田 浩，王志偉，顧文佳，曲勤鳳

(上海市質量監(jiān)督檢驗技術研究院，上海200233)

葉酸，是一種重要的水溶性B族維生素，作為一碳單位的重要前體物質，參與到人體內許多重要的細胞通路循環(huán)中，包括DNA、RNA和蛋白質的甲基化和DNA合成、修復等［1］。居民膳食中的新鮮水果、蔬菜和肉類等食品富含天然葉酸，然而天然葉酸并不穩(wěn)定，容易在食物的儲存、烹飪過程中損失［2］。人工合成的葉酸性質穩(wěn)定，被廣泛用作營養(yǎng)強化劑［3］。學界普遍認為，葉酸強化食品可以降低神經管缺陷風險［4］，并推薦孕產婦群體補充葉酸［5－6］。國家強制標準規(guī)定葉酸是嬰幼兒配方食品、特殊醫(yī)學用途配方食品等食品的必需成分，消費者也越來越重視食品中維生素的含量。在此背景下，食品企業(yè)相繼加大了強化葉酸食品的研發(fā)力度。

國標《GB 5009.211－2014食品安全國家標準食品中葉酸的測定》是現(xiàn)行有效的葉酸檢測標準，其主要原理是利用鼠李糖乳桿菌Lactobacillus casei spp.Rhamnosus(ATCC 7469)生長過程中對葉酸需求的特異性，在一定控制條件下，將鼠李糖乳桿菌液接種至預先加入待測樣品提取液的培養(yǎng)液中，根據(jù)葉酸含量與透光率(或吸光度值)的標準曲線，計算出待測樣品中葉酸的含量。該國標方法規(guī)定了三大類食品的測定方法，包括果蔬類，蛋白質、淀粉含量高的試樣和營養(yǎng)強化劑和強化食品［7］。此外，針對不同含量葉酸食品的測定，國內外學者也提出了許多相應的方法，主要有化學發(fā)光測定法［8］、高效液相色譜法［9－13］、分光光度法［14－16］、ELISA 法［17－18］、改良微生物法［19－23］等。這些方法各有優(yōu)勢，對葉酸含量較高、較低樣品的測定均有探討，所用方法的檢測時長不一，檢測靈敏度也有所差別［24］。國標所使用的微生物法通常耗時3～4 d，且步驟復雜，對檢測人員素質和所用儀器狀態(tài)要求很高。當需要測定葉酸含量范圍未知的樣品時，檢測人員很難確定樣品稱樣量。因此，對國標方法進行改進和優(yōu)化是十分必要的。

本文在國標GB 5009.211－2014方法的基礎上進行了改進，利用鼠李糖乳桿菌生長過程中對葉酸需求的特異性，使用一次性離心管替代玻璃試管作為培養(yǎng)容器，同時將整個培養(yǎng)體系縮小至1 mL，培養(yǎng)時間縮短為8～12 h，在對得到的吸光度數(shù)據(jù)簡單換算后，得到待測樣品葉酸含量范圍，并進行方法學考察，與國標法進行對比，判斷其是否具有可行性，為最終使用國標方法準確測定提供樣品葉酸含量范圍的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葉酸標準品 Supelco，純度≥97%;嬰幼兒配方乳粉 市售;復合維生素預混料、孕婦餅干 市售;葉酸含量不明的植物提取物1(液態(tài))、植物提取物2(固態(tài)) 科研樣品，云南農業(yè)大學;鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus casei)ATCC 7469 北京陸橋;葉酸測定用培養(yǎng)基 (碧迪);甲鹽溶液、乙鹽溶液、瓊脂培養(yǎng)基 按國標要求配制;改良MARS培養(yǎng)基 北京陸橋;所有試劑 均為分析純。

SX－700高壓滅菌鍋 TOMY;SHP－250恒溫培養(yǎng)箱 SHELLAB;infinite M200全波長多功能微孔板分析系統(tǒng) TECAN;Vortex Genie 2渦旋振蕩器 美國 Scientific Industrise，Inc。

1.2 實驗方法

1.2.1 工作菌液培養(yǎng)物的制備 將保存的鼠李糖乳桿菌轉接至瓊脂培養(yǎng)基上，在(37±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24 h，再傳種1代。挑取單菌落到葉酸測定用培養(yǎng)基，(36±1)℃在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后，移取1 mL上述帶菌培養(yǎng)液，加入2 mL無菌離心管中，再加入1 mL無菌甘油，放入－20℃冰箱中儲存［25］。每批儲存菌液可保存3個月。使用時，吸取0.5 mL儲存菌液接種到10 mL葉酸測定用培養(yǎng)基，(36±1)℃活化培養(yǎng)6 h后即可作為工作菌液培養(yǎng)物立即使用。若不能立即使用，工作菌液培養(yǎng)物在4℃冰箱中可保存不超過1周。

傳代方法:沾取一環(huán)工作菌液培養(yǎng)物劃線接種于改良MRS平板上，(36±1)℃厭氧培養(yǎng)(72±2)h，之后保存于2～5℃低溫冰箱。測定前，用接種環(huán)小心挑取少量單菌落，接種于10 mL葉酸測定用培養(yǎng)基中，置于(36±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出后放入4℃冰箱中儲存，1周內用完。同時記錄菌種代數(shù)，傳代一般不超過5代。

1.2.2 樣品測定液的制備 樣品測定液制備參照國標要求進行。根據(jù)樣品分類，固態(tài)和半固態(tài)樣品分別進行粉碎、研磨、過篩，液態(tài)樣品用前搖勻備用;

本文采用粗提手段快速確定樣品中葉酸的含量范圍。稱取1 g樣品到50 mL離心管中，用氫氧化鈉乙醇溶液定容至40 mL，于121℃(0.10～0.12 MPa)高壓滅菌15 min，取出后快速冷卻至室溫。在超凈工作臺內使用無菌過濾器過濾，得到樣品工作液原液。使用無菌水對工作液原液進行10倍梯度稀釋，得到一系列工作液稀釋液。最高稀釋度根據(jù)對樣品含量的估計，自行選擇。一般地，嬰幼兒配方奶粉最高稀釋度不宜超過300倍，維生素預混料稀釋度范圍在103～105倍，含量較低的天然食品稀釋度不宜超過100倍。

1.2.3 標準曲線溶液的制備 參照國標要求，在超凈工作臺內使用無菌過濾器過濾標準工作溶液，相當于標準系列管中的葉酸含量分別為0.00、0.01、0.04、0.06、0.08、0.10 ng，備用。每隔一周應重復此步驟，將標準曲線數(shù)據(jù)與以前的數(shù)據(jù)對比，若同一標準點的吸光度值出現(xiàn)顯著變化，應重新評估本法的檢出限范圍和線性范圍。

1.2.4 接種和培養(yǎng) 在無菌操作條件下，向每個已滅菌的離心管內加入1.2.1制備的工作菌液培養(yǎng)物500μL，隨后加入1.2.2制備的樣品測定液稀釋液作為測定組;在相同的條件下，加入1.2.3制備的標準工作液作為標準曲線組。兩組同時在每管中加入400μL無菌蒸餾水，充分混勻。一個樣品液或標準工作液重復3次。培養(yǎng)物總體積為1 mL。設置陰性對照，將樣品測定液稀釋液替換為不含葉酸的生物素溶液;設置空白對照，將樣品測定液稀釋液替換為無菌蒸餾水。將培養(yǎng)物置于(37±1)℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～12 h。

1.2.5 葉酸含量的測定 將1.2.4中培養(yǎng)過的培養(yǎng)物用漩渦振蕩儀混勻。按照標準工作溶液、待測試樣、陰性對照、空白對照的順序，向酶標板孔加入上述300μL培養(yǎng)物，同一管培養(yǎng)物做3個平行孔。在620 nm波長條件下讀取各培養(yǎng)物的吸光度值。其中陰性對照、空白對照應無細菌生長，吸光度值應在0.1以下，否則可能混入不明來源葉酸或者接種菌液中含有殘余葉酸;標準曲線、待測試樣最高吸光度不宜超過1.0，否則應減少菌液接種量。

1.2.6 標準曲線的繪制 以標準工作溶液的葉酸含量為橫坐標X，每個標準點的吸光度值為縱坐標Y，繪制標準曲線。標準曲線決定系數(shù)R2應大于0.98。得到的標準曲線方程為Y=4.590X+0.07360，R2=0.9904。

1.2.7 樣品葉酸含量的計算 從標準曲線查得樣品培養(yǎng)物中葉酸的相應含量(cx)，且各EP管之間查得的葉酸含量的偏差小于15%，則可按照式(1)進行結果計算;否則需重新取樣測定。

式中，X:待測樣品中葉酸含量，單位為微克每百克(μg/100 g);cx:從標準曲線上查得的菌懸液培養(yǎng)物離心管中葉酸含量，單位為納克(ng);k1:由1.2.2制備的樣品測定液工作液原液對應的1 g樣品的定容體積，單位為mL;k2:由1.2.2制備的樣品測定液工作液原液的稀釋倍數(shù)。

1.2.8 方法檢出限范圍的確定 本方法檢出限定義為:加菌培養(yǎng)物培養(yǎng)12 h后，菌懸液吸光度高于空白對照吸光度0.1的樣品中葉酸的最低含量。該方法檢出限與每次測試時的菌種狀態(tài)、加菌量密切相關。因此，作為一種快速估算方法，已知樣品稀釋倍數(shù)的情況下，樣品含量的下限范圍可以根據(jù)式(2)檢出限范圍快速估算，且估算含量的準確度與方法檢出限的范圍大小密切相關。在本實驗室中進行的重復試驗證明，該方法檢出限范圍較小，精密度較高。

式中，X:待測樣品中葉酸含量，單位為微克每百克(μg/100 g);cn:方法檢出限，單位為微克每百克(μg/100 g);kmax:葉酸濃度高于檢出限的最大稀釋度。

1.2.9 方法線性范圍的確定 本方法線性范圍的定義為:加菌培養(yǎng)物在過夜(12 h以上)培養(yǎng)后，菌懸液吸光度與培養(yǎng)物中葉酸含量成線性相關的葉酸含量范圍。同樣地，該方法線性范圍與測試時菌種狀態(tài)，加菌量密切相關。同理，作為一種含量的快速估算方法，已知樣品稀釋倍數(shù)的情況下，樣品含量的上限范圍可以根據(jù)式(3)線性范圍快速估算，且估算含量的準確度與方法區(qū)間的范圍大小密切相關。

式中，X:待測樣品中葉酸含量，單位為微克每百克(μg/100 g);k1:由1.2.2制備的樣品測定液工作液原液對應的1 g樣品的定容體積，單位為mL;kmin:葉酸濃度低于線性范圍上限的最低稀釋度。

1.2.10 方法回收率范圍的確定 本方法回收率范圍的定義為:樣品待測液加菌培養(yǎng)物在過夜(12 h以上)培養(yǎng)后，選取多個時間點，取出該培養(yǎng)物分別測定吸光度值。根據(jù)(式1)計算出待測液葉酸含量并換算為葉酸添加量，與實際葉酸添加量的百分比。

2 結果與分析

2.1 方法的檢出限范圍

本實驗室按1.2.1制備測試菌液，并選擇一系列較低濃度的標準品進行了10次測試，每次測試記錄下吸光度高于空白對照吸光度0.01以上的標準品濃度。將該濃度換算成樣品含量，由低到高排列，得出在本實驗室條件下，樣品量為1 g，用氫氧化鈉乙醇溶液定容至40 mL時，利用現(xiàn)制測試菌液進行測定，方法檢出限范圍為0.4～0.8μg/100 g。

2.2 方法的線性區(qū)間范圍

在過夜培養(yǎng)(12 h以上)后，直到培養(yǎng)的第72 h，同一時間取出培養(yǎng)物讀取吸光度值，同一批測試的線性區(qū)間不會隨著時間的推移發(fā)生明顯變化，但是菌懸液吸光度隨時間增大。

本實驗室按1.2.1制備測試菌液，并選擇一系列濃度標準品進行了10次測試，每次測試記錄下本方法線性范圍，得出在本實驗室條件下，利用現(xiàn)制測試菌液進行測定，方法線性范圍為0.01～0.08 ng。

2.3 方法的回收率范圍

經過實驗室多次試驗，該方法的回收率范圍與測試時菌種狀態(tài)，加菌量無顯著關系。同一時間取出培養(yǎng)物讀取吸光度值，同一批測試的回收率不會隨著時間的推移發(fā)生明顯變化，但是菌懸液吸光度隨時間增大。本實驗室按1.2.1制備測試菌液，分別添加10、40、80μg葉酸標準品，按式(1)推算待測液含量，分別進行6次測定，加標回收率測定結果如表1所示，得出本方法回收率范圍為:82.1%～108.0%。

表1 加標回收率測定結果Table 1 Results of recovery test(n=6)

2.4 快速確定樣品的含量范圍

取市售嬰幼兒配方乳粉、復合維生素預混料、葉酸含量不明的植物提取物樣品，按1.2.2制備樣品溶液，記錄稀釋倍數(shù)k1。隨后將樣品測定液10倍梯度稀釋，作為待測液加入含菌培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過夜(12 h以上)。隨后取出，測定菌懸液吸光值。將稀釋倍數(shù)的lg值為橫坐標，菌懸液吸光度值為縱坐標，繪制散點圖，結果如圖2所示。

圖2 3類典型樣品測定結果Fig.2 Results of three typical samples注:A:復合維生素預混料測定結果。菌懸液吸光度均大于1.0，數(shù)據(jù)點無顯著線性關系;B:植物提取物1樣品測定結果。菌懸液吸光度均小于0.1，數(shù)據(jù)點無顯著線性關系;C:嬰幼兒配方乳粉樣品測定結果。至少有一菌懸液吸光度位于0.1～1.0之間，且其中相鄰兩點或三點的趨勢線與剩余各點的趨勢線斜率有顯著區(qū)別。

圖A表示該樣品經過稀釋，最高稀釋度待測液內葉酸含量大于0.08 ng，記錄最高稀釋倍數(shù)k2，因此該樣品葉酸含量大于0.08×k1×k2;圖B表示該樣品經過稀釋，最低稀釋度待測液內葉酸含量小于0.01 ng，因此該樣品葉酸含量小于0.01×k1;圖C表示該樣品經過稀釋，有100倍稀釋度葉酸含量位于0.01～0.08 ng之間。因此該樣品葉酸含量范圍為0.01×k1×100～0.08×k1×100。

樣品葉酸含量范圍可以通過兩個方法驗證得到。對于葉酸含量相對較低的樣品，多次梯度稀釋得到大于方法檢出限葉酸含量的最大稀釋度kmax，由式(2)得到葉酸含量下限;同理，葉酸含量相對較高的樣品，多次梯度稀釋得到小于方法線性范圍上限葉酸含量的最小稀釋度kmin，由式(3)得到葉酸含量上限。

2.5 估算樣品的含量

若需估算樣品含量，可以在確定樣品含量范圍后，將該樣品稀釋到kmin倍后，依次進行4次2倍梯度稀釋，作為待測液加入含菌培養(yǎng)液中，另做兩管標準品含菌培養(yǎng)液，分別添加0.01、0.08 ng葉酸標準品，同時培養(yǎng)過夜(12 h以上)。隨后取出，測定菌懸液吸光度值。以葉酸含量為橫坐標，菌懸液吸光度值為縱坐標，繪制兩點連線。從兩點連線確立的直線方程換算出待測液葉酸含量，再根據(jù)式(1)估算出樣品含量。

本實驗室選取了4類檢測中遇到的葉酸含量未知的典型樣品，分別進行6次測定，將本方法與國標檢測結果進行對比，并分別取平均值和方差做t檢驗和F檢驗，結果見表2。

表2 國標檢測方法與本方法的比較(n=6)Table 2 Comparison of GB 5009.211－2014 method and microbiological method(n=6)

由此可見，除嬰幼兒配方奶粉外，本方法與國標法對其他樣品的測定平均值沒有顯著差異(p＞0.05)，但兩種方法平均值差值與算數(shù)平均值之比均小于11%。在較葉酸含量較高的復雜樣品(植物提取物2)的測定中，本方法相比國標法出現(xiàn)了較大的變異系數(shù)(p＜0.0001)。但總體來說，本方法可以較好地預估樣品葉酸含量范圍，估算葉酸含量也與國標測定方法接近。盡管對部分樣品的測定不如國標方法穩(wěn)定，但不影響它作為快速檢測方法提前預估樣品葉酸含量范圍的作用。為了更好地為國標法檢測服務，葉酸含量較高的樣品優(yōu)先計算其含量上限，相對地，葉酸含量較低的樣品優(yōu)先計算其含量下限。得到對應的上或下限后，根據(jù)國標法的要求，稱取相應的樣品量，因此可以保證樣品點均落在標準曲線范圍內，得到更加準確的結果。

3 結論

本文提出了一種快速測定食品中葉酸含量范圍的方法。該方法的檢出限范圍為0.4～0.8μg/100 g，線性范圍為0.01～0.08 ng，回收率范圍為82.1%～108.0%。相對于國標方法需要2～3 d時間測定，本方法只需1 d時間即可得到葉酸含量范圍，能在較短時間提供樣品葉酸含量范圍，且步驟簡潔，節(jié)約試劑材料。該方法可作為國標法測定葉酸含量的重要補充實驗，適用于葉酸含量存疑樣品的初步篩查或者數(shù)據(jù)確認。本文列舉了在實驗室內建立該檢測方法的關鍵步驟，包括菌懸液制備、方法檢出限確認、線性范圍摸索和數(shù)據(jù)處理。使用本方法和國標GB 5009.211－2014方法同時對4種典型樣品的葉酸含量進行測定，國標測定結果均落在本方法得到的葉酸含量范圍內。文中提出的方法建立步驟可為同行業(yè)者借鑒，希望可以提供自主研發(fā)微生物法葉酸測定試劑盒理論依據(jù)和實踐參考材料。