越差，樣品中的感應(yīng)電流就越小，系統(tǒng)能量輸入水平就越低。從圖5b可知，隨著反應(yīng)體系固液比的增加，其松茸懸浮液流體阻抗先降低后升高，而樣品的電導(dǎo)率則先升高后減少(表2所示)，松茸多糖得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(圖5a)。當(dāng)感應(yīng)電壓不變時(shí)，進(jìn)一步根據(jù)歐姆定律可知，其介質(zhì)的阻抗值越低則流體的傳導(dǎo)性就會(huì)提高［25］，系統(tǒng)能量效率提升進(jìn)而導(dǎo)致多糖得率增加，反之亦然［25］。因此，由單因素試驗(yàn)可知電場組的最適固液比為1∶25 g/mL。

圖5 固液比對(duì)松茸多糖得率和流體阻抗的影響Fig.5 The effect of solid－liquid ratio on the yield of Tricholoma matsutake polysaccharide and its fluid impedance注:a:多糖得率;b:流體阻抗。

2.5 最優(yōu)工藝及參數(shù)影響分析

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)所得到的因素水平并按表3的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，稱取16份松茸粉并根據(jù)上述編號(hào)條件進(jìn)行其多糖的磁感應(yīng)電場提取，隨后測量各組樣品溶液中的多糖得率，結(jié)果如下。

由表3分析可知，各工藝參數(shù)對(duì)松茸多糖得率的影響主次為:電場頻率(B)＞激勵(lì)電壓(A)＞時(shí)間(E)＞溫度(C)＞固液比(D)。同時(shí)，該多糖得率的最優(yōu)工藝參數(shù)組合為 A3B3C4D3E3，即激勵(lì)電壓為1000 V、頻率 500 Hz、溫度 100 ℃、固液比為1∶30 g/mL、時(shí)間16 min。在此工藝條件下，進(jìn)行3次重復(fù)提取試驗(yàn)，則多糖得率達(dá)到了14.32% ±1.2%，而在相同固液比(1∶30 g/mL)、提取溫度(100℃)和提取時(shí)間(16 min)下水提組(0 V)的多糖得率為8.74%±1.3%，故上述優(yōu)化組相對(duì)于水提組的多糖得率提高了47.99%。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental designs and results

3 結(jié)論

采用大功率的磁感應(yīng)電場裝備對(duì)松茸子實(shí)體中的多糖進(jìn)行了有效提取，結(jié)果表明:多糖得率與系統(tǒng)的激勵(lì)電壓和溫度呈現(xiàn)正向相關(guān)，并隨電壓頻率的增加而減少，同時(shí)存在著最佳的提取系統(tǒng)固液比。根據(jù)5因素4水平的正交試驗(yàn)結(jié)果，得出不同磁感應(yīng)電場輔助提取參數(shù)對(duì)松茸多糖得率的影響主次為:電場頻率＞激勵(lì)電壓＞時(shí)間＞溫度＞固液比。磁感應(yīng)電場輔助松茸多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)為激勵(lì)電壓1000 V、電場頻率 500 Hz、溫度 100℃，固液比1∶30 g/mL，時(shí)間16 min，松茸多糖得率為14.32% ±1.2%，比熱水提取法提高了47.99%。該技術(shù)為植物類原料中的高價(jià)值產(chǎn)物的有效提取提供了一種參考方法。