荊文光，張 權(quán)，杜 杰，王繼永，孫曉波，蘭青山＊＊

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 北京 100193；2.中國(guó)中藥公司中藥研究院 北京 102600）

厚樸（Cortex Magnoliae Officinalis），始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，其后歷代本草均有記載，為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.或凹葉厚樸M.offcinalisRehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮[1]。厚樸性溫，味苦、辛，具有燥濕消痰、下氣除滿的功效，用于濕滯傷中、脘痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘、痰飲喘滿，臨床上用于治療慢性腹瀉、便秘、腸梗阻、急慢性胃炎、胃輕癱、胃十二指腸潰瘍等疾病[2]。厚樸主產(chǎn)于四川、湖北、安徽、浙江、湖南、江西等地，其中道地產(chǎn)區(qū)分布以湖北恩施為中心，其盛產(chǎn)的“紫油厚樸”質(zhì)量較佳；而產(chǎn)于湖南等地的凹葉厚樸占全國(guó)厚樸總產(chǎn)量的60%[3]。根據(jù)文獻(xiàn)記載，厚樸含有木脂素、苯乙醇苷、酚苷、生物堿、揮發(fā)油等多種活性成分[4]，其中厚樸酚與和厚樸酚作為厚樸中的代表性成分，現(xiàn)代藥理研究表明具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[5]；2015版《中華人民共和國(guó)藥典》現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以此兩種成分作為含量測(cè)定指標(biāo)。

文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC和GC法測(cè)定藥材、中成藥中厚樸酚及和厚樸酚含量較多，此外潘偉[6]等利用超高效液相色譜法測(cè)定消積化蟲(chóng)散中厚樸酚與和厚樸酚含量；夏麗珍[7]采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定藿香正氣水中厚樸酚與和厚樸酚的含量。對(duì)于厚樸藥材質(zhì)量控制，薛珍珍[8]等建立了厚樸酚類和水溶性成分HPLC含量測(cè)定方法；董佳悅[9]等分析建立了四川不同產(chǎn)地厚樸中揮發(fā)油和多糖的含量測(cè)定方法，為川厚樸產(chǎn)區(qū)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源篩選及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考；楊紅兵[10,11]對(duì)湖北恩施產(chǎn)厚樸的生物堿和揮發(fā)油進(jìn)行了定量分析；張怡辰[12]采用HPLC法初步分析了厚樸酚性成分的差異性與其質(zhì)量的相關(guān)聯(lián)系。除厚樸酚、和厚樸酚外，辣薄荷基厚樸酚是近年來(lái)從厚樸中分離得到的另一個(gè)同樣具有抗炎抗菌、細(xì)胞毒作用的木脂素成分[13-15]，由于其良好的藥理活性，日本學(xué)者已經(jīng)可以通過(guò)化學(xué)手段進(jìn)行其結(jié)構(gòu)的合成[16]，而天然的辣薄荷基厚樸酚在厚樸藥材中具體的含量分布情況未見(jiàn)報(bào)道。趙慧等[17]通過(guò)液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜技術(shù)對(duì)凹葉厚樸不同規(guī)格藥材的差異化學(xué)成分進(jìn)行分析，結(jié)果辣薄荷基厚樸酚可作為不同規(guī)格之間的差異性成分，基于此，非常有必要建立辣薄荷基厚樸酚的含量測(cè)定方法，因此本實(shí)驗(yàn)利用UPLC首次建立了同時(shí)測(cè)定厚樸藥材中和厚樸酚、厚樸酚和辣薄荷基厚樸酚的含量測(cè)定方法，同時(shí)對(duì)3種酚類含量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聚類分析，考察不同產(chǎn)地厚樸藥材中3種成分的含量，為全面控制厚樸藥材質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Acquity H-class型UPLC超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司，PDA檢測(cè)器，Empower 3工作站）；Mettler AE 240型1/10萬(wàn)電子天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司)；KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）

1.2 藥品與試劑

厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)KS0912CB14，純度≥98.0%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，和厚樸酚對(duì)照品（批號(hào)：T28O6B5149，純度≥98.0%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，辣薄荷基厚樸酚（峰面積歸一化法，純度≥98.0%，實(shí)驗(yàn)室自制）。甲醇（色譜純，Thermo Fisher公司），純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），其它試劑為分析純。

1.3 藥材

試驗(yàn)用厚樸樣品采自湖北恩施，安徽潛山、浙江麗水，經(jīng)中國(guó)中藥公司中藥研究院趙潤(rùn)懷研究員鑒定為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.和凹葉厚樸M.offcinalisRehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.，（表1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

分別精密稱和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品25.34 mg、厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品25.26 mg、辣薄荷基厚樸酚11.70 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，置于超聲波清洗機(jī)超聲溶解30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。分別精密吸取和厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 mL、厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液15 mL、辣薄荷基厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液12 mL于100 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度分別為0.203 mg·mL-1的和厚樸酚、0.152 mg·mL-1厚樸酚、0.056 mg·mL-1辣薄荷基厚樸酚混標(biāo)溶液。

表1 厚樸藥材樣品來(lái)源

2.2 供試品溶液制備

精密稱取厚樸藥材粉末樣品（過(guò)60目篩）約0.2 g，置于錐形瓶中，加25 mL甲醇冷浸24 h，過(guò)濾，置25 mL量瓶中，加甲醇溶液至刻度，搖勻備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH-Cl8柱（2.1 mm×50 mm,1.7 μm）；流動(dòng)相：A為0.2%甲酸水；B為甲醇；洗脫程序：0-2 min（65%-65%B），2-3 min（65%-75%B），3-5 min（75%-84%B），5-9 min（84%-90%B）；流速0.5 mL·min-1；柱溫35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm。

2.4 專屬性試驗(yàn)

分別吸取和厚樸酚、厚樸酚和辣薄荷基厚樸酚的混標(biāo)溶液和藥材供試品溶液各1 μL，在上述色譜條件下測(cè)定，結(jié)果3種被測(cè)成分在藥材供試品溶液色譜中與其他化合物分離均良好見(jiàn)圖1。同時(shí)供試品溶液中被測(cè)化合物的保留時(shí)間與3個(gè)對(duì)照品的保留時(shí)間一致，且從PDA獲取的被測(cè)成分與對(duì)照品的紫外光譜圖一致，說(shuō)明該方法具有良好的專屬性。

表2 和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚的回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R2）及線性范圍

圖1 厚樸藥材的UPLC

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 μL注入高效液相色譜儀分析，記錄厚樸酚、和厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚的峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量（μg，X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性回歸（表2）。

2.6 精密度試驗(yàn)

將混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次1 μL，記錄和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚的峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果分別為0.14%、0.12%和0.23%，表明儀器精密度較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，進(jìn)樣體積1 μL，記錄和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚的峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果分別為0.92%，1.15%和1.19%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批厚樸藥材樣品（編號(hào)6），按“2.2”項(xiàng)下方法操作，平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果和厚樸酚平均含量，厚樸酚平均含量、辣薄荷基厚樸酚平均含量分別為18.87，14.68，4.76 mg·g-1，RSD分別為1.04%，1.15%和1.14%，表明本法的重復(fù)性較好。

表3 和厚樸酚、厚樸酚、辣薄荷基厚樸酚回收率

2.9 加樣回收率

分別稱取已測(cè)定含量的厚樸藥材（過(guò)60目篩）約80 mg共9份，精密稱定，分別按80%、100%、120%比例加入各對(duì)照品適量，制備供試品溶液，測(cè)定3種成分的加樣回收率（表3）。

2.10 含量測(cè)定

精密稱取不同產(chǎn)地采集的厚樸藥材粉末樣品（過(guò)60目篩）0.2 g，分別按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以回歸方程計(jì)算含量（表4）。結(jié)果顯示和厚樸酚含量最高達(dá)2.65%，最低為0.24%；而厚樸酚含量維持在1.46-2.68%，15批次樣品兩者含量總和均高于2.0%，符合于2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》的要求。辣薄荷基厚樸酚的含量最高達(dá)0.87%，最低為0.05%。

2.11 聚類分析

對(duì)3個(gè)不同產(chǎn)地的15批次厚樸中3種木脂素成分含量使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用組間連接處理方法，距離的計(jì)算方法為Euclidean距離，進(jìn)行層次聚類分析（圖2），結(jié)果顯示15個(gè)樣本可分3大類，其中浙江麗水產(chǎn)凹葉厚樸（編號(hào)11-15號(hào)）聚為第一類；湖北恩施產(chǎn)厚樸（編號(hào)1、2、5、6）聚為第二類；安徽潛山產(chǎn)厚樸（編號(hào)7-10）以及湖北恩施編號(hào)3和編號(hào)4樣品聚為第三類。而本次實(shí)驗(yàn)中采集的湖北恩施和安徽潛山的厚樸藥材均為厚樸品種Magnolia officinalis Rehd.et Wils.，根據(jù)聚類結(jié)果最終這兩個(gè)產(chǎn)地的樣品聚為一大類，完全和采集于浙江麗水的凹葉厚樸M.offcinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.區(qū)分開(kāi)來(lái)，可見(jiàn)，來(lái)源于藥典的這兩個(gè)品種還是存在一定的區(qū)別，傳統(tǒng)厚樸道地產(chǎn)區(qū)的劃分具有合理性。

2.12 3種酚類含量的相關(guān)分析

厚樸酚與和厚樸酚作為厚樸中主要的活性成分已被證實(shí)，現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》以和厚樸酚、厚樸酚的總含量為控制指標(biāo)。辣薄荷基厚樸酚作為厚樸中的次生代謝產(chǎn)物，與厚樸酚在結(jié)構(gòu)上有相似性，且同樣具有類似的藥理活性，通過(guò)相關(guān)分析可大體反映出3種酚類成分含量之間的關(guān)系。本文通過(guò)SPSS 22.0軟件，采用Person相關(guān)分析對(duì)厚樸樣本中的3種酚類成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。從表5中可以看出，辣薄荷基厚樸酚的含量與厚樸酚、和厚樸酚以及二者的總量均有顯著的正相關(guān)性，而這種含量上的正相關(guān)性為辣薄荷基厚樸酚與厚樸酚、和厚樸酚在藥理活性的相似性以及協(xié)同作用方面提供了一定的線索。

3 討論

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[18-20]，分別考察了甲醇-水，乙腈-水、甲醇-0.2%甲酸、甲醇-0.2%磷酸水、甲醇-0.2%醋酸、乙腈-0.2%甲酸及乙腈-0.2%磷酸等系統(tǒng)梯度洗脫，結(jié)果顯示采用甲醇-0.2%甲酸水的梯度洗脫各個(gè)峰的峰型較好且有良好的分離效果，故選擇甲醇-0.2%甲酸水的梯度洗脫為洗脫條件。研究中分別考察了230、260、294和310 nm下3種成分的吸收情況，最后選擇294 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

表4 15批樣品含量測(cè)定表(n=2)

圖2 3種木脂素成分系統(tǒng)聚類分析結(jié)果

表5 3種酚類成分含量的相關(guān)性

由于3種木脂素成分均為脂溶性成分，故在提取溶劑的考察中，分別考察以甲醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇作為提取溶劑的提取效果，結(jié)果顯示3種溶劑提取效果相當(dāng)，采用甲醇提取的雜質(zhì)峰相對(duì)較少，因此選擇甲醇為提取溶劑。關(guān)于提取方法選擇，分別考察了甲醇24 h冷浸法（藥典法）、甲醇超聲提取1 h、甲醇水浴回流提取2 h等不同方法，結(jié)果表明藥典法甲醇冷浸24 h效率最高。對(duì)溶劑量進(jìn)行考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，溶劑體積為25 mL時(shí)可完全提取3種待測(cè)成分，故選擇25 mL甲醇作為溶媒用量。

厚樸為臨床常用中藥，使用廣泛，全面控制厚樸藥材的質(zhì)量是控制和保障其制劑質(zhì)量的有效手段之一。厚樸的傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)以湖北恩施為中心，產(chǎn)于湖北、四川的厚樸又稱為“川樸”，而產(chǎn)于浙江、福建等地的稱為“溫樸”，這與聚類分析的結(jié)果一致，而潛山所產(chǎn)厚樸從分析結(jié)果上看，辣薄荷基本厚樸酚的含量也相對(duì)較高，這可能與樣本生長(zhǎng)年限較長(zhǎng)有關(guān)。然而，來(lái)源于不同品種的厚樸聚為不同類，說(shuō)明厚樸與凹葉厚樸之間存在較大的差異，這與張春霞[18]報(bào)道的相對(duì)于樹(shù)齡與產(chǎn)地，種源（品種）對(duì)厚樸藥材質(zhì)量的影響較大的結(jié)論相符合。由于樣品收集有限，本次只選擇了3個(gè)產(chǎn)地主要產(chǎn)區(qū)15個(gè)樣本，未對(duì)全國(guó)其他產(chǎn)區(qū)如廣西資源，湖南道縣、陜西安康等地樣品進(jìn)行采集和測(cè)定，一定程度上影響了研究的深度。厚樸作為皮類中藥，并且作為國(guó)家二級(jí)保護(hù)中藥材，一般采收年限在15年之上，且藥典收載的厚樸還存在著不同的入藥部位，即不同的商品規(guī)格（枝樸、根樸、篼樸、筒樸），因此辣薄荷基厚樸酚作為厚樸藥材額外的質(zhì)量控制指標(biāo)在其他產(chǎn)區(qū)樣本、不同藥用部位以及不同樹(shù)齡的分布和含量累積情況將是下一步研究的重點(diǎn)。