陸靜嫻，李志敏，葉勤，吳輝

華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237

石化基聚合物塑料的生產(chǎn)需要消耗不可再生資源，在生產(chǎn)和焚燒過程中排放溫室氣體，降解困難，存在諸多的資源和環(huán)境問題。生物基聚合物采用生物發(fā)酵可再生資源的生產(chǎn)方式，且能自然降解，給上述問題的解決提供了有效的途徑，在國內(nèi)外引起了廣泛關(guān)注[1-4]。聚3-羥基丁酸乳酸酯[P(3HB-co-LA)]是聚羥基脂肪酸酯(PHA)家族的一員。P(3HB-co-LA)的機(jī)械性能和物理性能與常規(guī)塑料類似，并具有很多優(yōu)點(diǎn)，如良好的生物降解性、生物相容性和低毒性，可用于生物醫(yī)學(xué)、食品及日常用的高價(jià)值材料[5-9]。P(3HB-co-LA)的聚合單體來源于3-羥基丁酸和乳酸。作為共聚物，P(3HB-co-LA)與剛性的聚乳酸(PLA)[10]、不透明且呈脆性的聚3-羥基丁酸(PHB)均聚物相比，彈性和透明度更優(yōu)。這意味著P(3HB-co-LA)具有更廣闊的應(yīng)用前景[11-12]。

2008年Taguchi等[13]首次在大腸桿菌中成功合成聚羥基丁酸乳酸酯[P(3HB-co-LA)]，其中聚合物的乳酸組分的摩爾百分比為6%。為了提高聚合物中乳酸的含量，Yamada等[14]通過厭氧發(fā)酵，將聚合物中乳酸組分的摩爾百分比提高至47%。厭氧培養(yǎng)可以有效積累乳酸，但厭氧培養(yǎng)嚴(yán)重阻礙了菌體的生長，同時(shí)阻礙菌體中聚合物的積累，因此聚合物含量僅為2 wt%。同年Yang等[15]通過易錯(cuò)PCR和飽和突變分別增加了Pctcp對(duì)乳酸的底物特異性，以及PhaC1PS6-19對(duì)2-羥基丙酰CoA的底物特異性，在添加前體3HB的情況下生產(chǎn)出乳酸組分的摩爾百分比達(dá)49%，聚合物含量為53.5 wt%的P(3HB-co-LA)。

P(3HB-co-LA)中乳酸組分的摩爾百分比的限制條件之一是胞內(nèi)乳酸的生產(chǎn)水平。為了在有氧條件下增加乳酸的積累，需要弱化呼吸鏈水平。Wu等[16]通過敲除輔酶Q8生物合成途徑中的UbiX，引入輔酶Q8合成的底物競爭途徑，減弱呼吸鏈關(guān)鍵成分輔酶Q8的合成，降低呼吸鏈活性，進(jìn)而在有氧發(fā)酵中實(shí)現(xiàn)乳酸積累。本研究采用此調(diào)控新策略，通過減弱呼吸鏈強(qiáng)度來營造細(xì)胞微耗氧能力，希望實(shí)現(xiàn)在提高共聚物P(3HB-co-LA)的聚合前體乳酸濃度的同時(shí)，減弱厭氧環(huán)境對(duì)細(xì)胞生長和聚合物合成造成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

研究所使用的菌株和質(zhì)粒見表1，質(zhì)粒構(gòu)建和基因敲除所使用的引物見表2。

1.1.2 試劑

高保真PCR酶primerstar、高保真T4-DNA連接酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SacⅠ和BamHⅠ酶，均購自TaKaRa公司；CloneExpress?MultiS One Step Cloning Kit 試劑盒購自諾唯贊公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷、L-阿拉伯糖、氨芐青霉素、氯霉素等購自捷貝思基因技術(shù)有限公司；瓊脂糖購自阿拉丁試劑公司；膠回收試劑盒，質(zhì)粒小提試劑盒等購自生工生物工程公司；三氯甲烷、甲醇購自國藥集團(tuán)。

表1 本文中所用到的質(zhì)粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 (LB液體培養(yǎng)基) 每升含：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，根據(jù)需要加入氨芐青霉素100 mg和氯霉素 34 mg。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (M9培養(yǎng)基) 每升含：葡萄糖20g，Na2HPO4·12H2O 15.1 g，KH2PO43.0g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.011 g，vitamin B110 mg和微量元素儲(chǔ)存液0.1 mL。按需加入氨芐青霉素100 mg和氯霉素34 mg。不添加乳酸。微量元素儲(chǔ)存液每升含有FeSO4·7H2O 80 g，AlCl3·6H2O10 g，ZnSO4·7H2O2.0g，CuCl2·2H2O 1.0 g，NaMoO4·2H2O2.0 g，MnSO4·H2O 10g，CoCl24.0g，H3BO40.5g。

1.2 方法

1.2.1 重組菌的構(gòu)建

通過基于λ-red 重組系統(tǒng)介導(dǎo)的PCR 產(chǎn)物一步法[17]敲除E.coliMG1655中的ubiX基因，得到單缺失菌JX04。在單缺失菌JX04的基礎(chǔ)上敲除dld基因，得到雙缺失菌JX041。為了增加PHA合成酶(PhaC)對(duì)2-羥基丙酰CoA的聚合能力，需要對(duì)PhaC設(shè)計(jì)氨基酸突變。通過與Taguchi等[13]和Yang等[15]研究中使用的PhaC突變體進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，本實(shí)驗(yàn)中熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescensstrain 2P24來源的PhaCm的3個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)為E130D、S325T、Q481K。突變體phaCm基因由生工生物工程公司經(jīng)過密碼子優(yōu)化合成。

phaA基因通過酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和SacⅠ酶切連接到pTrc99a上，phaB基因通過諾唯贊公司的Clone Express?MultiS One Step Cloning Kit試劑盒連接到pTrc99a上，phaCm基因通過酶切位點(diǎn)BamHⅠ和HindⅢ酶切連接到pTrc99a上，這3個(gè)基因串聯(lián)構(gòu)建了質(zhì)粒pTrc99aABC。突變體pctth基因來源于丙酸梭菌Clostridium propionicumDSM 1682，包含1個(gè)氨基酸突變V193A和4個(gè)沉默突變 (T78C，T669C，A1125G，T1158C)，通過SacⅠ和SmaⅠ位點(diǎn)酶切連接到pBAD33質(zhì)粒上，將其命名為pBADpctth。

表2 本文中所用到的引物Table 2 Primers used in this study

1.2.2 搖瓶發(fā)酵

重組菌在含有100 mg/L的氨芐青霉素和34 mg/L的氯霉素的LB培養(yǎng)基中37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。隨后按1%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)入M9培養(yǎng)基中，250 mL搖瓶的裝液量為50 mL，在培養(yǎng)溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為220 r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)48 h，并加不同濃度的IPTG和L-阿拉伯糖誘導(dǎo)。取樣時(shí)間點(diǎn)為0、12、24、36、48 h。所有的搖瓶發(fā)酵設(shè)置3個(gè)平行，最終結(jié)果為3個(gè)平行的平均值。

1.2.3 HPLC分析

發(fā)酵過程中葡萄糖、乳酸、乙酸的濃度用HPLC測定。將–20 ℃凍存的上清液常溫解凍后稀釋，用0.22 μm的水相微孔濾膜過濾。檢測條件如下：流動(dòng)相為2.5 mmol/L稀硫酸，色譜柱為Aminex HPX-87H (Bio-Rad，USA)，流速0.5 mL/min，柱溫50 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測器為示差檢測器。通過與葡萄糖、乳酸、乙酸標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，得出發(fā)酵過程中葡萄糖、乳酸、乙酸的代謝情況。

1.2.4 聚合物的萃取和分析

用于氣相檢測的樣品處理方法：將發(fā)酵液冷凍干燥2 d后，稱取約15 mg干菌體，加入1.5 mL氯仿和1.5 mL酯化液 (85 wt%甲醇，15 wt%硫酸，1 g/L苯甲酸) 100 ℃恒溫萃取4 h。冷卻后，加入750 mL的去離子水，旋渦振蕩2 min，3 000 r/min低速離心3 min。取下層 (氯仿層)，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，用0.22 μm的有機(jī)相微孔濾膜過濾。D-乳酸和3HB標(biāo)樣用同樣的方法處理[18]。

細(xì)胞中聚合物的含量和單體組成通過GC-2014氣相色譜儀 (島津，日本) 測定。色譜柱為rx-5毛細(xì)管柱，長30 m，內(nèi)徑0.25 mm。檢測器為火焰離子化檢測器。使用高純氮?dú)鉃檩d氣，氫氣為燃?xì)猓諝鉃橹細(xì)?。使用AOC-20S型自動(dòng)化進(jìn)樣器，乙醇作為清洗劑。GC分析程序?yàn)椋洪_始時(shí)于54 ℃停留4 min，再以5 ℃/min的速度升溫至125 ℃，隨后以20 °C/min的速度升溫至180 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚羥基丁酸乳酸酯合成途徑的打通

聚羥基丁酸乳酸酯[P(3HB-co-LA)]的前體為2-羥基丙酰CoA和3-羥基丁酰CoA。其中2-羥基丙酰CoA由乳酸和乙酰CoA經(jīng)過丙酰CoA轉(zhuǎn)移酶突變體 (Pctth) 催化合成，3-羥基丁酰CoA是由乙酰CoA，通過來源于羅爾斯通氏菌Ralstonia eutropha的β-酮基硫解酶 (PhaA) 和NADPH依賴的乙酰乙酰CoA還原酶 (PhaB)，經(jīng)過兩步催化轉(zhuǎn)化而成。這兩個(gè)前體經(jīng)過來源于Pseudomonas fluorescensstrain 2P24的PHA合成酶突變體(PhaCm) 的聚合形成共聚物，聚合物的代謝途徑如圖1A所示。通過pTrc99a質(zhì)粒表達(dá)phaA、phaB和phaCm，構(gòu)建質(zhì)粒pTrc99aABC。通過pBAD33質(zhì)粒表達(dá)pctth，構(gòu)建質(zhì)粒 pBADpctth。質(zhì)粒pTrc99aABC和pBADpctth的構(gòu)建如圖1B所示。

圖1 代謝工程大腸桿菌中P(3HB-co-LA) 合成途徑 (A) 和重組質(zhì)粒pTrc99aABC、pBADpctth構(gòu)建圖 (B)Fig.1 Poly(3-hydroxybutyrate-co-lactate) synthesis pathway in metabolically engineered E.coli (A) and construction of recombinant plasmids pTrc99aABC and pBADpctth (B).The genes shown are as follows: phaA, β-ketothiolase; pctth,evolved propionyl-CoA transferase; phaB, NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase; phaCm, evolved polyhydroxyalkanoate synthase; ubiX, flavin prenyltransferase; dld, D-lactate dehydrogenase; idi, IPP isomerase.Metabolites shown are as follows: G6P, glucose 6-phosphate; G3P, glyceraldehyde 3-phosphate; PGA,3-phosphoglycerate; PEP, phosphoenolpyruvate; PYR, pyruvate; LA, lactate; LA-CoA, lactyl-CoA; Ac-CoA,acetyl-CoA; IPP, isopentenyl diphosphate; DMAPP, dimethylallyl diphosphate.

將帶有pTrc99aABC和pBADpctth的重組大腸桿菌命名為MG-01，將攜帶pTrc99aABC和pBAD33質(zhì)粒的重組大腸桿菌命名為MG-C。其中，MG-C不攜帶pctth基因，為對(duì)照菌株。氣相結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中不添加乳酸的條件下，不含pctth基因的MG-C菌株發(fā)酵生產(chǎn)的聚合物中不含乳酸組分，即生產(chǎn)的是均聚物PHB。而使用MG-01菌株時(shí)，聚合物中有乳酸組分出現(xiàn)，聚合物中乳酸組分的摩爾百分比達(dá)到1.6%，聚合物含量為83.9 wt%。這表明pctth具有合成2-羥基丙酰CoA的能力。因此通過引入外源的phaA、phaB、pctth和phaCm，我們成功地在大腸桿菌中建立起了聚羥基丁酸乳酸酯合成途徑。

2.2 調(diào)節(jié)P(3HB-co-LA)合成途徑對(duì)聚合物中乳酸單體含量的影響

2.2.1 不同強(qiáng)度Pctth酶表達(dá)的影響

雖然以上實(shí)驗(yàn)可得到共聚物，但聚合物中乳酸組分的摩爾百分比較低，僅為1.6%，因此推測可能是由于PHA的底物2-羥基丙酰CoA的濃度較低造成的。由圖1可知，在胞內(nèi)積累2-羥基丙酰CoA，最直接的方法就是增強(qiáng)催化乳酸轉(zhuǎn)化為2-羥基丙酰CoA的Pctth酶的催化活性。

合適的蛋白折疊是發(fā)揮酶生物活性的重要因素，而誘導(dǎo)劑濃度是影響蛋白折疊的重要因素之一[19]。因此，通過設(shè)置誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖的濃度梯度來優(yōu)化Pctth酶的表達(dá)。如圖2所示，當(dāng)誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖的濃度從10 mmol/L上升到50 mmol/L時(shí)，聚合物中乳酸組分的摩爾百分比也由1.9%上升至4.0%。而pctth基因表達(dá)的增強(qiáng)對(duì)聚合物在細(xì)胞中的含量影響不大，聚合物含量維持在79 wt%到84 wt%之間。當(dāng)誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖濃度高于40 mmol/L時(shí)，聚合物中乳酸含量增加不明顯。這可能是因?yàn)楸M管隨著誘導(dǎo)劑濃度增加，阿拉伯糖啟動(dòng)子達(dá)到誘導(dǎo)極限，Pctth酶的蛋白表達(dá)量幾乎無變化；或者，由于底物乳酸或者輔酶A供應(yīng)的限制，聚合物中乳酸的摩爾百分比無法得到提高。基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果，50 mmol/L的L-阿拉伯糖進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 L-arabinose濃度梯度下聚合物含量及聚合物中LA含量的變化Fig.2 Content changes of polymer and LA fraction with different L-arabinose concentrations.

2.2.2 不同強(qiáng)度PHA合成途徑的影響

在聚合物的合成過程中，胞內(nèi)的乙酰CoA既是合成3HB-CoA的底物，又是2-羥基丙酰CoA的輔酶A供體，即2-羥基丙酰CoA的積累與3HB-CoA的生成存在競爭關(guān)系。因此，提高2-羥基丙酰CoA的供應(yīng)需要減弱3HB-CoA的生產(chǎn)。但另一方面，3HB-CoA是P(3HB-co-LA)聚酯合成的引發(fā)劑，是其合成所必需的[20]，若胞內(nèi)3HB-CoA的含量太低，不利于聚合物的合成。為了平衡這一矛盾，需要選出合適的IPTG濃度來誘導(dǎo)聚合途徑。

如圖3所示，當(dāng)IPTG濃度為0.01 mmol/L和0.02 mmol/L時(shí)，聚合物中乳酸組分的摩爾百分比均低于1%。這表明當(dāng)IPTG濃度過低時(shí)，PHA聚合酶接受底物2-羥基丙酰CoA的效率降低，這同樣影響了聚合物中乳酸組分的摩爾百分比。當(dāng)IPTG濃度為0.05 mmol/L時(shí)，聚合物中乳酸組分的摩爾百分比提高到4.2%。當(dāng)IPTG濃度為0.1 mmol/L時(shí)，聚合物中乳酸組分的摩爾百分比達(dá)到峰值5.1%，此時(shí)聚合物占細(xì)胞干重的比例也達(dá)到最小值76.2 wt%。當(dāng)IPTG濃度高于0.1 mmol/L，聚合物中的乳酸組分的摩爾百分比略有下降。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用0.1 mmol/L的IPTG進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖3 IPTG濃度梯度下聚合物含量及聚合物中乳酸含量的變化Fig.3 Content changes of polymer and LA fraction with different IPTG concentrations.

2.3 呼吸鏈弱化對(duì)聚合物合成前體供應(yīng)的影響

提高P(3HB-co-LA) 中乳酸單體含量的另一策略是增強(qiáng)胞內(nèi)乳酸的積累。針對(duì)重組大腸桿菌MG-01進(jìn)行了不同裝液量 (50、75和100 mL) 的搖瓶 (250 mL) 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明乳酸積累的峰值會(huì)隨著裝液量的增加而提高，但會(huì)造成較高濃度的乙酸的積累，這會(huì)使菌體干重和聚合物含量的下降，從而影響聚合物產(chǎn)量。與此同時(shí)，Yamada等[14]在厭氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)P(3HB-co-LA)的實(shí)驗(yàn)證明了通氧量降低對(duì)菌體生長的影響。Wu等[16]的調(diào)控策略表明通過弱化呼吸鏈水平可以有效積累乳酸，同時(shí)減少對(duì)菌體生長的影響。輔酶Q8是呼吸鏈的重要組成，通過減弱輔酶Q8的生成，可以弱化呼吸鏈水平。在大腸桿菌中，UbiX和UbiD是一對(duì)同工酶，共同參與輔酶Q8生物合成的初期階段，將4-羥基-3-辛?；郊姿?(HP8B)轉(zhuǎn)換為2-辛?；椒?。通過ubiD或ubiX基因的單缺失可以將大腸桿菌中的Q8含量減少至野生型的20%–25%。因此文中構(gòu)建了ubiX基因缺失的突變株JX04 (圖4)，擬通過此策略部分降低輔酶Q8的合成，從而減弱突變株的呼吸鏈強(qiáng)度。

Choi等[21]發(fā)現(xiàn)，在接近發(fā)酵后期時(shí)，D-乳酸的濃度減少，這是由于dld基因編碼的D-乳酸脫氫酶將D-乳酸反轉(zhuǎn)為丙酮酸。為了消除這一現(xiàn)象對(duì)聚合物中乳酸組分的摩爾百分比的影響，如圖4所示，我們?cè)贘X04中進(jìn)一步敲除D-乳酸脫氫酶基因，得到雙缺失菌，將其命名為JX041。

在添加了20 g/L葡萄糖的M9培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)36 h以觀察野生菌和缺失菌的生長和乳酸積累情況。如圖5A所示，與MG1655相比，單缺失菌JX04和雙缺失菌JX041的生長都有所放緩，這是由于弱化呼吸鏈造成的生長遲緩。最終，單缺失菌和雙缺失菌的干重均能達(dá)到野生型水平。JX04和JX041消耗的葡萄糖與MG1655相近，MG1655積累較多的乙酸，而JX04和JX041中乳酸的積累量較多，整體pH變化相似。由于聚合途徑未引入，細(xì)胞沒有蛋白過表達(dá)及聚合物合成的代謝負(fù)擔(dān)，因此弱化呼吸鏈只造成生長遲緩，但未影響到最終的細(xì)胞濃度。

圖4 ubiX、dld基因敲除菌落PCR驗(yàn)證電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR identification of ubiX knockout in MG1655 and dld knockout in MG1655ΔubiX.M: marker; C1: MG1655 control group; C2: MG1655ΔubiX control group; 1–4:MG1655ΔubiX; 5–8: MG1655ΔubiXΔdld.

三種宿主菌的乳酸積累如圖5C所示，JX04和MG1655的乳酸積累均在搖瓶培養(yǎng)的15 h左右達(dá)到峰值。其中，單缺失菌JX04的乳酸峰值為0.21 g/L，是野生型MG1655的2倍。這表明弱化呼吸鏈可以有效積累乳酸。與野生型和單缺失菌不同，雙缺失菌JX041在搖瓶培養(yǎng)后期的乳酸濃度呈上升狀態(tài)，搖瓶培養(yǎng)終點(diǎn)時(shí)乳酸積累達(dá)0.28 g/L。這表明D-乳酸脫氫酶基因的敲除有效抑制了乳酸在發(fā)酵后期的利用。值得一提的是，在搖瓶培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，兩種缺失菌積累的乙酸含量均為0.8 g/L，是野生型的61.5%。這表明，敲除ubiX基因在有效積累乳酸的同時(shí)，減少了乙酸副產(chǎn)物的生成。即碳代謝流由積累乙酸的方向轉(zhuǎn)向生成乳酸的方向。

2.4 弱化呼吸鏈水平對(duì)聚羥基丁酸乳酸酯合成的影響

將包含了pTrc99aABC和pBADpctth質(zhì)粒的野生菌、單缺失菌和雙缺失菌分別命名為MG-01、JX04-01和JX041-01。在M9培養(yǎng)基中添加0.1 mmol/L IPTG、50 mmol/LL-阿拉伯糖和20 g/L葡萄糖，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)48 h，以評(píng)價(jià)重組菌的性能。生長方面，如圖6A所示，單缺失菌JX04-01菌體干重為2.5 g/L，雙缺失菌JX041-01菌體的干重為2.6 g/L，分別為MG-01的62.5%和65.0%。菌體干重的差異一方面可能是由于加入雙質(zhì)粒后，外源聚合途徑的引入以及聚合物合成所需要的底物和能量使細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)加大，弱化呼吸鏈造成的細(xì)胞能量差別效應(yīng)也隨之加大，導(dǎo)致了JX04-01和JX041-01生長受到一定的限制。另一方面，大腸桿菌代謝過程中，副產(chǎn)物乙酸的積累會(huì)嚴(yán)重影響重組大腸桿菌的蛋白合成與生長。MG-01在聚合物生產(chǎn)過程中積累的乙酸被重新利用，在發(fā)酵后期乙酸濃度降低為0 g/L。與缺失菌相比，MG-01在發(fā)酵過程中可以保持較低的乙酸濃度和更適宜的pH值，因此其菌體干重高于JX04-01和JX041-01。乳酸積累方面，如圖6C所示，加入雙質(zhì)粒后，雙缺失菌JX041-01的乳酸積累在發(fā)酵后期可達(dá)1.1 g/L。

圖5 三種宿主菌的生長和代謝Fig.5 Time-courses of cell density (A), glucose (B), lactate (C), and acetate (D) for three different host strains.

圖6 3種重組菌的生長、代謝和聚合物生產(chǎn)情況Fig.6 Time-courses of cell density (A), glucose (B), lactate (C), acetate (D) and polymer production (E) for three recombinant strains.

聚合物生產(chǎn)方面，如圖6E所示，在單缺失菌JX04-01中生產(chǎn)P(3HB-co-LA)，乳酸組分的摩爾百分比可由5.1%提高至9.1%。在雙缺失菌中，共聚物中的乳酸組分的摩爾百分比可進(jìn)一步提高至14.1%，是野生型中的2.8倍。這表明，胞內(nèi)乳酸含量的積累有益于提高聚合物中乳酸組分的摩爾百分比。胞內(nèi)的聚合物含量在3種重組菌中無明顯變化，保持在76.3 wt%–81.7 wt%之間。同時(shí)在雙缺失菌中，聚合物產(chǎn)量可達(dá)到2.1 g/L，為野生型的68.9%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，弱化呼吸鏈水平同時(shí)敲除dld基因的策略可有效提高聚合物中乳酸組分的摩爾百分比，聚合物在胞內(nèi)的含量無明顯變化。

3 結(jié)論

本研究通過在大腸桿菌中過表達(dá)β-酮硫解酶、乙酰乙酰CoA還原酶、丙酰CoA轉(zhuǎn)移酶突變體和PHA合成酶突變體，實(shí)現(xiàn)了由葡萄糖一步法合成P(3HB-co-LA)。在最初合成的聚合物中，乳酸組分的摩爾百分比僅為1.6%，為了提高共聚物中乳酸的含量，通過增加L-阿拉伯糖濃度來增強(qiáng)Pctth酶的表達(dá)，通過設(shè)置較低的IPTG濃度梯度，在限制碳代謝流流向3HB-CoA方向的同時(shí)維持PHA聚合酶的表達(dá)，從而將聚合物中乳酸組分的摩爾百分比提高到5.1%，此時(shí)聚合物含量為76.2 wt%。

呼吸鏈中輔酶Q8量的變化能夠引起整個(gè)代謝流的重新分配。在敲除黃素異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因 (ubiX) 后，輔酶Q8的生物合成部分受阻，碳代謝流向乳酸方向積累。聚合物中乳酸組分的摩爾百分比提高到9.1%。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲除D-乳酸脫氫酶基因 (dld)，減少了乳酸在發(fā)酵后期催化成丙酮酸，聚合物中的乳酸組分的摩爾百分比提高到14.1%，聚合物含量可達(dá)81.7 wt%，聚合物產(chǎn)量為2.1 g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，弱化呼吸鏈水平可有效提高P(3HB-co-LA) 中乳酸組分的摩爾百分比。

致 謝清華大學(xué)陳國強(qiáng)教授為本研究提供丙酰CoA轉(zhuǎn)移酶突變體基因(pctth)，在此表示衷心的感謝！