王錫念，徐志善，孫欽軍，包建強，2，3，*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306;2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306;3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(上海)，上海201306)

鮟鱇魚(Lophiiformes)，又名蛤蟆魚、結(jié)巴魚等，屬于近海底層魚類，內(nèi)臟比重大，出肉率低，在加工過程中會產(chǎn)生60%以上的下腳料，魚皮占下腳料的10%左右［1］。且魚皮中含有豐富的蛋白質(zhì)，膠原蛋白占粗蛋白80%左右［2］。膠原蛋白是代表近30%動物體內(nèi)總蛋白的哺乳動物中最豐富的蛋白［3］，主要存在于動物的皮膚、骨、肌腱、韌帶及結(jié)締組織等部位中［4－5］，與組織間的傳遞和衰老等有密切的關(guān)系［6］。膠原蛋白在醫(yī)學(xué)材料、化妝品、食品工業(yè)中均有廣泛應(yīng)用［7］，其不僅可作為保健食品、食品添加劑［7］、美容產(chǎn)品和包裝材料，還可制成膠原海綿、膠原膜、膠囊等［8］。所以，如何更好地提取膠原蛋白引起了人們的關(guān)注。

超聲波輔助酶法常用于提取水產(chǎn)品膠原蛋白，如草魚皮［9］、鱈魚皮［10］、鱔魚皮［11］等，Ye 等［12］在超聲輔助提取裙邊甲魚膠原蛋白的研究中，發(fā)現(xiàn)超聲波提取的膠原蛋白含量和常規(guī)方法提取膠原蛋白的含量分別為507.5和436.2 g/kg，比常規(guī)方法提取膠原蛋白的含量增加16.3%。目前關(guān)于超聲波輔助酶法提取膠原蛋白在鮟鱇魚皮中的應(yīng)用還未見報道。

因此，本實驗選取風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶進行試驗，選取酶解膠原蛋白效果較好的兩種酶，將超聲波分別與風(fēng)味蛋白酶及堿性蛋白酶結(jié)合提取鮟鱇魚皮膠原蛋白尋求最優(yōu)提取方案。以期為解決鮟鱇魚魚皮浪費，提供有用的方法及膠原蛋白的工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮟鱇魚 舟山興業(yè)有限公司;堿性蛋白酶(200 U/mg)、風(fēng)味蛋白酶(20000 U/g)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀 AR，源葉生物科技有限公司;胰蛋白酶(50000 U/g)、牛血清 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純;實驗用水 均為去離子水。

T6新世紀(jì)型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;G－060S型歌能牌超聲波清洗機 上海鰲珍儀器制造有限公司;FOSS8400型全自動凱氏定氮儀 上海瑞玢國際貿(mào)易有限公司;Seven2Go型pH計、ME204型分析天平 梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;DK－S28型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;H1850R型高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;DHG－9070A型鼓風(fēng)干燥箱 上海鰲珍儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮟鱇魚皮的制備 取出于－18℃冷凍的鮟鱇魚，流水化凍后，將魚皮剝下，分切成約1 mm×1 mm碎魚皮塊，用10%異丙醇浸泡24 h去除脂肪，用清水沖洗后，用HCl和NaOH調(diào)p H至6.5左右，再用10%氯化鈉溶液浸泡24 h去除可溶性的非膠原蛋白［13］，用清水洗后，放入－50℃的冰箱備用。

1.2.2 鮟鱇魚皮膠原蛋白的提取 取鮟鱇魚皮流水解凍1 h，實驗用紙將魚皮外部水分擦干稱取，以一定料液比加入一定提取pH的磷酸鹽緩沖溶液，分別加入一定量的風(fēng)味蛋白酶或一定量的堿性蛋白酶，超聲一定時間后放入一定溫度的恒溫水浴鍋酶解4 h，最后100℃滅酶10 min，取出冷卻，在10000 r/min離心10 min，取上清液測鮟鱇魚皮膠原蛋白提取率。

1.2.3 酶的篩選 以鮟鱇魚皮膠原蛋白提取率為指標(biāo)，依照1.2.2，分別采用風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶，控制料液比為1∶15 g/mL，超聲時間60 min，提取pH7.5，酶解溫度45℃，酶解時間4 h，加酶量4000 U/g進行實驗，選出適宜的酶進行接下來的實驗。

1.2.4 單因素實驗 以鮟鱇魚皮膠原蛋白提取率為指標(biāo)，采用1.2.3中選出的酶，固定料液比為1∶15 g/mL，超聲時間60 min，提取p H7.5，酶解溫度45℃，酶解時間4 h，加酶量4000 U/g進行實驗。

設(shè)定變量因素的水平依次為料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)，超聲時間(40、50、60、70、80 min)，提取 pH(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)，酶解溫度(35、40、45、50、55 ℃)，酶解時間(2、3、4、5、6 h)，風(fēng)味蛋白酶(堿性蛋白酶)添加量(2000、3000、4000、5000、6000 U/g)。實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)取均值。

1.2.5 正交試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，用膠原蛋白提取率為判斷標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合文獻［14］，選出以下四個因素進行正交試驗。以加酶量(風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶)、超聲時間、酶解時間和酶解溫度為考察因素，各選取3個水平，采用L9(34)實驗設(shè)計，以鮟鱇魚皮膠原蛋白提取率為評價指標(biāo)，確定最佳提取工藝。實驗因素及水平表見表1和表2。

表1 超聲－風(fēng)味酶法提取鮟鱇魚皮膠原蛋白因素水平表Table 1 Extraction of collagen from fish skin by ultrasonic flavor enzyme method

表2 超聲－堿性酶法提取鮟鱇魚皮膠原蛋白因素水平表Table 2 Extraction of collagen from fish skin by ultrasonic alkaline enzyme method

1.2.6 膠原蛋白提取率的測定 鮟鱇魚皮蛋白質(zhì)含量的測定［15］采用 GB 5009.5－2016凱氏定氮法。通過測定羥脯氨酸含量來計算膠原蛋白提取率，羥脯氨酸的測定參照文獻［16］。羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的回歸方程:y=0.2244x－0.0006(R2=0.99997)。鮟鱇魚皮膠原蛋白提取率以干基表示［17］:

式中:X為鮟鱇魚皮膠原蛋白提取率，%;w為羥脯氨酸含量，g;11.1為羥脯氨酸轉(zhuǎn)為膠原蛋白的系數(shù);m為鮟鱇魚皮蛋白質(zhì)含量，g;k為鮟鱇魚皮水分含量，%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)次數(shù)3次，采用Origin 8.5和SPSS 24.0進行數(shù)據(jù)分析，將數(shù)據(jù)輸入軟件中進行計算及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的選擇

從圖1可以看出，3種酶提取膠原蛋白提取率的大小順序為:風(fēng)味蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胰蛋白酶。不同的酶對肽鍵的專一性不同，風(fēng)味蛋白酶具有內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶兩種活性，因此酶切位點會更多，效果更好;堿性蛋白酶和胰蛋白酶都只是內(nèi)切蛋白酶，堿性蛋白酶的主要酶切位點為Tyr、Phe、Trp;胰蛋白酶以Arg、Lys為C－端的肽鍵為主要酶切位點［18－19］;所以，堿性蛋白酶和胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶相比效果較差。根據(jù)膠原蛋白提取率的大小，選用風(fēng)味蛋白酶進行單因素正交試驗，對提取工藝進行詳細(xì)的探討。

圖1 不同酶對膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of different enzymes on the extraction rate of collagen

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對膠原蛋白提取率的影響 由圖2可知，超聲－風(fēng)味酶法的膠原蛋白提取率高于超聲－堿性酶法。隨著料液比的持續(xù)增大，超聲－風(fēng)味酶法、超聲－堿性酶法提取膠原蛋白提取率呈現(xiàn)“先增大，后降低”的趨勢，當(dāng)料液比在1∶15 g/mL時，膠原蛋白提取率都出現(xiàn)峰值。底物量一定時，當(dāng)料液比在1∶5～1∶15 g/mL，磷酸緩沖溶液的量逐漸增加，酶與底物逐漸充分結(jié)合，使得膠原蛋白提取率升高;繼續(xù)增加磷酸緩沖液的量至1∶25 g/mL時，對反應(yīng)體系而言，磷酸緩沖溶液的量過高，酶的濃度降低，其與底物不能達到最佳作用點，造成膠原蛋白提取率提取率下降。因此，選擇料液比為1∶15 g/mL。

圖2 料液比對膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effects of material and liquid ratio on the extraction rate of collagen

2.1.2 超聲時間對膠原蛋白提取率的影響 圖3顯示，超聲－風(fēng)味酶法的膠原蛋白提取率高于超聲－堿性酶法。隨著超聲時間延長，膠原蛋白提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在超聲時間為70 min時，膠原蛋白提取率值達最大值，表明此時超聲波作用效果最佳。超聲時間超過70 min后，膠原蛋白的提取率下降，推測超聲波時間越長，體系的溫度會相對升高，這可能會造成膠原蛋白發(fā)生部分水解或體系酶的活力被抑制［20］。因此，應(yīng)注意控制超聲時間，選定超聲時間為70 min。

圖3 超聲時間對膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic time on the extraction rate of collagen

2.1.3 蛋白酶添加量對膠原蛋白提取率的影響 從圖4中可以得出，超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白的效果優(yōu)于超聲－堿性酶法。風(fēng)味蛋白酶加酶量為2000～4000 U/g時，膠原蛋白提取率與加酶量成正比;在加酶量超過4000 U/g后，膠原蛋白提取率呈下降趨勢;這是因為當(dāng)酶的濃度相對于底物濃度較高情況下，反應(yīng)快慢由底物濃度決定，所以繼續(xù)增加酶用量，膠原蛋白提取率不再增加［21］。因此，從節(jié)約成本角度出發(fā)，風(fēng)味蛋白酶選擇加酶量為4000 U/g。而堿性蛋白酶加酶量要在5000 U/g時膠原蛋白提取率才最佳。

圖4 蛋白酶添加量對膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effects of protease addition on extraction rate of collagen protein

2.1.4 酶解時間對膠原蛋白提取率的影響 由圖5可知，超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白的效果優(yōu)于超聲－堿性酶法。超聲－風(fēng)味酶法，酶解時間2.0～4.0 h時，隨著酶解時間的延長，底物與酶充分接觸，膠原蛋白提取率增加;酶解時間為4 h時，膠原蛋白提取率最高;在酶解時間4.0 h后膠原蛋白提取率稍有下降，這是因為當(dāng)酶量一定時，酶解時間越長，部分膠原蛋白發(fā)生水解［22］。因此，超聲－風(fēng)味酶法宜選用酶解時間4.0 h。而對于超聲－堿性酶法，酶解時間為5.0 h時，膠原蛋白提取率最大，比超聲－風(fēng)味酶法多用1.0 h。

圖5 酶解時間對膠原蛋白提取率的影響Fig.5 Effects of enzymolysis time on the extraction rate of collagen

2.1.5 酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響 由圖6可知，酶解溫度對膠原蛋白提取率有明顯影響，超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白的效果優(yōu)于超聲－堿性酶法。對于超聲－風(fēng)味酶法，在35～45℃時膠原蛋白提取率隨著溫度升高不斷增大;在45℃膠原蛋白提取率最高;當(dāng)溫度高于45℃時提取率開始下降，推測溫度過高會使膠原蛋白發(fā)生部分水解或相關(guān)酶活受到了抑制。超聲－堿性酶法，溫度在35～40℃膠原蛋白提取率呈上升的趨勢;在40℃時，膠原蛋白提取率最高;溫度40℃后，膠原蛋白提取率呈下降的趨勢，因為溫度對酶解反應(yīng)速度具有兩面性，酶解溫度的上升可使酶解反應(yīng)速度加快，同時當(dāng)酶解溫度過高時，酶容易變性，使得酶活力下降［23］，膠原蛋白提取率下降。

圖6 酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響Fig.6 Effects of enzymolysis temperature on the extraction rate of collagen

2.1.6 提取pH對膠原蛋白提取率的影響 由圖7可知，超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白的效果優(yōu)于超聲－堿性酶法。膠原蛋白提取率隨提取pH的增大呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。超聲－風(fēng)味酶法，p H8.0時膠原蛋白提取率最大;超聲－堿性酶法，p H7.5時膠原蛋白提取率最大。p H過大，會使酶的活性降低，超聲－風(fēng)味酶法和超聲－堿性酶法分別在p H8.0和p H7.5后膠原蛋白提取率開始降低。

圖7 提取pH對膠原蛋白提取率的影響Fig.7 Effects of extraction of pH on the extraction rate of collagen

2.2 正交試驗

2.2.1 超聲－風(fēng)味酶法 從表3比較R值的大小可知，影響超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白因素的主次順序依次為:酶解溫度(D)＞超聲時間(B)＞風(fēng)味蛋白酶加酶量(A)＞酶解時間(C)，由此可見，酶解溫度對膠原蛋白的提取率影響最大。其提取條件的最佳組合為A3B1C1D1，即風(fēng)味蛋白酶5000 U/g，超聲時間60 min，酶解時間4 h，酶解溫度40℃，在此條件下，膠原蛋白提取率為3.45% ±0.07%;表3的9個實驗組中最佳組合為A3B3C2D1，即風(fēng)味蛋白酶5000 U/g，超聲時間80 min，酶解時間5 h，酶解溫度40℃，在此條件下，膠原蛋白提取率為3.54% ±0.21%。因此，A3B3C2D1為實驗最佳條件組合。表4超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白方差分析表可以看出，4種因素中，超聲時間對超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白提取率的影響差異性顯著(p＜0.05)。

表3 超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of ultrasonic flavor enzymatic extraction of collagen

2.2.2 超聲－堿性酶法 從表5比較R值的大小可知，影響超聲－堿性酶法提取膠原蛋白因素的主次順序依次為酶解時間(C)＞超聲時間(B)＞酶解溫度(D)＞堿性蛋白酶加酶量(A)。其提取條件的最佳組合為A2B3C3D3，即堿性蛋白酶5000 U/g，超聲時間80 min，酶解時間6 h，酶解溫度45℃，在此條件下，膠原蛋白提取率為2.77% ±0.08%;表5的9個實驗組中最佳組合為A1B3C3D3，即堿性蛋白酶4000 U/g，超聲時間80 min，酶解時間6 h，酶解溫度45℃，在此條件下，膠原蛋白提取率為3.25% ±0.68%，因此，最終選擇A1B3C3D3為實驗最佳條件組合。由表6超聲－堿性酶法提取膠原蛋白方差分析表可以得出，酶解時間差異性顯著(p＜0.05)。

表5 超聲－堿性酶法提取膠原蛋白正交試驗結(jié)果Table 5 Orthogonal test results of ultrasonic alkaline extraction of collagen protein

表6 超聲－堿性酶法提取膠原蛋白方差分析表Table 6 Analysis of variance of collagen extracted by ultrasonic alkaline enzyme method

2.3 超聲－風(fēng)味酶法與超聲－堿性酶法的比較與分析

從表7可以看出，超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白提取率為3.54%±0.21%，超聲－堿性酶法提取膠原蛋白提取率為3.25%±0.68%。超聲－風(fēng)味酶法的酶解時間比超聲－堿性酶法少1 h，而超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白提取率比超聲－堿性酶法高0.29%?？梢哉f明超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白效果更好。

表7 兩種提取方法的結(jié)果比較Table 7 Comparison of the results of two extraction methods

表4 超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白方差分析表Table 4 Analysis of variance of collagen extracted by ultrasonic flavor enzyme method

3 結(jié)論

對超聲波輔助酶法提取膠原蛋白的工藝進行優(yōu)化。超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白最佳組合為風(fēng)味蛋白酶5000 U/g，超聲時間80 min，酶解時間5 h，酶解溫度40℃，在此條件下得到膠原蛋白提取率為3.54%±0.21%。超聲－堿性酶法提取膠原蛋白的最佳組合堿性蛋白酶4000 U/g，超聲時間80 min，酶解時間6 h，酶解溫度45℃，在此條件下得到膠原蛋白提取率為3.25%±0.68%。由此得出，超聲時間都為80 min時，超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白的酶解時間比超聲－堿性酶法少1 h，且提取率還高出0.29%。說明超聲－風(fēng)味酶法提取膠原蛋白的方法更佳。通過這種方法解決了廢棄魚皮的再利用，而且為膠原蛋白生產(chǎn)工業(yè)提供較大的實際利用價值，對鮟鱇魚皮的綜合利用具有一定的指導(dǎo)意義。