結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因擴增多重PCR體系的建立與評估

李自慧，潘麗萍，孫琦，等

摘要：目的：耐藥結(jié)核病的流行嚴重威脅全球結(jié)核病的控制。了解細菌耐藥情況有助于臨床醫(yī)生為患者及時選擇有效的抗結(jié)核藥物，但基于細菌培養(yǎng)技術(shù)的傳統(tǒng)表型藥物敏感性試驗（簡稱“藥敏試驗”）需要2～3 個月才能得到結(jié)果。已有的研究證實基因突變是導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌耐藥的重要原因，然而目前的耐藥基因突變檢測方法在敏感度和檢測的耐藥種類方面仍無法滿足臨床需求。聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是耐藥基因突變分子檢測的基礎(chǔ)。本研究針對目前已發(fā)現(xiàn)的多個結(jié)核分枝桿菌耐藥基因，建立多重PCR 擴增體系，評估該體系以不同來源結(jié)核分枝桿菌DNA 樣本為模板同時擴增多個耐藥基因的成功率。方法：結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株首先用溶菌酶（5 mg/mL）37℃過夜消化、蛋白酶K（1 mg/mL）及10%十二烷基硫酸鈉37℃孵育1 h，然后按照DNA 小量提取試劑盒（51304，Qiagen公司）說明書提取菌株DNA。菌陽肺結(jié)核患者的痰液首先采用N-乙酰-L-半胱氨酸氫氧化鈉液化、與玻璃珠混合后室溫劇烈渦旋，進行熱滅活后離心收集上清，再用常規(guī)乙醇沉淀法提取痰菌DNA。參照目前已發(fā)現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因及相關(guān)文獻，設(shè)計合成引物，優(yōu)化建立多重PCR 體系以擴增所有目的基因，并將擴增片段測序比對證實。最后分別以結(jié)核分枝桿菌臨床分離株DNA樣本和菌陽肺結(jié)核患者痰菌DNA 樣本為模板擴增，擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳，計算該多重PCR 體系同時擴增耐藥基因片段的成功率。結(jié)果：本研究針對臨床常用的8 種抗結(jié)核藥物（利福平、異煙肼、乙胺丁醇、氟喹諾酮、鏈霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素），選取結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG、inhA、embB、gyrA、rpsL、rrs、eis 這8 個較確切的耐藥基因，分別設(shè)計合成引物，最終利用2 個多重PCR 體系成功擴增了8 個DNA 片段。這些片段經(jīng)測序比對證實均為目的基因片段。優(yōu)化后的擴增條件為：95℃ 10 min，（95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 40 s）×30 個循環(huán)，72℃ 5 min。這些片段包含常見的耐藥基因突變位點，其中rpoB（1123～1531）、katG（438～1072）、gyrA（-29～394）、embB（852～1962）、rpsL（12 位點后區(qū)域）、rrs（1158 位點后區(qū)域）、inhA 和eis 覆蓋啟動子基因突變位點區(qū)域。以瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果同時顯示8 個耐藥基因片段為成功標準，該多重PCR體系擴增結(jié)核分枝桿菌臨床分離株DNA 模板的成功率為100.0%（47/47），擴增菌陽肺結(jié)核患者痰菌DNA 模板的成功率為76.2%（16/21）。結(jié)論：本研究建立了利用2 個多重PCR 高效擴增8 個結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因的體系，該體系擴增的基因片段包含了目前已發(fā)現(xiàn)的主要耐藥基因突變位點。本研究結(jié)果為進一步應(yīng)用測序、芯片雜交等技術(shù)確定突變形式奠定了基礎(chǔ)，對未來研發(fā)結(jié)核病耐藥分子診斷產(chǎn)品、快速預(yù)測患者耐藥類型、正確選擇抗結(jié)核藥物和控制耐藥結(jié)核病疫情具有重要意義。

來源出版物：中國防癆雜志, 2017, 39(8): 793-798

入選年份：2017

北京地區(qū)成人社區(qū)獲得性肺炎患者中肺炎支原體耐藥情況的多中心調(diào)查

尹玉東，曹彬，王輝，等

摘要：目的：了解北京地區(qū)成人社區(qū)獲得性肺炎（CAP）患者中肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯等常用抗生素的耐藥情況。方法：收集2010年9月至2012年6月北京地區(qū)解放軍總醫(yī)院、北京大學(xué)人民醫(yī)院、北京朝陽醫(yī)院3 家醫(yī)院就診的CAP 患者。選擇符合2006年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制定的CAP 診斷和治療指南中規(guī)定的診斷標準；年齡≥18 歲的患者。排除標準：（1）具有免疫抑制性疾病患者（包括接受實體器官、骨髓或干細胞移植者）；（2）接受化療的癌癥患者或長期（＞30 d）接受大劑量皮質(zhì)激素治療者；（3）先天性或獲得性免疫功能缺陷者；（4）合并嚴重肝腎功能不全者：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶≥正常值3 倍；血肌酐清除率＜ 25 mL/min。采集咽拭子標本進行肺炎支原體培養(yǎng)。對分離到的肺炎支原體菌株進行體外藥敏試驗及對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關(guān)基因突變位點檢測。結(jié)果：321 例CAP患者入選，其中男159 例，女162 例。年齡18～108歲，平均（44±21）歲，共分離出肺炎支原體53 株，其中紅霉素耐藥38 株（71.7%）；阿奇霉素耐藥32 株（60.4%）；未發(fā)現(xiàn)對喹諾酮及四環(huán)素類藥物耐藥的菌株。與非支原體肺炎患者比較，支原體肺炎患者平均年齡顯著低于非支原體感染患者（P＜0.001），支原體肺炎患者血白細胞計數(shù)顯著低于非支原體感染患者（P＜0.001）。臨床癥狀等其他方面兩組患者無顯著差異。肺炎支原體敏感株與耐藥株感染的兩組患者在年齡、性別、入組前應(yīng)用抗生素治療史等方面均無明顯差異。耐藥株感染患者雖在入組后72 h 內(nèi)退熱比例及72 h 后更換抗生素比例略高于敏感株感染患者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。A2063G 點突變是導(dǎo)致對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的主要點突變。結(jié)論：北京地區(qū)成人CAP 肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥率高，未發(fā)現(xiàn)喹諾酮及四環(huán)素類耐藥菌株。

來源出版物：中華結(jié)核和呼吸雜志, 2013, 36(12): 954- 958

入選年份：2017

不同病因兒童慢性咳嗽氣道高反應(yīng)的特征

于興梅，朱海艷，郝創(chuàng)利，等

摘要：目的：研究不同病因兒童慢性咳嗽的氣道高反應(yīng)性（AHR）特征。方法：納入2012年4月至2013年12月于蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科就診并明確為單病因的慢性咳嗽患兒，納入標準：（1）慢性咳嗽時間＞4 周，以咳嗽為主要癥狀或唯一癥狀；（2）X 線胸片檢查無明顯病變；（3）近2 周未服用糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥、支氣管舒張劑等對檢查造成影響的藥物；（4）能夠完成相關(guān)檢查，配合治療隨訪，病因診斷明確；（5）既往無合并其他系統(tǒng)嚴重疾病影響本研究正常進行者。采用支氣管激發(fā)試驗測得FEV1 下降20%時組織胺累計劑量（PD20），依據(jù)PD20 將AHR 嚴重程度分為重度、中度、輕度、極輕度4 級，同時測定誘導(dǎo)痰嗜酸粒細胞（EOS）計數(shù)和呼出氣一氧化氮（FeNO）濃度，按兒童慢性咳嗽指南推薦方案進行治療，4 周后隨訪，復(fù)查上述指標。結(jié)果：共納入患兒66 例，其中咳嗽變異性哮喘（CVA）17 例，上氣道咳嗽綜合征（UACS）37 例，感染后咳嗽（PIC）12 例。CVA、UACS 及PIC 組AHR陽性初診例數(shù)分別為17、13 和9 例，4 周復(fù)診時分別為17、5 和2 例。AHR 嚴重程度分級，初診時CVA、UACS和PIC 組中～重度分別為5、0 和0 例，輕度～極輕度分別為12、13 和9 例，陰性分別為0、24 和3 例；4 周后復(fù)診CVA、UACS 和PIC 組中～重度度分別為1、0和0 例，輕度～極輕度分別為16、5 和2 例，陰性分別為0、32 和10 例。CVA 組PD20 值為（0.47±0.28）mg，低于UACS 組和PIC 組[分別為（1.80±0.64）和（1.20±0.80） mg]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。CVA組的誘導(dǎo)痰EOS 比例均>3%，UACS 和PIC 組均＜3%。FeNO 與痰EOS 比例呈正相關(guān)（r＝0.687，P＝0.000）。結(jié)論：不同病因兒童慢性咳嗽氣道高反應(yīng)的嚴重程度和持續(xù)時間不同，氣道激發(fā)試驗結(jié)合誘導(dǎo)痰對慢性咳嗽病因診斷有重要價值。

來源出版物：中華結(jié)核和呼吸雜志, 2015, 38(1): 55-58

入選年份：2017

2010年與2000年中國城市兒童支氣管哮喘 患病率比較

沙莉，邵明軍，劉傳合，等

摘要：目的：調(diào)查中國城市0～14 歲兒童2010年與2000年10年間支氣管哮喘（哮喘）的患病情況并進行對比。方法：選取2000年、2010年均參與了全國0～14 歲城市兒童哮喘患病率調(diào)查的城市，要求兩次調(diào)查均為中心城區(qū)，調(diào)查樣本量符合要求。兩次調(diào)查均采用多階段分層隨機整群抽樣方法，使用統(tǒng)一問卷篩查可疑兒童哮喘患者。篩查陽性兒童由臨床醫(yī)生通過現(xiàn)場問診、體檢及查閱既往病歷記錄和輔助檢查結(jié)果，明確哮喘診斷。數(shù)據(jù)使用Epi-Info 軟件進行雙錄入，用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果：全國共有33 個城市入選本次研究，2000年、2010年33 個城市兒童哮喘的現(xiàn)患率分別為1.59%（5317/334985）和2.11%（7382/350347），呈顯著上升趨勢。兩次調(diào)查患病率最高的城市分別為合 肥（分別為3.91%和4.60%）和上海（分別為3.34%和5.28%），最低的城市為西寧（分別為0.12%和0.93%）和拉薩（分別為0.52%和0.26%）。大多數(shù)城市患病率呈不同程度升高，其中以溫州、上海和西寧上升最為明顯。兩次調(diào)查男孩患病率顯著高于女孩，分別為1.67∶1.00 和1.58∶1.00。兩次調(diào)查中患病率最高的年齡段均為學(xué)齡前期（3～6 歲）。兩次調(diào)查結(jié)果顯示，學(xué)齡兒童哮喘6 歲前發(fā)病分別為84.32%（2538/3010）和78.55%（2917/3714），嬰幼兒期發(fā)病患兒比例分別為54.92%（1653/3010）和43.30%（1608/3714）。結(jié)論：2010年我國城市兒童的哮喘患病率明顯高于2000年，2010年14歲以下兒童的患病率較10年前上升32.70%；大多數(shù)城市哮喘患病率較前升高，患病率較高者集中在省會和東部沿海城市；學(xué)齡前期是兒童哮喘患病率最高的年齡段，與10年前比較，目前哮喘發(fā)病年齡后移，學(xué)齡前和學(xué)齡期發(fā)病有所上升。

來源出版物：中華結(jié)核和呼吸雜志, 2015, 38(9): 664-668

入選年份：2017

非顯性因素所致慢性阻塞性肺疾病急性加重合并肺栓塞的臨床特征與相關(guān)因素分析

王同生，毛毅敏，孫瑜霞，等

摘要：目的：探討非顯性因素所致 COPD 急性加重（AECOPD）發(fā)生肺栓塞的臨床特征，并研究非顯性因素所致AECOPD 合并肺栓塞的相關(guān)因素。方法：連續(xù)納入因非顯性因素所致AECOPD 患者208 例，年齡50～82 歲，平均（62±12）歲。入院24 h 內(nèi)進行CT 肺動脈造影及雙下肢靜脈彩超檢查，根據(jù)造影結(jié)果分為合并肺栓組69 例和無肺栓塞組139 例。均檢測動脈血氣分析、D-二聚體和內(nèi)皮素-1。正態(tài)分布的計量資料采用t 檢驗，非正態(tài)分布資料采用Mann-Whitney u 檢驗，計數(shù)資料構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗，采用logistic 回歸方程進行危險因素分析。結(jié)果：非顯性因素所致AECOPD 患者合并肺栓塞者占33%（69/208）；合并肺栓塞組和無肺栓塞組臥床≥7 d 者分別占21.7%（15/208）和13.7%（19/ 208），雙下肢不等粗≥1 cm 者分別占34.8%（24/208）和15.1%（21/208），深靜脈血栓形成者分別占37.7%（26/208）和12.2%（17/208），暈厥者分別占11.6%（8/208）和0.06%（9/208），心電圖表現(xiàn)為SⅠQⅢTⅢ綜合征者分別占11.6%（8/208）和0.04%（5/208），PaCO2下降≥ 5 mm Hg（1 mm Hg＝0.133 kPa）者分別占27.5%（19/208）和9.3%（13/208），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2值為4.32～6.79，P＜0.05）。合并肺栓塞組D-二聚體水平[（760±152）μg/L]高于無肺栓塞組[（253±56）μg/L]，內(nèi)皮素-1 的中位數(shù)（四分位間距）[5.4 ng/L（1.6～6.9 ng/L）]高于與無肺栓塞組[1.8 ng/L（1.3～4.8）ng/L]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Z 值分別為-2.946 和-2.532，P＜0.01）。臥床≥7 d、雙下肢不等粗≥1 cm 和深靜脈血栓形成 是COPD 合并肺栓塞的危險因素（OR 值為2.31～3.24，P＜0.05）。結(jié)論：非顯性因素所致AECOPD 患者易合并肺栓塞。臥床時間長、雙下肢不等粗和深靜脈血栓是合并肺栓塞的相關(guān)因素。

來源出版物：中華結(jié)核和呼吸雜志, 2012, 35(4): 259-263

入選年份：2017

2010—2011年中國肺炎鏈球菌耐藥性 和血清型研究

王啟，張菲菲，趙春江，等

摘要：目的：了解我國肺炎鏈球菌的耐藥性和血清型分布，為合理使用抗生素和免疫預(yù)防提供依據(jù)。方法：收集2010—2011年我國10 個城市13 家醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)性肺炎鏈球菌471 株，采用瓊脂稀釋法測定15 種抗生素的MIC 值；采用簡易棋盤式肺炎鏈球菌分型系統(tǒng)和莢膜腫脹實驗進行血清型鑒定。結(jié)果：全部菌株中對青霉素耐藥（口服折點，MIC≥2 mg/L）的肺炎鏈球菌（PRSP）占50.1%（236/471）。對左氧氟沙星和莫西沙星的耐藥率分別為1.5%（7/471）和0.6%（3/471）。對阿莫西林/克拉維酸、頭孢克洛、頭孢呋辛和頭孢曲松4種β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率分別為27.4%（129/471）、60.3%（284/471）、58.8%（277/471）和18.5%（87/471）。對紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、磺胺甲唑/甲氧芐啶和氯霉素的耐藥率分別為93.2%（439/471）、88.7%（417/471）、89.6%（422/471）、62.8%（296/471）和22.1%（104/471）。471 株肺炎鏈球菌中常見的血清型依次為19F（112，23.8%）、19A（63，13.4%）、3（48，10.2%）、14（43，9.1%）、23F（29，6.2%）、15（25，5.3%）及6A（23，4.9%）。19F 與19A 血清型中PRSP 感染的發(fā)生率高達82.1%（100/122）和92.1%（58/63）。7 價和13 價結(jié)合疫苗對所有菌株的覆蓋率分別為45.3%（213/471）和76.0%（358/471）。兒童中7 價和13 價結(jié)合疫苗的覆蓋率為59.0%（72/122）和86.9%（106/122），成人中為42.3%（94/222）和73.4%（163/222）。結(jié)論：肺炎鏈球菌對紅霉素、克林霉素及四環(huán)素耐藥嚴重。血清型19A和19F 耐藥嚴重。7 價和13 價結(jié)合疫苗在兒童中的覆蓋率均高于成人。13 價結(jié)合疫苗可覆蓋大部分菌株，特別是PRSP。

來源出版物：中華結(jié)核和呼吸雜志, 2013, 36(2): 106-112

入選年份：2017

我國30 個省市城區(qū)門診支氣管哮喘患者 控制水平的調(diào)查結(jié)果

林江濤，顧玉海，袁雅冬，等

摘要：目的：全面評估我國城區(qū)支氣管哮喘（哮喘）患者控制水平。方法：本研究為多中心橫斷面研究，采用面對面問卷調(diào)查，覆蓋我國大陸地區(qū)（除西藏外）30 個省市。2015年10月至2016年5月于30 家分中心門診就診的符合入選標準的哮喘患者依次入組本研究。問卷內(nèi)容包括一般資料、控制水平、哮喘管理、哮喘發(fā)作的征兆和自我管理、疾病的認知程度。觀察指標包括：（1）人口學(xué)指標；（2）合并癥；（3）控制水平：哮喘控制率、哮喘簡易控制測試（ACT）評分；（4）哮喘控制不佳相關(guān)事件：過去的一年中因哮喘急性發(fā)作住院率、急診就診率、誤工誤學(xué)天數(shù)及次數(shù)。其中，哮喘控制水平依據(jù)GINA2015 定義的哮喘控制水平分級，詢問在過去4 周中，患者是否具有：出現(xiàn)日間哮喘癥狀超過2 次/周？任何由哮喘所致的夜間憋醒？需每周超過2 次使用緩解癥狀藥物？具有任何因哮喘所致活動受限情況？4 項均無為控制，1～2 項回答“是”為部分控制，3～4 項回答“是”為未控制。結(jié)果：共納入3875 例門診哮喘患者。根據(jù)GINA 定義的哮喘控制水平分級，我國城區(qū)哮喘總體控制率為28.5%（1099/3854）；其中，曾參與2008年哮喘控制調(diào)查的10 個城市在本次調(diào)查中哮喘控制率為39.2%（533/1361），與2008年（控制率28.7%）比較，有較大程度提高。26.4%（1017 例/3858例）的患者在過去的1年中因哮喘急性發(fā)作住院，22.4%（864/3858）的患者在過去的1年中因哮喘發(fā)作急診就診。在職工作人員中，18.4%（568/3092）的患者在過去的1年中因哮喘發(fā)作誤工；在校學(xué)生中，63.6%（63/99）的患者在過去的1年中因哮喘發(fā)作誤學(xué)。結(jié)論：目前我國哮喘總體控制水平尚不理想，但部分城市的哮喘控制水平有明顯改善。哮喘控制不佳導(dǎo)致急診就診、住院和誤工誤學(xué)增加。

來源出版物：中華結(jié)核和呼吸雜志, 2017, 40(7): 494-498

入選年份：2017

成都地區(qū)6107 例肺外結(jié)核患者結(jié)核分枝桿菌 感染與耐藥情況

王冬梅，李青峰，朱瑪，等

摘要：目的：分析成都地區(qū)近年來肺外結(jié)核患者MTB的感染及耐藥情況，為結(jié)核病的防控和診療提供依據(jù)。方法：回顧性收集分析四川省成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心和成都各個防控督導(dǎo)點2013年1月至2015年12月組織來源為淋巴結(jié)、胸膜、腹膜、腦、泌尿系統(tǒng)、骨等肺外結(jié)核病例6107 例，其中男4033 例，女2074 例，年齡1～91 歲，平均37 歲。對其流行病學(xué)資料、感染和耐藥情況采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料統(tǒng)計描述采用百分率（%），計量資料統(tǒng)計描述采用±s 表示。結(jié)果：成都地區(qū)2013年1月至2015年12月行MTB 培養(yǎng)的21036 例患者中，培養(yǎng)陽性（培陽）7119例（33.8%），其中肺外結(jié)核6107 例中陽性896 例，肺外結(jié)核培陽病例占全部培陽病例的12.6%（896/7119）。2013—2015年肺外結(jié)核培陽病例呈逐年上升趨勢，年平均遞增率超過50%，病例分布以21～40 歲為主（46.8%，419/896）；男性多于女性，男女比例為2.1∶1，平均年齡34 歲。在淋巴結(jié)、胸膜、腹膜、腦膜、泌尿系統(tǒng)、骨和其他類型肺外結(jié)核病例中，骨結(jié)核病例培養(yǎng)陽性率最高（62/243，25.5%），其次為淋巴結(jié)（283/1297，21.8%）、胸膜（289/1840，15.7%）、泌尿系統(tǒng)（63/452，13.9%）、腹膜（41/303，13.5%）、腦膜（156/1915，8.1%）和其他類型結(jié)核（2/457，3.5%）；896 例肺外結(jié)核病患者分離的MTB 菌株對8 種抗結(jié)核藥的藥物敏感度試驗結(jié)果顯示其耐藥性從高到低依次為異煙肼、利福平、鏈霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、卷曲霉素及乙胺丁醇。其耐多藥和廣泛耐藥MTB 的平均分離率分別為9.7%（87/896）和2.0%（17/896）。結(jié)論：成都地區(qū)近年來肺外結(jié)核的標本送檢率和陽性檢出率均呈逐年上升趨勢，耐藥率高于國內(nèi)外研究水平，本地區(qū)肺外結(jié)核的防控和診療工作應(yīng)進一步受到重視。

來源出版物：中華結(jié)核和呼吸雜志, 2017, 40(8): 592-595

入選年份：2017