暢鴿 劉俊果

(1 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，武漢 430030；2 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018)

截短側(cè)耳素(pleuromutilin)是一種三環(huán)二萜類抗生素，能夠有效抑制大部分革蘭陽(yáng)性菌以及部分革蘭陰性菌，同時(shí)也是大量截短側(cè)耳素類半合成衍生物(如泰妙菌素、沃尼妙林)的前體[1]。臨床上作為獸用抗生素廣泛使用[2]。截短側(cè)耳素類抗生素具有獨(dú)特的抗菌機(jī)制，其與細(xì)菌的核糖體50S亞單位上的獨(dú)特位點(diǎn)相結(jié)合，阻斷核糖體P區(qū)域，干擾肽酰轉(zhuǎn)移酶活性，從而選擇性地抑制細(xì)菌蛋白的合成。截短側(cè)耳素類抗菌藥物在體外與其他抗菌藥物(大環(huán)內(nèi)酯類、莫匹羅星或夫西地酸等)不發(fā)生靶特異的交叉耐藥(target-specific cross resistance)[3]。

近年來(lái)，隨著臨床病菌耐藥性的不斷增強(qiáng)，截短側(cè)耳素類抗生素由于其抑菌機(jī)制與臨床上的其他抗生素顯著不同，因此其作為人用藥制劑的開發(fā)也日益受到重視[4-5]。半合成抗生素瑞他莫林是第一個(gè)(2007年)獲準(zhǔn)用于人類的截短側(cè)耳素類抗菌藥物[6]。

截短側(cè)耳素目前利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)[7]，分子式為C22H34O5，相對(duì)分子量為378.51，結(jié)構(gòu)式如圖1。熔點(diǎn)為167～168℃。晶體呈乳白色，在酒精、丙酮、氯仿以及乙醚中易溶，在水中微溶，不溶于正己烷。具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性[8]。

發(fā)酵結(jié)束后，截短側(cè)耳素主要存在于菌絲體內(nèi)部，胞內(nèi)產(chǎn)物達(dá)90%以上[10]，目前主流的提取工藝過(guò)程主要為：板框過(guò)濾→干燥→有機(jī)溶劑浸提→溶劑蒸發(fā)得到粗品→石油醚脫脂→有機(jī)溶劑溶解→活性炭脫色→冷卻結(jié)晶[11]。盡管截短側(cè)耳素具有的抗菌活性，但其由于其水溶性差等問(wèn)題長(zhǎng)期制約著該類藥物在臨床上的開發(fā)利用。

文獻(xiàn)中有關(guān)截短側(cè)耳素溶解度研究的報(bào)道極為有限，遠(yuǎn)不能滿足技術(shù)與工藝開發(fā)的需求。本文通過(guò)對(duì)截短側(cè)耳素在不同溶劑環(huán)境(甲醇和乙醇在不同濃度不同溫度下)中溶解度的測(cè)定與數(shù)據(jù)分析，為優(yōu)化截短側(cè)耳素的提取工藝以及制劑提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)支持，同時(shí)也為截短側(cè)耳素各種制劑的開發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

圖1 截短側(cè)耳素結(jié)構(gòu)式[4]Fig.1 Moecular structure of pleuromutilin

截短側(cè)耳素，純度97.2%，浙江升華拜克生物股份有限公司提供。甲醇、乙醇均為分析純，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心提供，水為實(shí)驗(yàn)室自制去離子水。試驗(yàn)儀器：電熱恒溫水浴箱，DK-98-11， 天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)。MA30水份測(cè)定儀，Sartorius公司生產(chǎn)。分析天平AR1140以及XPE分析天平，Mettler-tolodo儀器(上海)有限公司。快速混勻器(SK-1)，金壇市富華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用平衡法測(cè)定溶解度。將甲醇、乙醇用水配制成10%～50%(體積分?jǐn)?shù))的溶液，加入截短側(cè)耳素，恒溫水浴箱內(nèi)保溫3h，使截短側(cè)耳素充分的溶解。期間每20min震蕩1次，若截短側(cè)耳素全部溶解，繼續(xù)加入適量截短側(cè)耳素，直到不溶為止。預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明，保溫3h可以保證溶解過(guò)程達(dá)到平衡。上清液即為達(dá)到溶解平衡的飽和溶液。用移液器取上層清液加入到水份測(cè)定儀MA30中，分別記錄蒸發(fā)前后的質(zhì)量，根據(jù)重量法計(jì)算截短側(cè)耳素的溶解度。試驗(yàn)完后，調(diào)整水浴鍋到其他溫度，重復(fù)上述試驗(yàn)步驟。針對(duì)溶解度在1mg/g以下的樣品，實(shí)驗(yàn)的取液量約100克。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，相對(duì)誤差不高于5%，取3次實(shí)驗(yàn)的平均值作為溶解度測(cè)量結(jié)果。按下式計(jì)算摩爾分?jǐn)?shù)溶解度：

式中，m1、m2和m3分別代表截短側(cè)耳素、溶劑(甲醇或乙醇)的質(zhì)量、水的質(zhì)量，M1、M2和M3分別代表截短側(cè)耳素、溶劑(甲醇或乙醇)的摩爾質(zhì)量、水的摩爾質(zhì)量。x1代表截短側(cè)耳素在整個(gè)體系中的摩爾分?jǐn)?shù)，x2代表溶劑(甲醇或乙醇)在溶劑體系中的摩爾分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 截短側(cè)耳素溶解度數(shù)據(jù)測(cè)定結(jié)果

本論文測(cè)定了對(duì)截短側(cè)耳素在體積分?jǐn)?shù)為0、10%、20%、30%、40%和50%甲醇溶液中分別在0、10、20、30、40和50℃下的溶解度和截短側(cè)耳素在體積分?jǐn)?shù)為0、10%、20%、30%、40%和50%的乙醇溶液中分別在0、10、20、30、40、50和60℃下的溶解度，結(jié)果分別見表1～2以及圖1～2。經(jīng)過(guò)誤差傳遞計(jì)算。表1～2中，摩爾分?jǐn)?shù)溶解度的相對(duì)誤差不超過(guò)0.2%。由這些圖表可以看出，隨著溫度的提高，隨溶劑中甲醇或乙醇含量的增加，截短側(cè)耳素的溶解度顯著同步增加。截短側(cè)耳素在不同乙醇-水復(fù)合溶劑中的溶解度總體上比在甲醇-水復(fù)合溶劑中的溶解度高。

2.2 截短側(cè)耳素溶解度數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)

2.2.1 多項(xiàng)式經(jīng)驗(yàn)方程關(guān)聯(lián)

在溶劑、溶質(zhì)和壓力等因素不變時(shí)，物質(zhì)溶解度由溫度決定，假設(shè)溶解度是隨溫度連續(xù)變化的，則溶解度是可以用溫度的多項(xiàng)式方程來(lái)表示[12]：

公式中，x1為截短側(cè)耳素的摩爾分?jǐn)?shù)溶解度，T為絕對(duì)溫度K，B0、B1、B2和B3則是多項(xiàng)式經(jīng)驗(yàn)方程系數(shù)。將所測(cè)得的截短側(cè)耳素溶解度數(shù)據(jù)采用上式進(jìn)行關(guān)聯(lián)，得到的多項(xiàng)式經(jīng)驗(yàn)方程中的參數(shù)值見表3。

由表3可以看出，多項(xiàng)式經(jīng)驗(yàn)方程很好的擬合了截短側(cè)耳素溶解度數(shù)據(jù)，回歸系數(shù)都在0.994以上，因此可以認(rèn)為得到的這些回歸方程可以用于估計(jì)截短側(cè)耳素溶解度在不同溫度下溶解度。

2.2.2 Apelblat

方程關(guān)聯(lián)Abelblat等假定溶液的焓變?yōu)闇囟鹊木€性函數(shù)方程，進(jìn)而推導(dǎo)出摩爾分?jǐn)?shù)溶解度和絕對(duì)溫度之間存在下述關(guān)系[13-15]：

表1 截短側(cè)耳素在不同甲醇-水復(fù)合溶劑中的摩爾分?jǐn)?shù)溶解度(104 x1)Tab. 1 Solubilties of pleuromutilin in binary solvents of methanol-water(104 x1)

表2 截短側(cè)耳素在不同乙醇-水復(fù)合溶劑中的摩爾分?jǐn)?shù)溶解度(104 x1)Tab. 2 Solubilties of pleuromutilin in binary solvents of ethanol-water (104 x1)

圖2 截短側(cè)耳素在不同甲醇-水復(fù)合溶劑中的溶解度Fig.2 Solubilties of pleuromutilin in binary solvents of methanol-water

圖3 截短側(cè)耳素在不同乙醇-水復(fù)合溶劑中的溶解度Fig.3 Solubilties of pleuromutilin in binary solvents of ethanol-water

表3 截短側(cè)耳素溶解度多項(xiàng)式經(jīng)驗(yàn)方程關(guān)聯(lián)結(jié)果Tab. 3 Parameters of general single model for pleuromutilin in binary solvents of methanol-water and ethanol-water

公式中，x1為截短側(cè)耳素的摩爾分?jǐn)?shù)溶解度，T為絕對(duì)溫度K，A、B、C則是方程經(jīng)驗(yàn)系數(shù)。將所測(cè)得的截短側(cè)耳素溶解度數(shù)據(jù)采用Abelblat方程進(jìn)行關(guān)聯(lián)，得到的方程中的參數(shù)值見表4。

由表4的結(jié)果可以看出，Apelblat方程也很好的擬合了截短側(cè)耳素溶解度數(shù)據(jù)，回歸系數(shù)都在0.993以上，因此可以認(rèn)為得到的這些Apelblat回歸方程可以用于估計(jì)截短側(cè)耳素溶解度在不同溫度下溶解度。

2.2.3 截短側(cè)耳素溶解過(guò)程熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算

根據(jù)范特霍夫方程，對(duì)真溶液來(lái)說(shuō)，某物質(zhì)摩爾分?jǐn)?shù)溶解度的自然對(duì)數(shù)與絕對(duì)溫度的倒數(shù)呈線性關(guān)系[16-17]，式中，ΔHF、ΔSF分別是溶解過(guò)程的表觀摩爾焓變和摩爾熵變，R是氣體常數(shù)，T為絕對(duì)溫度K：

據(jù)此，截短側(cè)耳素溶解度的自然對(duì)數(shù)對(duì)1/T進(jìn)行回歸，回歸直線(回歸系數(shù)都在0.98以上)分別見圖4～5。因此，ΔHF、ΔSF可以根據(jù)直線的斜率與截距計(jì)算出來(lái)，結(jié)果見表5。由表5可以看出，截短側(cè)耳素在甲醇(或乙醇)-水復(fù)合溶劑中的溶解過(guò)程焓變都是正值，且隨著溶劑中醇含量的增加而增加。溶解過(guò)程的熵變?cè)诩兯惺秦?fù)值，隨著溶劑中醇含量的增加，熵變也隨之增加。這些結(jié)果說(shuō)明，截短側(cè)耳素在甲醇(或乙醇)-水復(fù)合溶劑中的溶解過(guò)程是一吸熱過(guò)程，隨溶劑中不斷增加的熵變成為溶解度大幅提升的主要驅(qū)動(dòng)力。

表4 截短側(cè)耳素溶解度Abelblat方程關(guān)聯(lián)結(jié)果Tab. 4 Parameters of Apelblat equation for pleuromutilin in binary solvents of methanol-water and ethanol-water

圖4 截短側(cè)耳素在甲醇-水復(fù)合溶劑中的溶解度范特霍夫方程線性回歸結(jié)果圖Fig.4 Avan't Hoff plot of mole fraction solubility (lnx1)pleuromutilin in binary solvents of methanol-water

3 結(jié)論

本研究測(cè)定了截短側(cè)耳素在不同甲醇(乙醇)-水復(fù)合溶劑中的溶解度，并采用多項(xiàng)式經(jīng)驗(yàn)方程和Apelblat方程進(jìn)行關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，隨著溫度的提高，隨溶劑中甲醇或乙醇含量的增加，截短側(cè)耳素的溶解度顯著同步增加。截短側(cè)耳素在不同甲醇-水復(fù)合溶劑中的溶解度總體上比在甲醇-水復(fù)合溶劑中的溶解度高。同一溫度下，截短側(cè)耳素在純水中的溶解度最低。多項(xiàng)式經(jīng)驗(yàn)方程和Apelblat方程都能很好擬合截短側(cè)耳素溶解度數(shù)據(jù)，回歸系數(shù)都在0.993以上。熱力學(xué)分析表明，截短側(cè)耳素在甲醇(或乙醇)-水復(fù)合溶劑中的溶解過(guò)程焓變都是正值，且隨著溶劑中醇含量的增加而增加。溶解過(guò)程的熵變?cè)诩兯惺秦?fù)值，隨著溶劑中醇含量的增加，熵變也隨之增加。這些結(jié)果說(shuō)明，截短側(cè)耳素在甲醇(或乙醇)-水復(fù)合溶劑中的溶解過(guò)程是一吸熱過(guò)程，隨溶劑中不斷增加的熵變成為溶解度大幅提升的主要驅(qū)動(dòng)力。本研究結(jié)果可為截短側(cè)耳素的提取工藝優(yōu)化及制劑工藝開發(fā)提供重要的理論支撐。

圖5 截短側(cè)耳素在乙醇-水復(fù)合溶劑中的溶解度范特霍夫方程線性回歸結(jié)果圖Fig.5 Avan't Hoff plot of mole fraction solubility (lnx1)pleuromutilin in binary solvents of ethanol-water

表5 截短側(cè)耳素溶解過(guò)程熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算結(jié)果Tab. 5 Thermodynamic paramters of pleuromutilin solution