崔旭，陶妍，王強(qiáng)厚，張亞莉，顏倩倩

上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306

防御素是生物機(jī)體在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中保留下來(lái)的自身防御機(jī)制中的重要組成成分，是機(jī)體抵御外來(lái)病原微生物入侵的重要屏障，在機(jī)體的先天性免疫中發(fā)揮重要的作用[1-4]。1960年美國(guó)洛克菲勒研究所Cohn等[5]首次從兔的多形核白細(xì)胞中提取出此類具有殺菌活性的陽(yáng)離子蛋白，其具有抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的作用，并能抑制蛋白水解酶的作用，他們將其命名為“Phagocytin” (吞噬素)；六年以后，北卡羅萊納大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Zeya等[6-7]經(jīng)過(guò)一系列研究證實(shí)了“吞噬素”實(shí)際上是存在于胞質(zhì)顆粒內(nèi)的富含精氨酸和半胱氨酸的堿性陽(yáng)離子多肽, 并稱之為“Lysosomal cationic proteins” (溶酶體陽(yáng)離子蛋白)，且此類多肽顯示了對(duì)大腸桿菌的抑制作用。20世紀(jì)80年代中期，加州大學(xué)洛杉磯分校醫(yī)學(xué)院的Ganz等[8]首次以“Defensin” (防御素) 命名此類多肽；之后人體內(nèi)存在的3種α-防御素(HNP-1、HNP-2、HNP-3) 被證實(shí)對(duì)病原微生物、流感病毒、巨細(xì)胞病毒和水泡型口炎病毒等具有殺滅或抑制作用[9-10]；并且，研究顯示，經(jīng)HNP免疫的小鼠血清中免疫球蛋白的量明顯增加[11]。21世紀(jì)初，美國(guó)洛克菲勒大學(xué)華人科學(xué)家張林琦在Science發(fā)表論文，稱其用蛋白芯片法分離并識(shí)別出人體內(nèi)T-細(xì)胞分泌的具有抑制艾滋病病毒復(fù)制作用的因子，即為α-防御素，為艾滋病的治療提供了新的方向[12]。綜上所述，防御素具有較廣譜的抑菌作用、抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能，是開(kāi)發(fā)天然免疫蛋白和天然抑菌劑的良好候選者。

迄今為止，國(guó)內(nèi)外在防御素的研究方面取得了較大進(jìn)展，已從多種生物 (人、雞、馬和玉米等) 機(jī)體中分離獲得防御素基因[13-16]，其在基因工程研究領(lǐng)域中的應(yīng)用正在不斷擴(kuò)大。水產(chǎn)生物的棲息環(huán)境復(fù)雜，近年來(lái)出現(xiàn)的嚴(yán)重水域污染使它們比其他生物更易遭受病原微生物的侵染[17]。換言之，水產(chǎn)生物的機(jī)體必須擁有比其他生物更強(qiáng)的免疫系統(tǒng)才能適應(yīng)這種復(fù)雜的生存環(huán)境，尤其是貝類等軟體動(dòng)物在缺乏具有“記憶效應(yīng)”的特異性免疫機(jī)制的情況下，仍然能抵御各種病原微生物的侵染，而防御素則是其先天性免疫系統(tǒng)中的重要免疫因子[18]。Zhao等[19]從海灣扇貝Argopecten irradians中提取大防御素AiBD基因，構(gòu)建了重組表達(dá)載體，通過(guò)在畢赤酵母中的表達(dá)獲得重組AiBD，抑菌試驗(yàn)顯示該重組蛋白對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌具有抑制作用；之后，他們又將從菲律賓蛤仔Venerupis philippinarum中克隆到的大防御素VpBD基因通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得重組VpBD，其對(duì)金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和惡臭假單孢菌Pseudomonasputida具有抑菌活性[20]。據(jù) Guenguen等[21]報(bào)道，他們從太平洋牡蠣Crassostrea gigas外套膜中也發(fā)現(xiàn)了一種新型防御素基因，將其命名為Cg-def，通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組Cg-def對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有較好的抑菌活性，但對(duì)革蘭氏陰性菌無(wú)明顯作用。眾所周知，原核表達(dá)系統(tǒng)存在一定的缺陷，比如不能對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行翻譯后加工修飾，以致表達(dá)的目的蛋白會(huì)形成不溶性的包涵體，需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象和活性。而與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris作為真核表達(dá)的宿主，其有助于表達(dá)產(chǎn)物空間構(gòu)象的形成，進(jìn)而獲得具有生物學(xué)活性的重組蛋白，并可實(shí)現(xiàn)目的蛋白的細(xì)胞外分泌表達(dá)以方便表達(dá)產(chǎn)物的后續(xù)處理，是目前公認(rèn)的外源蛋白表達(dá)的良好宿主[22]。最近，我們報(bào)道了基于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的斑馬魚(yú)Danio rerio重組β-防御素 (zfDB3)，它對(duì)大腸桿菌Escherchia coli、銅綠假單孢菌Pseudomonas aeruginosa和單增李斯特菌Listeria monocytogenes等顯示了良好的抑菌活性[23]。本研究以上述太平洋牡蠣防御素基因作為重組表達(dá)的目標(biāo)，擬通過(guò)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得具有生物學(xué)活性的重組蛋白，以期為開(kāi)發(fā)能夠替代或部分替代抗生素的天然抗菌劑提供良好的候選者和技術(shù)途徑。

為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，首先通過(guò)RT-PCR從太平洋牡蠣外套膜中分離編碼防御素的cDNA片段；通過(guò)設(shè)計(jì)添加和不添加6×His標(biāo)簽的兩種目的基因，以pPICZαA為表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體；在畢赤酵母X-33中使用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，并通過(guò)固化金屬離子親和層析 (IMAC) 和MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化和結(jié)構(gòu)鑒定，最終檢測(cè)太平洋牡蠣重組防御素的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株和載體

鮮活的太平洋牡蠣購(gòu)自上海市蘆潮港海鮮市場(chǎng)；畢赤酵母X-33和表達(dá)載體pPICZαA購(gòu)自Invitrogen公司 (美國(guó))；克隆載體pMD19-T購(gòu)自TaKaRa公司 (日本)；大腸桿菌 DH5α購(gòu)自天根生物科技有限公司 (北京)；金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備

RNAiso plus、限制性內(nèi)切酶(SacⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ)、T4 DNA連接酶和TaqDNA聚合酶均購(gòu)自TaKaRa公司；3′-RACE試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；DNA分子量marker、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和酵母基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自天根生物科技有限公司；超低蛋白質(zhì)分子量marker購(gòu)自中科瑞泰生物科技有限公司 (北京)；Western blotting試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司 (北京)；PCR儀、聚丙烯酰氨凝膠電泳儀、電轉(zhuǎn)儀和IMAC柱均來(lái)自BIO-RAD公司(美國(guó))。引物合成、DNA測(cè)序由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成；MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及第一鏈cDNA合成

鮮活太平洋牡蠣運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，取其外套膜，采用RNAiso Plus試劑提取總RNA；通過(guò)3′-RACE法合成第一鏈cDNA：總RNA 2 μL、通用引物(5 μmol/L) 1 μL、5×PrimeScript緩沖液2 μL、dNTPs (10 mmol/L) 1 μL、RNase抑制劑 (40 U/μL)0.25 μL、PrimeScript RTase (200 U/μL) 0.25 μL，用RNase Free dH2O調(diào)至10 μL；42 ℃反應(yīng)60 min，然后70 ℃保溫15 min，獲得第一鏈cDNA保存于–20 ℃。

1.2.2 添加和不添加6×His標(biāo)簽的目的基因的cDNA克隆

以第一鏈cDNA為模板，參考多種軟體動(dòng)物防御素基因設(shè)計(jì)正向引物CgD-F和反向引物CgD-R (表1)，通過(guò)PCR擴(kuò)增編碼太平洋牡蠣防御素的cDNA片段，反應(yīng)體系和條件如下：10×Taq緩沖液2 μL、dNTPs (10 mmol/L) 1.6 μL、正向和反向引物 (10 μmol/L) 各0.8 μL、第一鏈cDNA 0.2 μL、TaqDNA聚合酶 (2.5 U/μL) 0.2 μL，無(wú)菌水調(diào)至20 μL；94 ℃ 3 min、94 ℃ 40 s、53.5 ℃30 s、72 ℃ 1 min、72 ℃ 10 min，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；該片段經(jīng)連接至pMD19-T simple載體后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后選擇陽(yáng)性克隆由生工生物工程 (上海) 股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。以此cDNA片段為模板、采用CgD-F1和CgD-R1以及CgD-F1和CgD-R2兩對(duì)引物 (表1)，通過(guò)兩次PCR擴(kuò)增5′端含XhoⅠ酶切位點(diǎn)和Kex 2信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，3′端含6×His標(biāo)簽、終止密碼子和XbaⅠ酶切位點(diǎn)的目的基因CgDH+；另一方面，以CgD-F1和CgD-R3為引物 (表1)，通過(guò)PCR擴(kuò)增5′端含XhoⅠ酶切位點(diǎn)和Kex 2信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)、3′端含終止密碼子和XbaⅠ酶切位點(diǎn)的目的基因CgDH-。擴(kuò)增該兩種目的基因的所有PCR反應(yīng)體系和條件基本同上，除了退火溫度有所改變(擴(kuò)增CgDH+的兩次PCR的退火溫度分別為56.8 ℃和56.5 ℃；擴(kuò)增CgDH-的退火溫度為54.2 ℃)。擴(kuò)增到的兩種目的基因同上處理后由生工生物工程 (上海) 股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序，通過(guò)ExPASy軟件(http://web.expasy.org /compute.pi/)預(yù)測(cè)它們編碼的蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33

采用XhoⅠ和XbaⅠ分別對(duì)pMD19-T-CgDH+和pMD19-T-CgDH-進(jìn)行雙酶切，獲得目的基因CgDH+和CgDH-后，在T4 DNA連接酶作用下，將其與經(jīng)同樣限制性酶處理過(guò)的pPICZαA按1∶1(V/V) 連接 (16 ℃，1 h) 以構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-；兩者被轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)菌落PCR對(duì)其進(jìn)行鑒定并測(cè)序。經(jīng)確證的pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-用限制性內(nèi)切酶SacⅠ處理后，分別與畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞以1∶8 (V/V)混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中冰浴5 min，2 000 V、25 μF和200 Ω條件下電擊5 ms；立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇。另外，將pPICZαA(空載體) 電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X-33，以此作為陰性對(duì)照。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.4 高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的篩選

將上述電轉(zhuǎn)后的溶液置于30 ℃恒溫箱中保溫2 h，離心后將菌體涂于含100 μg/mL博來(lái)霉素的YPD平板(酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L)上，于29 ℃孵育至單克隆產(chǎn)生；選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落分別接種至含高濃度博來(lái)霉素(1000 μg/mL)的YPD及MM(YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg /L、甲醇5 mL/L、瓊脂15 g/L)和MD(YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 g/L)平板上，29 ℃培養(yǎng)8 h。對(duì)篩選獲得的甲醇利用快速型高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA，并以此為模板，采用pPICZαA上的通用引物5?AOX1和3?AOX1 (表1)進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.5 目的蛋白在畢赤酵母X-33中的表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化

將上述經(jīng)PCR鑒定獲得的兩株酵母轉(zhuǎn)化子(含pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-)分別接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，29 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h后，取500 μL轉(zhuǎn)接至50 mL MGY培養(yǎng)基 (酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、YNB 13.4 g/L、生物素0.4 mg /L、甘油 10 mL/L、磷酸鉀緩沖液100 mmol/L，pH 6.0) 中，相同條件下培養(yǎng)24 h；全部轉(zhuǎn)入MM培養(yǎng)基 (配方同MGY培養(yǎng)基，除了10 mL/L的甲醇取代甘油) 中，29 ℃、250 r/min培養(yǎng)72 h，每隔24 h補(bǔ)加甲醇至1.0%。培養(yǎng)液經(jīng)超濾濃縮后，通過(guò)Tricine-SDS-PAGE對(duì)其進(jìn)行分析，電泳條件：0.1 mol/L N-三(羥甲基) 甲基甘氨酸，濃縮膠、夾層膠和分離膠的濃度分別為4%、10%和16.5%。同時(shí)，將MM培養(yǎng)基中的甲醇濃度設(shè)為0%、0.5%、1%、1.5%和2%，選取含pPICZαA-CgDH-的酵母轉(zhuǎn)化子同上條件進(jìn)行培養(yǎng)，以確定最適甲醇濃度；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)同一酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行不同時(shí)間段的培養(yǎng)，以確定最佳表達(dá)時(shí)間。

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物的純化及Western blotting分析和結(jié)構(gòu)鑒定

將上述篩選到的含pPICZαA-CgDH+的酵母轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)至1 L，在最適條件下進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)液經(jīng)離心后收集上清，經(jīng)賽多利斯切向回流超濾器濃縮后，通過(guò)Profina蛋白質(zhì)純化儀進(jìn)行固化金屬離子親和層析 (IMAC)；純化產(chǎn)物經(jīng)Tricine-SDSPAGE分析后，切下目的條帶由上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行MALDI-TOF- TOF質(zhì)譜分析。采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。此外，將電泳后的凝膠電轉(zhuǎn)至PVDF膜上 (100 V，1 h)，采用Western blotting試劑盒進(jìn)行分析，具體操作如下：加封閉液反應(yīng)1 h后洗膜，加入鼠單克隆抗體 (一抗) 室溫孵育2 h；洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (二抗) 室溫孵育1 h；洗膜后用HRP-DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色。

1.2.7 重組蛋白的抑菌活性測(cè)定

以金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌為試驗(yàn)菌，將兩者分別接種于5 mL Luria-Bertani (LB)液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；菌液經(jīng)10倍稀釋后取1 μL分別與100 μL的含重組蛋白CgDH+和含重組蛋白CgDH-的培養(yǎng)液上清 (蛋白質(zhì)總濃度分別為2.4 mg/mL和2.69 mg/mL) 混合，37 ℃保溫2 h，取30 μL涂于LB平板，再37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。另外，以含pPICZαA (空載體) 的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因CgDH+和CgDH–的PCR擴(kuò)增及其序列分析

以太平洋牡蠣外套膜的第一鏈cDNA為模板，使用引物CgD-F和CgD-R，擴(kuò)增到146 bp的編碼防御素的cDNA片段。以此cDNA片段為模板，一方面通過(guò)使用兩對(duì)引物CgD-F1和CgD-R1以及CgD-F1和CgD-R2，擴(kuò)增得到含6×His標(biāo)簽的171 bp的目的基因CgDH+；另一方面，通過(guò)使用CgD-F1和CgD-R3引物，擴(kuò)增得到不含6×His標(biāo)簽的目的基因CgDH-。DNA測(cè)序結(jié)果顯示相關(guān)酶切位點(diǎn)和6×His標(biāo)簽被正確添加(圖1)；CgDH+和CgDH-分別編碼了由49個(gè)和43個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，內(nèi)含8個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，它們?cè)诳臻g上可以形成4對(duì)二硫鍵，以穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并賦予其生物學(xué)活性。經(jīng)ExPASy軟件預(yù)測(cè)，兩種目的蛋白CgDH+和CgDH-的理論分子量分別為5.78 kDa和4.95 kDa，等電點(diǎn)分別為7.77和7.70。

圖1 目的基因CgDH+和CgDH–的核苷酸及推斷的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of target genes, CgDH+ and CgDH-.Underlines represent restriction sites; italics represent Kex 2 protease recognition site; shaded letters represent conserved cysteine residues;box represents 6×His; asterisks represent stop codons.

2.2 重組表達(dá)載體和高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子的鑒定

使用載體上的通用引物5?AOX1和3?AOX1對(duì)pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-進(jìn)行大腸桿菌菌落PCR鑒定，獲得4個(gè)含pPICZαA-CgDH+的陽(yáng)性菌落和3個(gè)含pPICZαA-CgDH-的陽(yáng)性菌落；各選1株菌用于DNA測(cè)序，結(jié)果顯示兩個(gè)目的基因分別與表達(dá)載體pPICZαA正確連接，未發(fā)現(xiàn)任何核苷酸突變。將純化的pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-分別電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33后，經(jīng)含高濃度博來(lái)霉素的MM和MD平板篩選，各取3株長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株提取其基因組DNA為模板，使用5?AOX1和3?AOX1進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果證明pPICZαA-CgDH+和pPICZαA-CgDH-已成功嵌合進(jìn)畢赤酵母X-33基因組。

2.3 在畢赤酵母X-33中表達(dá)目的蛋白及其表達(dá)條件的優(yōu)化

從上述兩種酵母轉(zhuǎn)化子中各選1株用于目的蛋白的表達(dá)，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析表明 (圖2A)，含pPICZαA-CgDH–和pPICZαA-CgDH+的兩種酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清均在近7.8 kDa處有明顯蛋白質(zhì)條帶，前者位置略低于后者 (兩者理論上相差0.83 kDa)，而含空載體的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清則無(wú)此條帶。鑒于后者培養(yǎng)液上清中的目的蛋白含6×His標(biāo)簽，在對(duì)其擴(kuò)大至1 L培養(yǎng)后，通過(guò)IMAC法獲得純化產(chǎn)物，電泳結(jié)果顯示該純化產(chǎn)物為分子量近7.8 kDa的單一條帶，證明其純度較高，該條帶用于Western blotting和MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定。經(jīng)BCA法測(cè)得純化的重組蛋白濃度為0.58 mg/mL，推算至表達(dá)量為2.32 mg/L。

圖2 純化的CgDH+(A) 以及不同甲醇濃度 (B) 和不同表達(dá)時(shí)間 (C) 下的培養(yǎng)液上清的Tricine-SDS-PAGE分析Fig.2 Tricine-SDS-PAGE analysis for the purified CgDH+ (A) and culture medium supernatants from yeast transformants induced with different concentrations of methanol (B) and expressed for different time (C).M: protein marker; CK: yeast transformant harboring pPICZαA; 1: yeast transformant harboring “pPICZαA-CgDH-”; 2: yeast transformant harboring “pPICZαA-CgDH+”; 3: purified CgDH+.

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察不同甲醇濃度對(duì)含pPICZαA-CgDH-的酵母轉(zhuǎn)化子表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖2B所示。1.0%甲醇濃度下的表達(dá)產(chǎn)物中雜蛋白較少，并且目的蛋白的條帶最清晰，故在分時(shí)段表達(dá)時(shí)采用1.0%的甲醇濃度。同樣以該酵母轉(zhuǎn)化子為例，考察不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)表達(dá)量的影響，由圖2C可見(jiàn)，培養(yǎng)24-120 h時(shí)都有目的蛋白表達(dá)，在48 h時(shí)表達(dá)量已較高，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量并無(wú)明顯增加。據(jù)此，一方面考慮到雜蛋白的影響和降低成本，另一方面據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[21]，防御素對(duì)真菌有一定的抑制作用，隨著防御素含量的增加，酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)可能會(huì)受到影響，并且目的蛋白可能會(huì)被蛋白酶降解。因此，選擇最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間為48-72 h。

2.4 重組蛋白CgDH+的Western blotting分析及MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定

含重組蛋白CgDH+的培養(yǎng)液上清和純化產(chǎn)物經(jīng)Western blotting分析后顯示 (圖3A、3B)，在10 kDa附近都存在單一明顯條帶，此位置的分子量明顯高于理論分子量5.78 kDa，究其原因可能是因?yàn)槌头肿恿康鞍踪|(zhì)marker與顯色染料共價(jià)偶聯(lián)，在電泳時(shí)影響了其遷移速度，以致顯示目的蛋白的分子量比理論分子量高。純化產(chǎn)物的MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析顯示 (圖4)，在m/z799.0-4 013.0之間捕捉到7個(gè)肽段，其覆蓋的殘基數(shù)約占重組蛋白CgDH+氨基酸序列總長(zhǎng)的83.67%；其中m/z為841.3713和1217.540 9的兩個(gè)峰分別代表自N端起44-49殘基 (HHHHHH)和22-31殘基 (AGYCDFWTVR) 的肽段，該兩段序列分別與相應(yīng)位置的理論序列相符，由此證明，純化產(chǎn)物即為預(yù)期的重組蛋白CgDH+。

圖3 含pPICZαA-CgDH+的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清 (A) 和純化CgDH+(B) 的Western blotting分析Fig.3 Western blotting analysis for the culture medium supernatant from yeast transformant harboring pPICZαA-CgDH+(A) and purified CgDH+ (B).M: protein marker; CK: yeast transformant harboring pPICZαA; 1:yeast transformant harboring “pPICZαA-CgDH+”; 2:purified CgDH+.

圖4 純化的CgDH+的MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析Fig.4 MALDI-TOF-TOF analysis for the purified CgDH+.

2.5 重組蛋白CgDH+和重組蛋白CgDH–的抑菌活性

由圖5所示，與陰性對(duì)照 (兩種試驗(yàn)菌與含空載體的酵母轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)液上清作用) 相比，革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性的銅綠假單孢菌經(jīng)與含重組蛋白CgDH+和重組蛋白CgDH-的培養(yǎng)液上清作用，平板上的菌落數(shù)明顯減少，表明這兩種培養(yǎng)液上清顯示的抑菌活性分別來(lái)源于重組蛋白CgDH+和重組蛋白CgDH-。另一方面，該結(jié)果也初步證明重組蛋白中6×His標(biāo)簽的存在與否并不影響其生物學(xué)活性。

3 討論

軟體動(dòng)物進(jìn)化地位較低，而它們?cè)谏锝缰邪l(fā)展和進(jìn)化的歷史卻比脊椎動(dòng)物長(zhǎng)得多；它們雖然缺乏特異性的免疫系統(tǒng)，但從物種生存以及繁衍的角度看，其機(jī)體的防御體系并不遜色于脊椎動(dòng)物，而防御素則是它們機(jī)體細(xì)胞中關(guān)鍵的免疫因子[18,24]。由此可以推測(cè)，較脊椎動(dòng)物而言，來(lái)自軟體動(dòng)物的防御素具有更為天然的優(yōu)勢(shì)成為天然抗菌劑開(kāi)發(fā)的良好候選者。本研究聚焦于太平洋牡蠣防御素的重組表達(dá)，經(jīng)優(yōu)化表達(dá)條件，建立了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)；通過(guò)該系統(tǒng)獲得了含6×His和不含6×His的兩種重組太平洋牡蠣防御素。根據(jù)ExPASy軟件預(yù)測(cè)，這兩種重組蛋白的理論分子量分別為5.78 kDa和4.95 kDa，但Tricine-SDS-PAGE分析顯示目的條帶的分子量偏高 (圖2)，其原因可能是因?yàn)槟康牡鞍椎姆肿恿窟^(guò)小且?guī)д姾?，SDS不能完全屏蔽蛋白質(zhì)分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異，導(dǎo)致其電泳時(shí)的位置偏高[25]?；贛ALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析的結(jié)構(gòu)鑒定進(jìn)一步證明了上述目的條帶為預(yù)期的目的蛋白。另一方面，通過(guò)本研究建立的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，獲得了表達(dá)量?jī)H為2.32 mg/L的重組蛋白CgDH+，這種低表達(dá)量的現(xiàn)象可能與本研究使用的編碼太平洋牡蠣防御素的天然cDNA有關(guān)；根據(jù)Graphical Codon Usage Analyser (http://www.gcua.schoedl.de/)預(yù)測(cè)，該cDNA中存在17個(gè)低頻密碼子，它們可能影響了目的蛋白在畢赤酵母中的高效表達(dá)。Yang等[26]對(duì)黑曲霉Aspergillus nigerlip2基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化后在畢赤酵母細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量和生物學(xué)活性分別提高了11.6和5.3倍；王方芹等[27]根據(jù)釀酒酵母的密碼子偏愛(ài)性優(yōu)化了黑曲霉的α-L-鼠李糖苷酶基因rha，發(fā)現(xiàn)重組rha的表達(dá)量提高了2.9倍，并且其酶活力也提高了2.7倍。此外，我們最近報(bào)道的在畢赤酵母X-33中表達(dá)的斑馬魚(yú)重組β-防御素 (zfDB3) 與本研究獲得的兩種重組目的蛋白相比，顯示了更好的抑菌活性[23]，而zfDB3的編碼基因中有28個(gè)密碼子是被優(yōu)化過(guò)的。據(jù)此，后續(xù)研究將根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛(ài)性進(jìn)一步對(duì)目的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以期提高表達(dá)量。

圖5 含重組目的蛋白的培養(yǎng)液上清的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of the culture medium supernatants containing recombinant target proteins.CK: yeast transformants harboring pPICZαA; 1: yeast transformants harboring “pPICZαA-CgDH-”; 2: yeast transformants harboring “pPICZαA-CgDH+”.

眾所周知，對(duì)重組蛋白添加6×His標(biāo)簽將有利于其純化及其結(jié)構(gòu)鑒定，但是否會(huì)影響重組蛋白的生物學(xué)活性依據(jù)各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是不同的[28-30]。本研究設(shè)計(jì)了C端含6×His和不含6×His的重組蛋白CgDH+和CgDH-，抑菌試驗(yàn)顯示兩者對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌都具有抑菌活性 (圖5)，與馬君燕等[30]的研究結(jié)果一致。在過(guò)去的兩年中，我們?cè)_(kāi)展了斑點(diǎn)叉尾鮰 C型溶菌酶在畢赤酵母X-33中的表達(dá)研究，獲得了含6×His和不含6×His的3種重組溶菌酶，發(fā)現(xiàn)不含6×His和C端含6×His的重組溶菌酶均具有抑制枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的活性，而N端含6×His的重組溶菌酶則無(wú)抑菌活性[31]。產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因被推測(cè)為可能是N端的6×His在一定程度上改變了蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響了溶菌酶活性中心的形成；而C端存在的6×His并不影響重組溶菌酶和重組蛋白CgDH+的空間結(jié)構(gòu)。

考慮到對(duì)目的蛋白進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵時(shí)不可能對(duì)其進(jìn)行純化處理，故本研究分別考察了含重組蛋白CgDH+和重組蛋白CgDH-的培養(yǎng)液上清的抑菌活性，證明兩者均顯示了抑制革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性的銅綠假單孢菌的活性，該結(jié)果為今后進(jìn)一步通過(guò)發(fā)酵罐發(fā)酵制備產(chǎn)品及確定產(chǎn)品的形式提供了重要的依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究從太平洋牡蠣外套膜中分離獲得防御素基因，確定其在畢赤酵母X-33中的最適表達(dá)條件為：29 ℃、250 r/min、1.0%甲醇、培養(yǎng)72 h；表達(dá)的兩種目的蛋白(CgDH+和CgDH-)均顯示了對(duì)于金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢菌的抑菌活性。根據(jù)純化的重組蛋白CgDH+的蛋白質(zhì)濃度推算表達(dá)量為2.32 mg/L。本研究結(jié)果為軟體動(dòng)物防御素的基因工程制備奠定了重要的研究基礎(chǔ)。