拱健婷，李 莉＊＊，鄒慧琴，張金霞，徐 東，毛克臣，陳慧榮，張明明，楊瑞琦

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京 100010；2.北京市衛(wèi)生局臨床藥學(xué)研究所 北京 100035；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102446）

大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、藥用大黃Rheum offcinaleBaill.或唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.的干燥根和根莖，具有瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)的功效[1]。大黃化學(xué)成分復(fù)雜，含有蒽衍生物（蒽醌類、蒽酮類）、二苯乙烯、鞣質(zhì)、萘衍生物、黃酮衍生物、無(wú)機(jī)元素等[2]。但是目前2015年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定通過(guò)測(cè)定大黃中游離蒽醌及結(jié)合蒽醌的含量為控制指標(biāo)從而評(píng)價(jià)大黃質(zhì)量，在檢測(cè)指標(biāo)上不全面。大黃為臨床常用大宗藥材，其飲片與中成藥在臨床上應(yīng)用廣泛，2015年版《中國(guó)藥典》一部中收載的含大黃中成藥多達(dá)105種[2]，全國(guó)8000多種中藥制劑中含有大黃的達(dá)800余種，年用藥量約為8×105-1×106kg[3,4]。大黃臨床功效多樣，而不同臨床藥用指向不同的物質(zhì)基礎(chǔ)，“一刀切”對(duì)精準(zhǔn)用藥不可取；另外在中成藥檢測(cè)中，也沒(méi)有針對(duì)藥效多樣性的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。在上述諸多問(wèn)題中，首要解決的是大黃多成分是否存在相關(guān)性，與各種功效是如何對(duì)應(yīng)的？現(xiàn)代藥理研究也表明游離蒽醌、結(jié)合蒽醌的藥理作用不盡相同[5]，此外，大黃是多基原、多道地產(chǎn)區(qū)、多炮制規(guī)格的典型代表[6-8]，有必要以大黃為研究載體探索從多功效的角度進(jìn)行中藥材質(zhì)量合理評(píng)價(jià)。

近年來(lái)，在有關(guān)中藥有效物質(zhì)基礎(chǔ)明確的前提下，模式識(shí)別技術(shù)已成為評(píng)價(jià)中藥材品質(zhì)的一種卓有成效的方法，如主成分分析、聚類分析、判別分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、灰色關(guān)聯(lián)分析等逐步應(yīng)用于中藥材真?zhèn)舞b別及質(zhì)量?jī)?yōu)劣評(píng)價(jià)等方面[9-14]，其結(jié)果真實(shí)客觀?；凇爸兴幊煞峙c中藥質(zhì)量的關(guān)系是一種灰色關(guān)系”的認(rèn)識(shí)，因而可以用灰色系統(tǒng)理論中的關(guān)聯(lián)度分析或灰關(guān)聯(lián)聚類來(lái)評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量[15]?；疑P(guān)聯(lián)分析是依據(jù)灰色系統(tǒng)理論所建立的分析方法，是將因素間發(fā)展趨勢(shì)的相似或者相異的程度即灰色關(guān)聯(lián)度，作為衡量各因素間的關(guān)聯(lián)程度的一種分析手段[14]。灰色關(guān)聯(lián)綜合評(píng)價(jià)法作為一種客觀賦權(quán)評(píng)價(jià)方法，為科學(xué)合理地評(píng)價(jià)大黃的質(zhì)量提供了途徑。

本文選取與大黃“瀉下攻積、清熱解毒、逐瘀通經(jīng)”傳統(tǒng)功效密切相關(guān)的游離蒽醌（大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚）、結(jié)合蒽醌類（蘆薈大黃素苷、大黃酸苷、大黃素苷、大黃酚苷、大黃素甲醚苷）、二蒽酮類（番瀉苷A、番瀉苷B）、酚酸類（兒茶素、沒(méi)食子酸）[22-23]14種功效組分用于大黃質(zhì)量的評(píng)價(jià)，引入灰色關(guān)聯(lián)分析法對(duì)不同產(chǎn)地大黃藥材的功效組分特征進(jìn)行初步探究，為今后有效評(píng)價(jià)大黃的質(zhì)量、指導(dǎo)大黃臨床精準(zhǔn)用藥和中藥栽培及資源開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀，Agilent1100色譜工作站，DAD二極管陣列檢測(cè)器；KQ5200D超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；萬(wàn)分之一電子分析天平（上海賽多利斯儀器有限公司）；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)110795-201007）、大黃酸對(duì)照品（批號(hào)110757-20026）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)110756-200110）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)110796-201118）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)110758-201013）、兒茶素對(duì)照品（批號(hào)110877-201203）、沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)110831-201204）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均＞98%。番瀉苷A對(duì)照品（批號(hào)：STA-02504001）、番瀉苷B對(duì)照品（批號(hào)：STA-04604002）購(gòu)自上海詩(shī)丹得公司。乙腈（色譜純，德國(guó)Fisher公司），水為屈臣氏蒸餾水，磷酸、甲醇、氯仿等其他的試劑均為分析純。

1.3 材料

本研究深入青海、甘肅、四川、陜西、寧夏5省25個(gè)采樣點(diǎn)采集大黃樣品，經(jīng)北京市衛(wèi)生局臨床藥學(xué)研究所李莉副研究員鑒定后，確定其分別為唐古特大黃（Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.）、掌葉大黃（R.palmatumL.），大黃采樣點(diǎn)地理分布見(jiàn)圖1。

2 方法

2.1 大黃功效組分含量的測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.05%的磷酸水溶液（A），乙腈（B），流速為1mL·min-1。按照0-10 min，5-11%B;10-30 min，11-15%B;30-45 min,15-17%B;45-60 min,17-22%B;60-75 min,22-36%B;75-90 min,36-60%B;90-105 min,60%B;105-110 min,60-5%B進(jìn)行梯度洗脫。

2.1.2 供試品溶液的制備

（1）游離蒽醌、番瀉苷A、番瀉苷B、沒(méi)食子酸、兒茶素

大黃樣品粉碎，過(guò)2號(hào)篩，稱取粉末0.25 g置于具塞三角瓶中，加入60%甲醇25 mL，稱重，超聲（200 W，40 Hz）提取1 h，加60%甲醇足失，取續(xù)濾液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

（2）蒽醌苷

大黃樣品粉碎，過(guò)2號(hào)篩，稱取粉末0.25 g置于具塞三角瓶中，精密加入25 mL 15%硫酸-甲醇（2∶3）溶液，稱重，超聲（200 W，40 Hz）提取1 h，放冷，用10 mL氯仿進(jìn)行萃取，重復(fù)操作4次，合并萃取液，蒸干，用甲醇轉(zhuǎn)移定容至25 mL，搖勻，取續(xù)濾液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得總蒽醌供試品溶液。總蒽醌含量與游離蒽醌含量之差即為5種蒽醌苷類成分的含量。

2.1.3 對(duì)照溶液的制備

精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品3.3 mg、3.6 mg、3.6 mg、5.4 mg、4.1 mg分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容；另精密稱取兒茶素、番瀉苷B對(duì)照品3.6 mg、4.5 mg分別置于5 mL容量瓶中，加30%甲醇定容；精密稱取番瀉苷A、沒(méi)食子酸對(duì)照品1.85 mg、1.2 mg分別置于10m L容量瓶中，加30%甲醇定容，制得對(duì)照品儲(chǔ)備液，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品貯備液加對(duì)應(yīng)甲醇溶劑溶解并稀釋至刻度，制得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按色譜條件每次進(jìn)樣20 μL。以峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度X作圖進(jìn)行回歸，得大黃活性成分的回歸方程（表1），且線性關(guān)系良好。

圖1 大黃采樣點(diǎn)地理分布圖

表1 大黃活性成分含量測(cè)定線性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.5 精密度考察

精密稱取大黃粉末0.25 g，按照2.1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行溶液的制備，按照2.1.1項(xiàng)下方法重復(fù)進(jìn)樣5次，求得14種活性成分含量的RSD結(jié)果1.10%-2.80%，表明該方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察

精密稱取大黃粉末0.25 g，按照2.1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行溶液的制備，按照2.1.1項(xiàng)下方法分別間隔2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄各活性成分峰面積，求得其RSD結(jié)果為0.65%-2.98%，表明該方法穩(wěn)定性好。

2.1.7 重復(fù)性考察

按照2.1.2項(xiàng)下方法平行制備5份大黃供試品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下樣品測(cè)定方法操作，記錄峰面積，根據(jù)當(dāng)天隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中14種活性成分含量，求得RSD結(jié)果為0.68%-2.88%，表明該方法重復(fù)性好。

2.1.8 加樣回收率考察

取已知含量的大黃供試品5份，同樣品測(cè)定操作，分別精密加入等同藥材含量一半的相應(yīng)對(duì)照品，同樣品測(cè)定操作，測(cè)定含量，計(jì)算其平均回收率結(jié)果為95.2%-105.6%，RSD結(jié)果為1.1%-2.4%，均符合要求。

2.2 建立評(píng)價(jià)大黃藥材質(zhì)量的灰色關(guān)聯(lián)度模式

2.2.1 數(shù)據(jù)集的建立與參考序列的選擇

測(cè)定所收集大黃藥材的M1-M14活性成分含量為評(píng)價(jià)大黃藥材質(zhì)量的原始數(shù)據(jù)集。設(shè)有n個(gè)樣品，每個(gè)樣品有m項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而組成了評(píng)價(jià)單元序列{Xik}(i=1,2,…,n;k=1,2,…,m)。采用灰色模式識(shí)別法作為評(píng)價(jià)測(cè)度，選擇n個(gè)樣本對(duì)應(yīng)指標(biāo)的最大值和最小值構(gòu)成作為最優(yōu)參考序列{Xsk}和最差參考序列{Xtk}(k=1,2,…,m)。

2.2.2 原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

為避免原始數(shù)據(jù)量綱、范圍等測(cè)度不統(tǒng)一的問(wèn)題，采用均值化對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理：Yik=Xik/；Yik為標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)，Xik為原始數(shù)據(jù)為n個(gè)樣品第k個(gè)指標(biāo)的均值。

2.2.3 計(jì)算關(guān)聯(lián)系數(shù)

2.2.4 計(jì)算關(guān)聯(lián)度

3 結(jié)果

3.1 大黃功效組分含量測(cè)定結(jié)果

按照2.1.1、2.1.2項(xiàng)下方法測(cè)定了25個(gè)產(chǎn)地大黃樣品中蘆薈大黃素（M1）、大黃酸（M2）、大黃素（M3）、大黃酚（M4）、大黃素甲醚（M5）、蘆薈大黃素苷（M6）、大黃酸苷（M7）、大黃素苷（M8）、大黃酚苷（M9）、大黃素甲醚苷（M10）、番瀉苷A（M11）、番瀉苷 B（M12）、沒(méi)食子酸（M13）、兒茶素（M14）14種活性成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。大黃游離蒽醌總含量為0.4759%-1.7354%，結(jié)合蒽醌類成分總含量為2.3353%-6.7816%，二蒽酮類成分總含量為0.3768%-1.5137%，酚酸類成分總含量為0.0494%-0.9154%。

3.2 不同產(chǎn)地大黃功效組分綜合評(píng)價(jià)

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃中游離蒽醌類成分與其“清熱解毒”功效相關(guān)，結(jié)合蒽醌類成分和二蒽酮類成分與其“瀉下攻積”功效相關(guān)，而酚酸類成分則與其“逐瘀通經(jīng)”功效相關(guān)[16,17]?；诖税凑?.2項(xiàng)下灰色模式識(shí)別方法步驟依次對(duì)大黃傳統(tǒng)功效“瀉下攻積，清熱解毒，逐瘀通經(jīng)”對(duì)應(yīng)的功效組分進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，采用Python 2.7實(shí)現(xiàn)關(guān)聯(lián)度的計(jì)算，灰色關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見(jiàn)表3。

以傳統(tǒng)功效“瀉下攻積、清熱解毒、逐瘀通經(jīng)”對(duì)不同產(chǎn)地大黃進(jìn)行相對(duì)關(guān)聯(lián)度計(jì)算，關(guān)聯(lián)度范圍分別為：0.4977-0.4251、0.5836-0.3260、0.6292-0.2919，分別以甘肅天?？h唐古特大黃、四川雅江縣唐古特大黃、甘肅禮縣掌葉大黃的相對(duì)關(guān)聯(lián)系數(shù)最高，質(zhì)量最佳；寧夏隆德縣所產(chǎn)掌葉大黃“瀉下攻積”、“清熱解毒”相對(duì)關(guān)聯(lián)系數(shù)均最小，四川理塘縣所產(chǎn)唐古特大黃“逐瘀通經(jīng)”相對(duì)關(guān)聯(lián)系數(shù)最小，質(zhì)量較差。

基于計(jì)算得到的相對(duì)關(guān)聯(lián)度對(duì)不同產(chǎn)地大黃進(jìn)行聚類分析，可以有效區(qū)分質(zhì)量較優(yōu)的大黃與其他產(chǎn)地大黃。以“瀉下攻積”功效組分進(jìn)行聚類，大黃被分為4類，質(zhì)量最佳的與青海達(dá)日縣所產(chǎn)唐古特大黃歸為一類；以“清熱解毒”功效組分進(jìn)行聚類，大黃被分為4類，四川雅江縣唐古特大黃自成一類；以“逐瘀通經(jīng)”功效組分進(jìn)行聚類，大黃被分為3類，甘肅禮縣唐古特大黃自成一類。

4 討論

《陳藏器本草》[18]中提到“蜀中所產(chǎn)和厚深沉，河西所產(chǎn)泄瀉峻快”，青海、甘肅地屬河西，兩地所產(chǎn)大黃“瀉下攻積”作用平均相對(duì)關(guān)聯(lián)度為0.4641，甘肅天祝所產(chǎn)唐古特大黃“瀉下攻積”質(zhì)量最佳，四川所產(chǎn)大黃“瀉下攻積”作用平均相對(duì)關(guān)聯(lián)度為0.4567，與陳藏器所言一致。王家葵等報(bào)道三種正品大黃的瀉下作用差異較大，唐古特大黃、藥用大黃及掌葉大黃的瀉下效價(jià)強(qiáng)度比為4.94∶1.85∶1[19]；《新編中藥志》[20]中也曾報(bào)道唐古特大黃的ED50為437 mg·kg-1，掌葉大黃的ED50為493 mg·kg-1；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示唐古特大黃瀉下攻積功效的平均相對(duì)關(guān)聯(lián)度為0.4651大于掌葉大黃的平均相對(duì)關(guān)聯(lián)度0.4551，由此證明唐古特大黃“瀉下攻積”作用優(yōu)于掌葉大黃，評(píng)價(jià)結(jié)果與藥材的實(shí)際情況相符。大黃為傳統(tǒng)的瀉下藥，其藥效研究多圍繞“瀉下”功效，目前還未見(jiàn)大黃不同品種、產(chǎn)地“清熱解毒、逐瘀通經(jīng)”功效對(duì)比研究的報(bào)道，四川雅江所產(chǎn)唐古特大黃和甘肅禮縣所產(chǎn)掌葉大黃的藥效有待進(jìn)一步藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。除此之外，由于本研究中的樣品多為野生大黃，受自然條件的限制收集樣品量少，生長(zhǎng)年限也存在差異，可能導(dǎo)致樣品的代表性存在局限性，有待于今后研究中收集更多、更具代表性的樣品。

表2 大黃樣品中14種活性成分的含量/%

大黃是大宗藥材，也是我國(guó)重要的出口商品，2016年的出口量達(dá)293.681噸，且呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，遠(yuǎn)銷日本、韓國(guó)、美國(guó)、德國(guó)、東南亞各國(guó)[21]。長(zhǎng)期以來(lái)大黃在中西方得到廣泛運(yùn)用，但各國(guó)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)卻不統(tǒng)一，2015年版《中國(guó)藥典》中以5種蒽醌類成分、總蒽醌含量為指標(biāo)[1]，而大黃瀉下作用主要活性成分番瀉苷類未作明確含量要求規(guī)定，韓國(guó)和日本則將番瀉苷類作為含量測(cè)定的特征性指標(biāo)[22,23]。質(zhì)量可控的問(wèn)題是制約大黃國(guó)際化的瓶頸，與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的不一致不利于大黃藥材出口和國(guó)際合作，所以研究并制定大黃國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)是時(shí)代需求。

中藥具有多成分、多功效的特點(diǎn)，馬莉[24]采用數(shù)據(jù)挖掘方法對(duì)1811首大黃方劑進(jìn)行配伍效應(yīng)的挖掘，大黃配伍清熱藥、理氣藥、瀉下藥、補(bǔ)虛藥、活血藥的總頻次分別為773、516、427、316、147次，彰顯了大黃為重要的瀉下藥、清熱藥、活血藥；張仲景《傷寒雜病論》中有89處應(yīng)用了大黃，占全方書的1/4，《金匱要略》全書200余首方劑中，應(yīng)用大黃者占11%[25]，對(duì)方劑進(jìn)行分析，主要取其瀉熱攻積、逐瘀通經(jīng)、解毒消癰、泄火降逆、利膽退黃、通利逐飲功效分為6大類；含有大黃中藥制劑大黃蟄蟲丸、牛黃解毒片、利膽片等分別為婦科、內(nèi)科常用藥，因此，判定中藥的質(zhì)量不能僅僅針對(duì)某種特定功效一概而論。究其原因與中藥是多產(chǎn)地、多基原、多炮制規(guī)格的復(fù)雜體系密不可分。

2015年版《中國(guó)藥典》中收載的618種藥材中153種為多基原藥材，約占1/4，品種對(duì)中藥功效組分有重要影響。以甘草為例，烏拉爾甘草、脹果甘草和光果甘草均為藥典收載的甘草基原，傳統(tǒng)以烏拉爾甘草為質(zhì)優(yōu)道地藥材，但在解痙止痛功效比較研究中發(fā)現(xiàn)：脹果甘草最強(qiáng)，烏拉爾甘草較弱，光果甘草沒(méi)有此活性[26]。除此之外，目前的檢測(cè)指標(biāo)多從化學(xué)角度出發(fā)，尚存在與臨床功效不對(duì)應(yīng)的現(xiàn)象，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2015年版《中國(guó)藥典》中收載的31種中藥材含有阿魏酸，從現(xiàn)代研究、藥物分類、性味歸經(jīng)，基原等方面進(jìn)行比較均無(wú)專屬性；其中活血化瘀藥川芎、補(bǔ)益藥當(dāng)歸和解表藥藁本均以阿魏酸為檢測(cè)指標(biāo)，3種不同基原和功能的藥材及飲片在安全性和有效性方面與阿魏酸均沒(méi)有對(duì)應(yīng)性，脫離臨床治療疾病的宗旨[27]。因此，應(yīng)該以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，選擇與中醫(yī)臨床的功效主治相適應(yīng)的“活性成分”、“指標(biāo)成分”，多角度全方位進(jìn)行中藥質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)，為中醫(yī)臨床合理用藥，精準(zhǔn)用藥提供更多更為實(shí)際可用的資源，使中醫(yī)藥得以發(fā)揮其療效造福人類。

模式識(shí)別法于20世紀(jì)80年代引入化學(xué)研究領(lǐng)域，同時(shí)也逐漸應(yīng)用于中藥研究領(lǐng)域。中藥成分復(fù)雜、質(zhì)量受基原、產(chǎn)地、環(huán)境、采收、加工、炮制等的影響，僅靠傳統(tǒng)的性狀鑒別、顯微鑒別具有一定的不準(zhǔn)確性。而儀器分析的進(jìn)步使得質(zhì)量評(píng)價(jià)進(jìn)一步客觀準(zhǔn)確，結(jié)合模式識(shí)別理論，解決了依靠人工辨識(shí)的主觀性問(wèn)題，同時(shí)可以挖掘隱藏在樣本數(shù)據(jù)背后的關(guān)聯(lián)關(guān)系?；疑碚撝饾u應(yīng)用于中藥領(lǐng)域，目前灰色模式識(shí)別已成功應(yīng)用于當(dāng)歸[28]、甘草[29]、半夏[30]等植物藥，全蝎、蜈蚣、土鱉蟲、僵蠶等動(dòng)物藥[31]及牛黃解毒片[32]、維C銀翹片[33]等中成藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)。本文基于灰色模式識(shí)別和功效組分對(duì)25個(gè)道地產(chǎn)區(qū)大黃的質(zhì)量進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示甘肅天祝所產(chǎn)唐古特大黃“瀉下攻積”質(zhì)量最佳；四川雅江所產(chǎn)唐古特大黃“清熱解毒”質(zhì)量最佳；甘肅禮縣所產(chǎn)掌葉大黃“逐瘀通經(jīng)”的質(zhì)量最佳，為大黃質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立以及大黃藥用提供了參考和依據(jù)。模式識(shí)別技術(shù)的引入豐富中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)手段，更是為建立全面、有效的評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量提供了強(qiáng)有力的支持。

表3 不同產(chǎn)地大黃功效組分相對(duì)關(guān)聯(lián)度