宋凱 祁芝珍 楊瑞馥 宋亞軍

鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌（簡(jiǎn)稱(chēng)鼠疫菌）引發(fā)的一種自然疫源性疾病。鼠疫作為一種發(fā)病急、傳播快、病死率高、傳染性強(qiáng)的烈性傳染病，在人類(lèi)歷史上曾發(fā)生過(guò)3 次世界性大流行：第一次大流行始于公元541—544年的古羅馬帝國(guó)，一直持續(xù)到公元767年，史稱(chēng)查士丁尼瘟疫。該流行起源于亞洲中部，經(jīng)地中海沿岸蔓延到北非、歐洲大陸乃至不列顛群島，累計(jì)造成1 億人死亡。暴發(fā)于公元1347年的第2次鼠疫大流行（史稱(chēng)黑死病）同樣起源于亞洲，經(jīng)古代絲綢之路抵達(dá)歐洲的地中海港口，波及亞洲、歐洲大部及非洲北部，并伴隨著周期性暴發(fā)持續(xù)到18 世紀(jì)。第3 次鼠疫大流行起始于19 世紀(jì)50年代的中國(guó)云南，隨后于1894年經(jīng)香港傳播到全球。微生物學(xué)家 Alexandre Yersin 于1894年在香港患者體內(nèi)分離得到鼠疫菌，進(jìn)而確認(rèn)了鼠疫菌是引發(fā)現(xiàn)代鼠疫大流行的罪魁禍?zhǔn)住６捎谇皟纱问笠叽罅餍性谂R床癥狀、傳播速率及死亡率等方面與第3 次存在一些差異，關(guān)于其病原體是否為鼠疫菌的問(wèn)題曾一度處于爭(zhēng)論之中；近來(lái)，隨著考古微生物學(xué)（Paleomicrobiology）的發(fā)展，這一爭(zhēng)論已基本得到解決。

考古微生物學(xué)最早可追溯到19世紀(jì)20年代，旨在通過(guò)研究古人體或古環(huán)境樣本中的病原體信息來(lái)建立古代傳染病的診斷體系，并結(jié)合相關(guān)歷史記錄，以更好地闡釋古代病原體的進(jìn)化、毒力狀態(tài)、疫源地、傳播媒介、傳播路線等問(wèn)題。支撐該領(lǐng)域的原理是，尸骸內(nèi)特定組織能夠保存導(dǎo)致個(gè)體死亡的病原體的DNA 或蛋白質(zhì)等生物大分子。盡管特定環(huán)境下古DNA 能夠長(zhǎng)期保存，但水解作用及化學(xué)損傷等導(dǎo)致的DNA 降解仍是考古微生物學(xué)面臨的主要挑戰(zhàn)。此外，由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)當(dāng)前生物分子的污染，嚴(yán)格無(wú)菌操作和實(shí)驗(yàn)對(duì)照便成為考古微生物學(xué)這一領(lǐng)域發(fā)展的必要基礎(chǔ)。迄今為止，已從很多考古樣本中分離得到古微生物DNA，包括凍土、琥珀、骨骼、內(nèi)臟器官、牙髓和糞化石等。考古微生物學(xué)研究方法主要包括顯微觀察、免疫檢測(cè)、PCR 測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析等。其中，基于古DNA 的系統(tǒng)發(fā)育分析能夠確定病原體基因組的變異情況，揭示其可能的進(jìn)化過(guò)程，進(jìn)而闡明傳染病的擴(kuò)散路徑；鼠疫歷史疫情的相關(guān)研究是考古微生物學(xué)研究中一個(gè)比較成功的范例。

1 基于PCR 的古DNA 檢測(cè)

由于鼠疫會(huì)導(dǎo)致菌血癥，而牙髓是牙齒中高度血管化的軟組織，加之牙齒良好的封閉環(huán)境，使得古代病原體DNA 在牙齒中的長(zhǎng)期保存成為可能。1998年，Drancourt 等以牙髓為檢測(cè)樣本，以鼠疫菌特異性基因pla為靶基因，對(duì)法國(guó)普羅旺斯地區(qū)兩處萬(wàn)人冢出土的疑似鼠疫患者殘骸進(jìn)行核酸檢測(cè)。在獲得的12顆牙齒中，有6 顆檢測(cè)到pla特異性片段，且DNA 序列與現(xiàn)代鼠疫pla序列一致；用于擴(kuò)增ropB片段的4 顆牙齒，在經(jīng)過(guò)兩輪PCR 后，獲得預(yù)期片段；而用作陰性對(duì)照的7顆牙齒全部未檢出鼠疫菌。這一研究首次從實(shí)驗(yàn)室診斷的角度確定，1722年馬賽大瘟疫（黑死病）的病原體是鼠疫菌，并建立了基于核酸分子鑒定對(duì)古代鼠疫進(jìn)行檢測(cè)的方法，成為后續(xù)工作的借鑒。

樣本污染是古DNA 檢測(cè)最需要注意的問(wèn)題之一，為解決這一風(fēng)險(xiǎn)，研究人員設(shè)計(jì)了“自殺PCR”的檢測(cè)方案，陸續(xù)確認(rèn)了鼠疫菌是歐洲黑死病及查士丁尼大瘟疫的罪魁禍?zhǔn)住Ｔ陔S后的研究中，基于核酸檢測(cè)的新方法不斷應(yīng)用于古代鼠疫菌的檢測(cè)鑒定，包括基因間區(qū)分型系統(tǒng)、簡(jiǎn)單的系統(tǒng)發(fā)育分析以及16S rRNA 序列測(cè)定等，在很大程度上推動(dòng)了古代鼠疫的實(shí)驗(yàn)室診斷及鼠疫菌的分子鑒定工作，使之前僅僅基于人類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)或歷史文獻(xiàn)記載的鼠疫病因?qū)W推測(cè)得以證實(shí)。

2 古代鼠疫菌的蛋白質(zhì)檢測(cè)

研究表明，蛋白質(zhì)在某些考古樣本中能保存更長(zhǎng)時(shí)間，因此對(duì)鼠疫菌特異性蛋白質(zhì)的檢測(cè)可作為古代鼠疫檢測(cè)方法的補(bǔ)充。F1 蛋白是鼠疫菌產(chǎn)生的一種特異性莢膜抗原，也是鼠疫實(shí)驗(yàn)室診斷中必不可少的靶標(biāo)。鼠疫菌存活與否、樣本存留時(shí)間等一般不會(huì)影響F1 抗原的檢測(cè)結(jié)果，這也為古代鼠疫菌的免疫檢測(cè)提供了可能。Pusch 等人于2004年首次通過(guò)免疫層析試紙，在德國(guó)一處教堂埋葬的17 世紀(jì)的骨骼殘骸中檢測(cè)到鼠疫菌F1 抗原。在此研究中，研究人員根據(jù)埋葬的尸體是否經(jīng)過(guò)石灰消毒處理來(lái)初步判斷是否死于鼠疫，隨后分別選取死于黑死病和正常死亡的各12 具尸骸作為樣本，采用DNA 雜交及免疫層析兩種方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在死于黑死病的12 具尸骸中，通過(guò)特異性擴(kuò)增caf1基因片段，僅有2個(gè)樣本得到陽(yáng)性結(jié)果，而通過(guò)免疫層析方法可檢測(cè)到10 個(gè)樣本呈陽(yáng)性，說(shuō)明F1 抗原蛋白相較于其編碼基因caf1 的保存更加持久和完整。該研究表明，古代鼠疫患者遺骸中F1 抗原含量足夠用于檢測(cè)鑒定，這為古代鼠疫的抗原檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。此后，研究人員不斷改良古代鼠疫菌的F1 抗原檢測(cè)方法，包括快速檢測(cè)試紙?jiān)囼?yàn)（RDT）、iPCR 等技術(shù)，大大提高了古代鼠疫菌F1 抗原檢測(cè)的靈敏度。

除單一 F1 抗原檢測(cè)外，Drancourt 等還將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于18 世紀(jì)的鼠疫遺骸的分析。該研究將牙髓蛋白提取純化后，通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，在鑒定的211 個(gè)細(xì)菌源性多肽中有4 個(gè)多肽分屬于3個(gè)耶爾森氏菌屬蛋白，其中的一個(gè)多肽僅與假結(jié)核耶爾森氏菌和鼠疫菌完全匹配。此外他們還發(fā)現(xiàn)，古遺體牙髓中可以檢測(cè)到免疫球蛋白，提示考古遺骸牙髓的蛋白質(zhì)組學(xué)也可用于研究病原和宿主炎癥反應(yīng)，使得古代疾病的血清學(xué)檢測(cè)成為可能。Righetti 等開(kāi)發(fā)了一種EVAfilm（乙烯-乙酸乙烯酯共聚物 膠膜）技術(shù)應(yīng)用于1630年意大利鼠疫考古材料的宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析，確認(rèn)檢測(cè)得到的17 種耶爾森氏菌屬蛋白質(zhì)是由鼠疫菌產(chǎn)生的。基于古蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析考古鼠疫相關(guān)樣本，可以通過(guò)多個(gè)鼠疫菌蛋白對(duì)古代鼠疫樣本進(jìn)行更為全面的檢測(cè)和確認(rèn)，提高樣本檢出率和結(jié)果可靠性。

3 古代鼠疫菌的基因組DNA分析

基因組學(xué)分析，不僅可以檢測(cè)古代樣本中是否存在鼠疫菌核酸，還可基于全基因組序列信息，回答古代鼠疫菌進(jìn)化、毒力因子獲得或缺失以及鼠疫傳播擴(kuò)散等更為復(fù)雜的問(wèn)題。

2010年Bramanti 等通過(guò)部分基因組分析，將檢測(cè)到的黑死病菌株在鼠疫菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上進(jìn)行定位。2011年，Bos 等基于鼠疫菌CO92 株基因組設(shè)計(jì)芯片，富集黑死病遺骸牙髓中的鼠疫菌DNA，完成了第一株古代鼠疫菌基因組草圖測(cè)定。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該菌株是大部分現(xiàn)存鼠疫菌株的祖先，同時(shí)確認(rèn)對(duì)人類(lèi)致病的當(dāng)代鼠疫菌很可能起源于中世紀(jì)時(shí)期。但該菌株與現(xiàn)代鼠疫菌基因組相比，未發(fā)現(xiàn)獨(dú)特的SNP位點(diǎn)，從遺傳學(xué)上難以解釋黑死病的高致死率，還需要結(jié)合其他諸多因素進(jìn)行深入研究。Bos 等人此后又測(cè)定了5 株馬賽大鼠疫時(shí)期的鼠疫菌基因組，確認(rèn)該時(shí)期的鼠疫菌是14 世紀(jì)黑死病菌株的后代，但該譜系在任何現(xiàn)存鼠疫疫源地都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)?；谝陨涎芯浚珺os 等推測(cè)引發(fā)黑死病的鼠疫菌株的后代在某種未知的宿主體內(nèi)潛伏數(shù)百年，產(chǎn)生了多樣化并最終導(dǎo)致18 世紀(jì)中期的馬賽鼠疫大流行。關(guān)于第二次鼠疫大流行為何能夠在歐洲持續(xù)數(shù)個(gè)世紀(jì)之久的爭(zhēng)論，主要存在兩種觀點(diǎn)：一種是認(rèn)為黑死病時(shí)期的鼠疫是單一菌株的傳播導(dǎo)致，該菌株長(zhǎng)期在歐洲潛伏并引發(fā)流行性鼠疫；另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為第二次鼠疫大流行是亞洲鼠疫多次向歐洲傳播的結(jié)果。但目前缺乏決定性證據(jù)證實(shí)任一假設(shè)，仍需要更多古代鼠疫菌基因組測(cè)定分析。

2014年，Wagner 等測(cè)定了德國(guó)墓葬得到的兩株查士丁尼鼠疫時(shí)期的鼠疫菌基因組，根據(jù)其在鼠疫菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的位置，認(rèn)為導(dǎo)致前兩次鼠疫大流行的菌株都是早期中亞譜系的后代，同時(shí)是一些中國(guó)菌株的祖先，并推測(cè)導(dǎo)致查士丁尼鼠疫的菌株在第2 次大流行前已經(jīng)滅絕。關(guān)于查士丁尼鼠疫起源及傳播路線問(wèn)題，Wagner 提出該譜系起源于中國(guó)，經(jīng)絲綢之路等貿(mào)易路線傳播至整個(gè)歐亞大陸，而第2 次大流行從亞洲傳播到歐洲后，又沿尼羅河傳播到中非地區(qū)。

經(jīng)蚤傳播的能力是鼠疫菌毒力研究中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，而鼠疫菌歷史菌株基因組的測(cè)定為相關(guān)毒力因子的獲得缺失研究提供了依據(jù)。Rasmussen 等測(cè)定了7 株青銅時(shí)代的鼠疫菌基因組，發(fā)現(xiàn)該時(shí)期菌株缺少引發(fā)腺鼠疫的必要點(diǎn)突變（Pla的Ile259Thr 突變）。2017年，古人類(lèi)學(xué)家Krause 等又測(cè)定了6 株新石器時(shí)代晚期至青銅時(shí)代（3700 至4800年前）歐洲鼠疫菌株（LNBA 譜系）的基因組，發(fā)現(xiàn)LNBA 菌株已具備在其祖先假結(jié)核耶爾森氏菌中不存在的pla和caf1 毒力基因，但缺失了在蚤傳播途徑中起重要作用的鼠毒素基因ymt，而且ureD基因（編碼脲酶D 蛋白，對(duì)蚤致死，失活后使鼠疫菌獲得經(jīng)蚤傳播能力）能夠正常表達(dá)，這表明跳蚤很可能不是當(dāng)時(shí)鼠疫傳播的主要媒介，支持了該時(shí)期鼠疫菌缺乏腺鼠疫感染模式的理論。值得一提的是，LNBA 譜系是目前已知最古老的鼠疫菌；這一研究將鼠疫菌的物種形成時(shí)間定位在5000～7500年前，是目前最為精確的鼠疫菌起源時(shí)間估算。2018年，Spyrou 等測(cè)定了兩株分離自俄羅斯的與LNBA 譜系同時(shí)期的鼠疫菌基因組，但該譜系在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中形成一個(gè)獨(dú)立的分支，并且已具備經(jīng)蚤傳播的關(guān)鍵基因，說(shuō)明其已能夠適應(yīng)跳蚤這一傳播媒介。此外，該譜系在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與0.PE4（田鼠型鼠疫菌）雖然位置相近，但致病性卻存在顯著差異，后續(xù)研究可以通過(guò)基因組的差異分析來(lái)探究二者毒力的差異原因。

4 小結(jié)

據(jù)WHO 報(bào)導(dǎo)，自2017年8月馬達(dá)加斯加鼠疫暴發(fā)后僅4 個(gè)月時(shí)間，已確認(rèn)鼠疫病例2417 例，且超過(guò)100 人死亡?？梢灶A(yù)見(jiàn)，馬達(dá)加斯加以及其他一些鼠疫疫源地仍會(huì)暴發(fā)疫情，將對(duì)世界醫(yī)療和公共衛(wèi)生界構(gòu)成極大的挑戰(zhàn)。因此，對(duì)鼠疫菌的進(jìn)化路線、毒力變化及致病機(jī)制的研究仍是至關(guān)重要的。無(wú)論是從核酸或蛋白質(zhì)方面，考古微生物學(xué)都將為以上研究提供一個(gè)嶄新的視角，使我們通過(guò)分析歷史上鼠疫疫情流行情況及鼠疫菌遺傳特征，進(jìn)而探究其傳播方式及致病機(jī)制。然而，由于歷史不可重現(xiàn)，研究人員只能通過(guò)歷史記載及考古微生物學(xué)研究間接地推測(cè)古代鼠疫流行的場(chǎng)景；而考古微生物學(xué)研究樣本中的核酸和蛋白質(zhì)都是痕量的，這一固有的局限性勢(shì)必導(dǎo)致?tīng)?zhēng)議性結(jié)果的存在。在接下來(lái)的研究中，可以現(xiàn)有研究為基礎(chǔ)，在繼續(xù)探索新的古代鼠疫菌株基因組信息的基礎(chǔ)上，參考同時(shí)期流行地域的歷史人文資料，獲得更為可靠的結(jié)果。

考古微生物學(xué)在鼠疫歷史疫情研究中的成功實(shí)踐表明，這一新興學(xué)科將考古學(xué)、人類(lèi)學(xué)、古地理學(xué)、古生態(tài)學(xué)與微生物學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合進(jìn)行整體研究，為更加全面、準(zhǔn)確地解釋古代傳染病的起源、傳播及病原體進(jìn)化等問(wèn)題提供新的思路?！?/p>