張 雯，王學川，李丹妮

(1.陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安710021;2.陜西科技大學輕工科學與工程學院，陜西西安710021)

細菌纖維素(Bacterial cellulose，BC)指由生長在液態(tài)含糖基質中的細菌產(chǎn)生，并分泌到基質中的纖維素，是葡萄糖以β－1，4糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，呈半透明凝膠狀，因其是由細菌合成而命名為BC。BC對人體有許多獨特的功能，如增強消化功能、預防便秘、吸附與清除食物中有毒物質、優(yōu)化消化系統(tǒng)內環(huán)境而起到抗衰老作用等［1－2］。BC被認為是目前發(fā)現(xiàn)的性能最為優(yōu)良的膳食纖維之一，對人體健康有諸多益處，被稱作“白色金礦”［3］，深受廣大消費者的喜愛。BC除了具備上述膳食纖維的優(yōu)良性能外，還具有滑爽、嫩脆、細膩等獨特的口感，同時其高保水性、高復水性、高凝膠強度、良好的彈性以及乳化穩(wěn)定性等優(yōu)良特性，使其能夠作為食品中的增稠劑、成型劑、分散劑、乳化劑、穩(wěn)定劑［4－10］，在食品工業(yè)中具有廣闊的應用前景［11］。

由于BC分子內部和分子間復雜的氫鍵及較高的結晶度［12］，使其難溶于水和一般有機溶劑，在作為食品添加劑使用過程中，不易變形及改性，使其應用受到較大限制。因此BC的溶劑選擇和溶解工藝的優(yōu)化成為了研究熱點。在眾多纖維素的新型溶劑體系中，離子液體以其無味、低蒸汽壓、良好的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性、優(yōu)良的纖維素溶解能力等特性得到了廣泛關注，被認為是替代揮發(fā)性有機溶劑的新型綠色溶劑［13］。咪唑類氯鹽氯化－1－烯丙基－3－甲基－咪唑(1－allyl－3－methylimidazolium chloride，AmimCl)中存在大量的游離態(tài)Cl－，以其較強的電負性結合纖維素中羥基上的H原子，大大削弱了纖維素分子間和分子內的氫鍵作用;因離子液體的陽離子側鏈上含強極性烷基鍵，使其更易與纖維素形成絡合物，從而進一步削弱纖維素的氫鍵作用。因此，隨著離子液體的不斷滲入，纖維素聚集態(tài)結構逐漸被破壞，最終被溶解［14］。

本研究擬采用AmimCl溶解BC，研究其最優(yōu)溶解工藝，同時利用傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T－IR)、X－射線衍射(X－Ray diffraction，XRD)、掃 描 電 鏡 (Scanning electron microscope，SEM)及熱重－差示掃描量熱(Thermogravimetric analysis－differential scanning calorimetry，TG－DSC)等現(xiàn)代檢測技術研究溶解前后BC的材料學性能變化，探索離子液體溶解過程對BC的影響，以期為BC提供一種新型高效溶解途徑，為BC作為食品添加劑進行廣泛應用奠定一定的理論技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種:木糖葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter xylinus) 本實驗室保藏;AmimCl、1，3－二甲基－2－咪唑啉酮(DMI)、溴化1－乙基－3－甲基咪唑 上海笛柏生物科技有限公司;固體培養(yǎng)基 蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、磷酸氫二鈉4.40 g、檸檬酸0.80 g、瓊脂18.00 g、乙醇10 mL、自來水1000 mL、pH6.0;種子培養(yǎng)基 蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、磷酸氫二鈉4.40 g、檸檬酸 0.80 g、乙醇 10 mL、自來水 1000 mL，pH6.0;基本發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖50.00 g、牛肉膏15.00 g、乙醇10 mL、酒糟水解液1000 mL，p H6.0;其余試劑國產(chǎn)分析純或生化試劑。

S－4800電鏡掃描儀 日本日立公司;D/max2200PC全自動X－射線衍射儀 日本Rigalcu;VERTEX 70傅立葉變換紅外光譜儀 德國 Brucher公司;STA449F3－1053－M熱重分析儀 德國耐馳儀器制造有限公司;MG250B恒溫培養(yǎng)箱、HYG－1A恒溫振蕩器 上海新瑞儀器有限公司;XPS－8CA偏光顯微鏡 上海光學儀器有限公司;752型紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 BC的制備 斜面培養(yǎng):將木糖葡糖酸醋桿菌接種至斜面培養(yǎng)基中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d得活化木糖葡糖酸醋桿菌;種子液制備:將活化木糖葡糖酸醋桿菌接種至種子培養(yǎng)基中，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，之后將培養(yǎng)液于30℃，160 r/min振蕩30 min以釋放菌體細胞，得種子液;發(fā)酵培養(yǎng):將種子液以20%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基(裝液量30 mL/250 mL三角瓶)，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)10 d。

1.2.2 BC膜處理 將發(fā)酵液表面所形成的BC膜浸泡于0.10 mol/L NaOH溶液中，80℃下水浴30 min，之后繼續(xù)加熱煮沸2 h，再用蒸餾水反復沖洗至p H為 7.0［15－16］，處理后的 BC 進行冷凍干燥(需稱重的樣品在冷凍干燥后置于鼓風干燥箱中，105℃條件下繼續(xù)干燥至恒重)。

1.2.3 利用偏光顯微鏡觀察BC在AmimCl中的溶解過程 將SMART－POL－T偏光顯微鏡的熱臺加熱至110℃，在蓋玻片上滴一滴AmimCl，用鑷子從細菌纖維素上撕取少量纖維放入離子液體中浸潤，迅速用另一蓋玻片蓋緊，實時觀察溶解過程，并以一定的時間間隔(30～60 s)跟蹤拍攝，直至完全溶解。

1.2.4 不同配比復合溶劑對BC溶解的影響 分別稱取 AmimCl和 DMI共計10 g，使之配比分別為10∶0、8∶2、6∶4、4∶6，置于 250 mL 燒瓶中，110 ℃ 油浴，分別加入BC，每次加量為0.10 g，至總加入量為0.50 g，觀察并記錄溶解時間。

1.2.5 溶解溫度對BC溶解的影響 稱取復合溶劑10 g(AmimCl∶DMI=8∶2)分別置于溫度為 90、100、110、115℃的油浴鍋中，分別加入0.10 g BC，待其溶解后以0.10 g的增量繼續(xù)加入BC，并記錄每次溶解時間，直到加量達到0.50 g為止。繪制溶解時間隨溶解溫度的變化曲線。

1.2.6 投料量對BC溶解的影響 稱取復合溶劑10 g(AmimCl∶DMI=8∶2)置于 250 mL 燒瓶中，110℃下油浴，分別以投料量1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0% 加入BC，觀察并記錄溶解時間。

1.2.7 BC的再生 上述1.2.4～1.2.6實驗中，BC溶解完成后趁熱以12000 r/min離心10 min，分離得到透明的BC/IL溶液和未溶解BC，用去離子水洗去未溶解BC上的離子液體，干燥后稱重，記為W。上清液轉移至燒杯中，分別加入五倍量的重蒸水作為沉淀劑，劇烈攪拌1 h，靜置10 h，12000 r/min條件下離心10 min，收集沉淀進行干燥得再生 BC，稱重，記為W1。分別按照下式計算BC溶液質量分數(shù)及BC再生率。

式中:W0為所投入BC干重(g)，W為未溶解BC干重(g)，W1為再生BC干重(g)。

1.2.8 離子液體溶解對BC性能的影響 離子液體溶解之前的BC記為BC－DZ，再生后的BC記為BCYP。利用FT－IR、XRD、SEM 及 TG－DSC 對 BC－YP及BC－DZ進行檢測，研究離子液體溶解對BC性能的影響。

1.2.8.1 基團分析 采用傅里葉紅外光譜［16］進行分析。樣品處理:取適量樣品采用KBr壓片法進行壓片，放入紅外光譜儀中進行測定，掃描范圍400～4000 cm－1，設定分辨率4 cm－1，掃描速度為0.2 cm/s，室溫下操作。

1.2.8.2 結晶度分析 采用X－射線衍射光譜［16］進行分析。樣品處理:樣品平整固定在樣品架上，銅靶，測試電壓40 kV，測試電流100 mA，速率5°/min，步寬0.02°，2θ為0～80°范圍掃描。根據(jù)X衍射參數(shù)，由下面兩個計算公式分別計算細菌纖維素的結晶度(Xc)和晶體的粒徑L。

式中:I為衍射峰的衍射強度;Iam為無定形區(qū)衍射強度;β為半峰寬(rad);k為常數(shù)，通常取0.89;λ為X射線波長(0.15406 nm);θ為布拉格衍射角。

1.2.8.3 表面形貌分析 采用掃描電鏡［16］進行分析。樣品處理:處理后的凍干樣品置于液氮中，脆斷處理，制樣，噴金鍍膜后利用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結構，電壓25 kV。

1.2.8.4 熱穩(wěn)定性分析 采用熱重分析儀進行分析。溫度范圍0～800℃，升降溫速率10℃/min，稱量范圍5～10 mg(小樣品坩堝)，氮氣氣氛。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)作三次平行，結果以平均值±SD表示，用 SPSS(PASW Statistics18)軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結果分析

2.1 偏光顯微鏡下觀察BC在離子液體AmimCl中的溶解過程

圖1所示為BC在離子液體AmimCl中的溶解過程PLM圖像。實驗結果直觀反映了離子液體AmimCl對于BC有較強的溶解能力。在偏光顯微鏡下觀察到BC呈白色桿狀晶體，隨著受熱時間的延長，纖維素出現(xiàn)部分溶解現(xiàn)象，結構變得疏松、縱裂和破碎。110℃條件下，纖維素晶體在30 min內完全溶解于AmimCl中，最后在視野中消失。實驗過程中可觀察到，在溶解初始階段，BC溶解速度較快，11 min以后溶解速度減慢，可能與溶液粘度隨著BC溶解量的增加而增加有關［13］。離子液體 AmimCl中存在大量的游離態(tài)Cl－，以其較強的電負性結合BC中羥基上的H原子，大大削弱了BC分子間和分子內的氫鍵作用。同時，因離子液體的陽離子側鏈上含強極性烷基鍵，使其更易與BC形成絡合物，從而進一步削弱BC內部氫鍵作用［14］。因此，隨著離子液體的不斷滲入，BC聚集態(tài)結構逐漸被破壞，最終被溶解。

圖1 BC在［AMIM］Cl中的溶解過程PLM圖像Fig.1 PLM images of BC dissolving in［AMIM］Cl at different time注:(A)3 min;(B)9 min;(C)11 min;(D)16 min;(E)19 min;(F)30 min。

2.2 不同配比復合溶劑對BC溶解時間的影響

不同配比復合溶劑對BC溶解時間的影響結果如圖2所示。由圖2可知，當 AmimCl∶DMI=4∶6，投料量為1.0%時，BC充分溶解需240 min，投料量增大至2.0%，在溶解時間為10 h時仍未觀察到BC完全溶解。分析其原因主要是因為，復合溶劑中起溶解作用的AmimCl含量過低，含量較高的 DMI對BC只能起到溶脹作用，因此BC在有限時間內不能完全溶解;而當 AmimCl∶DMI=10∶0時，投料量 1.0% ～5.0%的BC在純溶劑AmimCl中溶解所需時間也較長。當DMI在復合溶劑中的比例大于0且小于60%時，BC溶解時間縮短，表明其溶解速率有所提高，當BC投料量為4.0%及5.0%時，復合溶劑為AmimCl∶DMI=8∶2時BC溶解時間最短。DMI雖然不是BC的良好溶劑，卻能夠對 BC進行溶脹，進而縮短離子液體AmimCl溶解BC的時間，同時DMI能夠降低BC溶液的粘度，加速 BC 溶解。Rinaldi［17］發(fā)現(xiàn)，BMIMCl中添加適量DMI能夠加速纖維素的溶解，實驗結論與本研究一致。待溶解反應結束后，利用水作為沉淀劑對BC溶液進行再生，實驗結果如表1所示。

表1 不同配比復合溶劑溶解BC后的再生率Table 1 BC regeneration after dissolved in different ratio of double solvents

表1為投料量5%的BC在不同配比復合溶劑中溶解后BC的再生率。由表1可知，當AmimCl∶DMI=8∶2時BC再生率最高，達40.2%。當AmimCl作為純溶劑溶解BC以及AmimCl∶DMI=6∶4時，BC再生率相對較低。由圖2可知，BC在這兩種復合溶劑中溶解所需時間相對較長，因此BC在溶解過程中所發(fā)生的降解程度也相對較大，使其再生率降低［12］。綜上最優(yōu)復合溶劑配比為 AmimCl∶DMI=8∶2。

圖2 復合溶劑配比對BC溶解時間的影響Fig.2 Effect of ratio of double solvents on BC dissolution time注:當 AmimCl∶DMI=4∶6，投料量大于 1.0%時，實驗過程中溶解10 h所投入BC仍不能完全溶解，因此沒有溶解時間數(shù)據(jù)。

2.3 溶解溫度對BC溶解時間的影響

由圖3可知，在相同投料量下，隨著溫度的升高，BC溶解所需時間縮短，其中，溶解溫度為90℃時所需溶解時間最長，115℃時所需溶解時間最短，表明溫度升高可使BC溶解速率加快。分析其原因主要是因為，溫度升高有利于加強BC分子鏈上的氫與AmimCl中Cl－之間的相互作用，使BC分子內和分子間氫鍵被破壞，使BC溶解速率增加。同時，高溫條件可使溶解后的BC聚合度降低，BC溶解液黏度變小，流動性增加，從而進一步加速BC的溶解［18］。待溶解結束后，利用水作為沉淀劑對BC溶液進行再生，實驗結果如表2所示。

圖3 溫度對BC溶解時間的影響Fig.3 Effect of temperature on BCdissolution time

表2 不同溫度下BC溶解后的再生率Table 2 BCregeneration after dissolved under different temperature

表2為投料量5.0%的BC在不同溫度條件下溶解后的再生率。由表2可知，雖然在溫度為115℃時，BC溶解速率最快，但溫度過高引起B(yǎng)C損失反而使其再生率較低;115℃時的BC再生率達到33.4%，因此確定BC最優(yōu)溶解溫度為110℃。其中溶解溫度為90、100℃時再生率較低，可能與BC溶解時間過長引起的損失有關。

2.4 投料量對BC溶解時間的影響

由圖4可看出，BC投料量從1.0%增加至5.0%的過程中曲線斜率較小，實驗數(shù)據(jù)表明BC投料量每增加0.10 g，BC溶解所需時間增加10 min，表明此階段隨著BC投料量增加，BC溶解所需時間增加幅度不大，BC溶解速率較快。BC投料量大于5.0%時，曲線斜率增大，實驗數(shù)據(jù)表明BC投料量增加0.10 g，BC溶解所需時間增加40 min，BC溶解所需時間延長，表明此階段BC溶解速率變小。當BC投料量增至7.0%時，曲線斜率繼續(xù)增大，實驗數(shù)據(jù)表明BC投料量增加0.10 g，BC溶解所需時間增加60 min，表明隨著溶液中BC濃度的增加，BC溶解速率不斷減小，溶解更多的BC已十分困難。實驗過程中同樣觀察到，BC溶解初始階段溶液較稀薄，隨著BC的溶解，溶液逐漸變得粘稠，這與BC較大的分子量以及其較高的結晶度有關［6，13］。實驗結果與BC溶解過程PLM結果一致。溶解結束后經(jīng)計算可得，在10 g復合溶劑(AmimCl∶DMI=8∶2)中，溶解溫度為 110 ℃，溶解時間為11 h條件下，BC/IL溶液中BC質量分數(shù)可達6.5%。

圖4 投料量對BC溶解時間的影響Fig.4 Effect of inventory on BC dissolution time

2.5 離子液體溶解對BC性能的影響

2.5.1 BC及再生BC紅外光譜分析 圖5為BC經(jīng)AmimCl溶解，水沉淀再生前后的FT－IR圖譜。由圖5可知，BC－DZ和BC－YP峰形極其相似，說明在BC溶解及再生過程中并不發(fā)生纖維素的衍生化過程，即BC的溶解過程為物理過程。圖5所示紅外圖譜中，3402 cm－1處為－OH的伸縮振動特征吸收峰;2894 cm－1附近為 C－H 伸縮振動特征峰;1428、1381 cm－1附近為 C－H 彎曲振動特征峰;1034、1059以及1112 cm－1處為醇中的 C－O的伸縮振動特征峰，表明BC在溶解過程中并沒有引入新的基團。相比于 BC－DZ，BC－YP 在3000～3500 cm－1范圍內的氫鍵O－H振動峰變窄，表明再生BC中的氫鍵在溶解再生過程中出現(xiàn)了一定程度的破壞。同時FT－IR譜圖表明，再生BC在1428 cm－1處的吸收峰變弱變寬，而在899 cm－1處的吸收峰明顯增強。這兩處的紅外吸收強度變化與材料的結晶度變化有關，表明BC經(jīng)過溶解再生后結晶度有所改變［19－20］。

圖5 離子液體溶解再生前后BC FT－IR圖譜Fig.5 FT－IR spectra of regenerated BC before and after IL－dissolution

2.5.2 BC及再生BC X－射線衍射分析 圖6為BC經(jīng)AmimCl溶解，水沉淀再生前后的XRD圖譜。由圖6可知，BC的XRD圖譜主要有3個衍射峰，分別是14.25、16.65 和 22.45，對應(101)、(101)和(002)晶面，與Ⅰ型纖維素的結晶峰位移基本一致，說明BC溶解之前屬于Ⅰ型纖維素［21］。溶解再生之后，BC的結晶峰位移與溶解之前基本一致，而結晶度由原來的51.99%下降至31.29%。這是由于大分子溶劑在溶解過程中破壞了纖維素分子之間的氫鍵作用，從而破壞了纖維素分子的有序排列，使其結晶度下降［13］。

圖6 離子液體溶解再生前后BC XRD圖譜Fig.6 XRD spectra of regenerated BC before and after IL－dissolution

2.5.3 BC及再生BC SEM形貌分析 圖7為BC經(jīng)AmimCl溶解，水沉淀再生前后的SEM圖像。由圖可知，溶解再生之前BC纖維表面光滑，微觀纖絲排列整齊有序，粗細較均勻，溶解再生之后，BC表面出現(xiàn)很多裂縫及孔洞，變得凹凸不平，微纖絲堆積不緊密。BC在AmimCl中的溶解機理為:溶劑中游離態(tài)Cl－以其較強的電負性結合BC中羥基上的H原子，削弱BC分子間和分子內的氫鍵作用。同時因離子液體的陽離子側鏈上含強極性烷基鍵，與BC形成絡合物從而進一步削弱BC內部氫鍵作用。溶解過程中離子液體不斷滲入，使BC聚集態(tài)結構逐漸被破壞，而再生過程并未完全恢復BC的聚集態(tài)結構，因此出現(xiàn)圖示再生前后 BC 形貌變化［13，21］。

圖7 離子液體溶解再生前(A)后(B)BC SEM圖譜Fig.7 SEM spectra of regenerated BC before(A)and after(B)IL－dissolution

2.5.4 BC及再生BC TG－DSC分析 圖8為經(jīng)BC經(jīng)AmimCl溶解，水沉淀再生前后的TG－DSC圖譜。由圖8可知，BC的 DTG圖譜所示峰值出現(xiàn)在214.3℃和329.0℃，溫度升高至214.3℃時，質量損失24.29%，溫度達800℃時質量損失74.01%;再生BC的DTG圖譜所示峰值出現(xiàn)在301.3℃時，溫度升高至301.3℃時，質量損失31.78%，800℃時質量損失77.31%。這是由于BC/IL溶液中的離子鍵破壞了BC中的部分氫鍵，使得再生BC熱穩(wěn)定性有所降低。同時再生過程使得BC晶區(qū)結構受到部分破壞，有序程度降低，“晶區(qū)”與“非晶區(qū)”的差別變小，因而再生BC結晶峰小于原BC樣品的結晶峰，與XRD的結果一致。

圖8 離子液體溶解再生前(A)后(B)BCTG－DSC圖譜Fig.8 TG－DSCspectra of regenerated BC before(A)and after(B)IL－dissolution

3 結論

利用PLM技術觀察BC在離子液體AmimCl中的溶解過程，表明離子液體AmimCl對BC具有良好的溶解性能，可作為一種BC的新型溶劑。工藝優(yōu)化研究確定其最優(yōu)溶解工藝為:溶解溫度為110℃，復合溶劑比為AmimCl∶DMI=8∶2，溶解時間為11 h條件下，BC/IL溶液中BC質量分數(shù)可達6.5%。利用FT－IR、XRD、SEM、TG－DSC 對 IL溶解再生前后 BC化學基團、結晶性能、微觀結構進行了比較，表明離子液體AmimCl溶解再生細菌纖維素屬于物理過程，其化學結構不受影響，溶解再生后的BC結晶度及熱性能有所降低，纖維表面出現(xiàn)很多裂縫及孔洞，微纖絲堆積變得松散。本研究為BC實際應用過程中難溶解的問題提供了新的思路，為BC改性奠定了理論及技術基礎。