李亞麗， 郭 靖， 宋 娟， 樸向民， 徐曉龍, 王英平*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學院 特產(chǎn)研究所， 吉林 長春 130122;2. 中國科學院 長春應用化學研究所 電分析國家重點實驗室， 吉林 長春 130022)

熒光碳點(carbon dots, CDs)是碳家族繼碳納米管(carbon nanotubes, CNTs)、石墨烯(graphene)和富勒烯(fullerenes)之后的又一新成員，是粒徑小于10 nm的近球形零維碳質(zhì)骨架和表面基團構(gòu)成的熒光納米晶體，主要由C、H、O、N等元素組成[1]。熒光CDs不僅具有激發(fā)光譜寬且連續(xù)、耐光漂白、無光閃爍性等優(yōu)越的熒光性能，而且具有生物相容性好、毒性低、價格低廉、制備簡單、易于功能化等諸多優(yōu)勢，被廣泛關(guān)注。CDs獨有的量子尺寸效應使其熒光發(fā)射光譜在可見光到近紅外光區(qū)范圍內(nèi)可調(diào)，是一種性能優(yōu)良的熒光標記與生物成像材料，因此有望取代有機染料、熒光染色蛋白及傳統(tǒng)半導體納米材料應用于生物標記和生物成像領(lǐng)域。但是，CDs作為熒光標記材料應用于生物成像的研究較傳統(tǒng)熒光標記材料而言尚處于起步階段，許多基本問題尚待解決。本文對CDs的合成、性質(zhì)及其在生物成像中的應用作一簡要綜述，并提出展望，期望為豐富熒光CDs在生物成像領(lǐng)域應用提供一定的借鑒和參考。

1 熒光碳量子點的合成

CDs最早是由Xu等[2]在2004年用電弧放電的方法處理煙灰制備碳納米管(carbon nanotubes, CNTs)時偶然發(fā)現(xiàn)的。2006年，Sun等[3]將粘土與石墨粉的混合物在氮氣保護下經(jīng)加熱和退火等處理得到C靶物，進行激光燒蝕及表面鈍化得到的熒光性質(zhì)優(yōu)越的碳納米粒子，首次命名為CDs。近年來，CDs的制備已得到極大地豐富和發(fā)展，逐漸朝著安全高效、操作簡單和綠色環(huán)保等方向發(fā)展，這些制備方法總體可分為兩大類：即自上而下(top-down)和自下而上(bottom-up)[4]，如圖1所示。

自上而下法系采用物理或化學的方法將宏觀尺度的碳結(jié)構(gòu)材料經(jīng)過裂解、切割、燒蝕等手段進行剝離變?yōu)榧{米級粒子，如：電化學法[5]、激光燒蝕法[3]、弧光放電法等[2]。自下而上法是采用有機碳分子作為原料，通過體系中的小分子碳前驅(qū)體間聚集發(fā)生諸如碳化、縮合等反應而相互結(jié)合形成CDs，包括水熱法[6]、化學氧化法[7]、微波法[8]、模板法[9，10]、熱解法[11,12]、反膠束法[13]等。當然，有些CDs的合成同時運用自上而下法和自下而上法。表1對CDs幾種常用的制備方法進行簡要介紹。

1.1 自上而下法

1.1.1電弧放電法

電弧放電法是采用實心石墨棒作陰極進行電弧放電時被高溫氣化，進而生成CDs的方法，是最早發(fā)現(xiàn)的合成CDs的方法[2]，此方法得到的CDs具有優(yōu)良的性質(zhì)，但是熒光量子產(chǎn)率(fluorescence quantum yields, QYs)極低。

1.1.2電化學法

電化學法亦稱電化學氧化法，是一種利用各種大體積的碳結(jié)構(gòu)材料(多壁碳納米管、石墨棒、碳糊電極碳等)為工作電極，借助電化學裝置應用循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry, CV)等將工作電極在電解質(zhì)中進行連續(xù)電壓掃描，通過調(diào)節(jié)電壓和電流密度精確地控制制備CDs的方法。2007年，Zhou等[5]以多壁碳納米管為原料，第一次利用電化學法制備得到CDs。電化學法制備CDs方法簡單、溫和、方便，用一個普通的電化學池就可以制備。然而，只有少數(shù)文獻介紹過電化學法將小分子碳轉(zhuǎn)化為CDs。

圖1 碳點的不同制備方法Schematic illustration of CDs preparation approaches

表1 不同碳點的合成方法比較

1.1.3激光燒蝕法

激光燒蝕法是利用高能激光束，在特定的氣氛下照射靶材表面迅速加熱融化蒸發(fā)而制備CDs的方法。Sun等[3]首次報道利用激光燒蝕法制備并命名為CDs。激光燒蝕法制備過程復雜且耗時，通常需要有機試劑進行鈍化以及昂貴的儀器設(shè)備，不適用于大規(guī)模制備。

1.2 自上而下法

1.2.1水熱法

水熱法或水熱碳化(hydrothermal carbonization, HTC)或者容積熱碳化法是指在特制的密閉反應器(高壓釜)中，采用水溶液作為反應介質(zhì)在高溫高壓條件下進行化學反應而合成CDs的方法。HTC合成CDs的典型路線是把碳源混合液放進聚四氟乙烯水熱釜中，在溫度180～240 ℃下反應數(shù)小時即可完成。HTC法制備CDs最早是由Zhang等[6]以乙醇為溶劑碳化抗壞血酸時發(fā)展的，所得CDs的平均粒徑為2 nm，能發(fā)射藍色的熒光，熒光信號穩(wěn)定且?guī)缀醪皇墉h(huán)境pH等因素的影響。HTC法合成過程不需要昂貴的試劑,也不需多步鈍化和精密儀器，反應前體可以是各種含碳材料，原料成本低、環(huán)境友好且無毒性。其反應設(shè)備簡單且反應過程密閉，可以有效防止反應物質(zhì)揮發(fā)，保護原材料，能有效避免合成過程對操作人員的傷害和環(huán)境的污染，是目前應用中最受追捧的CDs合成方法，最重要的是它還可以將制備與摻雜功能合二為一，將繁瑣的步驟簡單化。但是，一般水熱反應需要高溫高壓，亦需要注意實驗安全。

1.2.2微波法

微波法是利用微波輻射進行CDs合成的一種方法[11]。Li等[8]首次報道利用微波法處理葡萄糖和PEG-200的混合水溶液制備出性能優(yōu)越的CDs，該報道中PEG-200既是溶劑又是鈍化劑，一步操作可同時完成反應和修飾兩個過程，并且發(fā)現(xiàn)微波時長在一定程度上能夠影響所得CDs的尺寸。通過微波輻射法，以有機化合物合成CDs是一種經(jīng)濟高效的合成方法。微波能集中高效的能量并節(jié)約反應時間，具有耗時短、操作簡便和成本低等優(yōu)點，因而吸引了研究者的廣泛興趣。但是，用該法制得的CDs的粒徑不夠均一。

1.2.3模板法

模板法系先在合適的模板上合成CDs，然后用酸刻蝕等手段除去模板的CDs合成方法。Bourlinos等[9]初次利用模板法成功制備CDs，該實驗選用NaY沸石作為模板，與2,4-二氨基苯酚二鹽酸鹽進行離子交換，在高溫條件下沸石表面發(fā)生熱解氧化形成CDs，最后用氫氟酸除去沸石模板便得到分散的熒光CDs。隨后，Guo等[10]以含碳復合光子晶體為模板，在惰性氣體的保護下經(jīng)過高溫熱解制得CDs，實驗發(fā)現(xiàn)通過控制反應溫度可以調(diào)控CDs的熒光顏色。模板法可以合成粒徑足夠均一的CDs，分散性好且可較長時間放置。不足之處是適宜模板的合成/選擇以及去模板的方法有待改進。

1.2.4化學氧化法

化學氧化法是用強氧化性酸將有機小分子碳化，并通過氧化作用使其進一步被分解形成CDs的方法。Fang等[7]將冰醋酸和水按25∶2的比例混合均勻后，快速加入五氧化二磷，即制得交聯(lián)的、具有中空結(jié)構(gòu)的熒光CDs?；瘜W氧化法的碳源來源廣泛，可靈活選擇不同的碳源和氧化劑，從而制備出不同的CDs。但該法所得的CDs熒光量子產(chǎn)率較低。

1.2.5熱解法

熱解法是通過高溫分解有機碳源制備CDs[11]。Jia等[12]直接對抗壞血酸的水溶液加熱到90 ℃，合成了重量超過6.0 g的CDs，且具有很好的分散性。熱解法制備的CDs具有激發(fā)波長可調(diào)、pH可調(diào)和上轉(zhuǎn)換熒光性能等優(yōu)點。此外，CDs表面存在的羥基和羧基基團，使其具有較好的水溶性。

1.2.6反膠束法

反膠束法是通過表面活性劑作用，使含碳前驅(qū)體的水溶液與有機溶劑形成反膠束，加熱碳化、修飾后制得CDs的方法。Kwon等[13]用反膠束法，將葡萄糖水溶液加入癸烷中，在表面活性劑磺基琥珀酸二乙基己酯鈉(AOT)作用下形成油包水反膠束，之后加入鈍化劑十六烷基胺，在160 ℃氬氣氛圍中回流制得CDs。用反膠束法制備的CDs粒徑均勻，但該法反應條件比較苛刻，成本較高，目前無法廣泛應用。

1.3 合成CDs的原材料

CDs被發(fā)現(xiàn)的初期，其合成原料僅局限于單一元素組成，即尺寸較大的碳骨架材料，如碳粉[3]、石墨[8]、納米金剛石[14]、活性炭[15]、煤灰[16]、炭黑[17]、氧化石墨烯[18]、碳化纖維和碳納米管[19]等，用它們?yōu)樵虾铣沙龅腃Ds的QYs大多低于10%。

隨著CDT合成的深入研究，部分研究者嘗試直接用單一的小分子、生物大分子(聚合物)、天然物質(zhì)甚至廢棄物等作為原料合成CDs，如苯胺、苯酚、氨基酸、糖類、咪唑類有機物、殼聚糖以及聚乙烯亞胺等。2006年，有用含有端基氨的有機聚合物PEI-EI和PEG1500N來修飾CDs，使其QYs得到了極大提高，并且闡明其發(fā)光增強是由于端基氨的鈍化作用而有效地修復了CDs表面的缺陷，在CDs表面產(chǎn)生能量勢阱而導致CDs的發(fā)光增強。于是，氮元素便被引入CDs合成中用以提高期發(fā)光性質(zhì)。2012年，掀起了一股以自然界天然物質(zhì)為原料合成CDs的熱潮。近年來，大量的廉價原料被用于CDs制備。合成原料向著安全、綠色、環(huán)保的方向發(fā)展；制備方法朝著設(shè)備便捷，條件易操作可控，步驟少的方向發(fā)展。例如報道了用雞蛋膜[20]、蠶絲、草、豆?jié){、柚子皮、紅辣椒、草、橘子汁[21]、蘑菇[22]、棉花[23]、花瓣[24]、牛奶[25]、蜂蜜[26]、柚子皮[27]、甘蔗渣[28]甚至蝦殼[29]等作為原料合成CDs。這些研究工作主要將目標集中在碳源的篩選，而且QYs均有所提升。2013年，發(fā)展了用檸檬酸和L-半胱氨酸合成氮、硫共摻雜的CDs的方法，此方法在一定程度上了提高了量子效率，并解釋了氮硫摻雜提高量子產(chǎn)率的機理。至此，硫摻雜便成為一種提升CDs發(fā)光性質(zhì)的新手段。

除此之外，亦可以用含硼元素的化合物合成硼摻雜的CDs，豐富了制備CDs的原材料。元素摻雜避免了繁瑣的修飾過程，并且能得到具有很好熒光發(fā)射及特殊性能的CDs，在CDs摻雜的所有元素中，氮源易獲得，作用機理最清楚。因此，目前氮元素摻雜法得到了廣泛應用。

碳元素是自然界中存在的最重要的元素之一，由碳元素構(gòu)成的碳納米材料種類繁多，通過合成方法的探索和原料的篩選，以及對CDs進行表面修飾和摻雜等手段，使CDs的發(fā)光效率大幅度提升，目前己達到80%以上。Wang等[30]利用微波-水熱法處理氧化石墨烯制備了具有長熒光壽命的CDs。另一類非常經(jīng)典的路線是以檸檬酸作為碳源，短鏈的脂肪胺或芳香胺做為氮源，通過某種方法反應碳化后制得氮摻雜的CDs，該方法制得的CDs往往含氮量高，QYs較高，發(fā)射波長多位于藍色光區(qū)，某些由具有多共軛結(jié)構(gòu)的小分子為原料制得的CDs發(fā)射波長還可能發(fā)生紅移，產(chǎn)生綠色、黃綠色甚至紅色的熒光。

2 熒光CDs的性質(zhì)

2.1 粒徑及分子量小

由CDs的定義可知CDs的粒徑一般小于10 nm，因此賦予CDs優(yōu)良的邊緣效應及量子限域，進而使其具有獨特的光電性質(zhì)。此外，CDs的分子量通常只有幾千到幾萬之間，所以可以很容易進入到細胞內(nèi)部，因而在體外細胞成像、活體光學成像和生物成像檢測方面具有廣泛的應用前景。

2.2 紫外吸收特性

2.3 熒光發(fā)射特性(光致發(fā)光)

2.3.1熒光發(fā)射類型

依據(jù)發(fā)射波長是否隨激發(fā)波長的改變而改變，可將CDs分為激發(fā)依賴型(即發(fā)射波長和強度隨激發(fā)波長的改變而改變)和激發(fā)不依賴型(即發(fā)射波長不隨激發(fā)波長改變)兩種。如圖2a所示，發(fā)射波長會隨著激發(fā)波長的增加產(chǎn)生逐漸紅移的現(xiàn)象，發(fā)生這種變化的原因可能歸結(jié)于粒徑不均勻(量子效應)或碳點表面的發(fā)光位點的多樣性[34]，但也有研究者發(fā)現(xiàn)，有些CDs發(fā)射與激發(fā)波長無關(guān)，如圖2b所示[35]，這可能歸因于它們的均勻的粒徑或是其表面化學的差異。CDs的熒光特性同時可以通過修飾或者能量轉(zhuǎn)移進行調(diào)節(jié)。

圖2 (a) 激發(fā)依賴型熒光光譜[34]； (b) 激發(fā)不依賴型熒光光譜[35](a) PL emission of excitation-dependent[34]; (b) PL emission of excitation-independent[35]

2.3.2與傳統(tǒng)熒光探針相比

與傳統(tǒng)熒光探針試劑相比，CDs具有寬且連續(xù)的激發(fā)波長范圍，其發(fā)射波長能夠涵蓋可見光區(qū)甚至延伸到近紅外光區(qū)，部分CDs還具有“一元激發(fā)多元發(fā)射”的特點。目前發(fā)展的CDs的發(fā)光機理主要包括：表面態(tài)和邊緣態(tài)、碳核態(tài)和分子態(tài)、本征態(tài)和缺陷態(tài)、sp2局域化的電子空穴對、激子輻射復合和雜原子到碳的電荷轉(zhuǎn)移等。

2.3.3鈍化修飾和摻雜提高QYs

QYs是評價熒光性能的一個重要的參數(shù)。與傳統(tǒng)的量子點相比，碳點的QYs相對較低，限制了其作為熒光探針在生物成像等領(lǐng)域的應用。由于CDs表面存在發(fā)射缺陷，裸露QYs的量子產(chǎn)率往往偏低(<10%)。通過對合成步驟的不斷改進以及對CDs表面進行鈍化修飾等方法，CDs的QYs得到了大幅度的提高。由于單個CDs之間的熒光性質(zhì)存在較大的差異，同時，CDs的熒光性能還受粒徑大小、摻雜元素、表面氧化程度等多種因素的影響。因此，現(xiàn)階段熒光CDs的可控合成仍存在一定難度，熒光CDs的發(fā)光機理也正被深入研究。

元素摻雜是調(diào)節(jié)CDs內(nèi)在結(jié)構(gòu)性能、優(yōu)化CDs性質(zhì)的重要手段。這是因為異原子的引入能改變CDs的電子分布，這與最高已占軌道HOMO和最低未占軌道LUMO能隙相關(guān)，從而影響其光學性質(zhì)。通過調(diào)整摻雜原子的種類和數(shù)量可以提高CDs的QYs，改變其熒光發(fā)射峰位。因此，近10年來，研究人員用各摻雜試劑或多元素共摻雜制備具有良好光學性能的CDs。目前，已經(jīng)發(fā)展了CDs的多種摻雜方法，總體分為非金屬元素摻雜、金屬元素摻雜和非金屬-金屬共摻雜3大類。非金屬元素摻雜碳點一般指的是B、P、Cl、N[36]、S[37]和Si[38]等元素摻雜的CDs，這些元素的電負性均與碳不同，無論是摻入電負性比碳高還是電負性比碳低的異原子，都會引起CDs電子重新分布。N是摻雜CDs中研究最早也是研究最多的元素，最早提出N摻雜概念的文獻是以草水熱合成制備的N摻雜富碳熒光納米點的研究，經(jīng)過N摻雜后QYs顯著提高。金屬元素的摻雜不僅改變CDs的電子分布，還能賦予CDs一些新的功能，迄今發(fā)展了包括Cu[39]、Mg、Fe、Ge、Gd[40]等摻雜的CDs。Wu等[41]金屬摻雜的CDs，以Na2[Cu(EDTA)]為前體一步熱解法合成N-Cu共摻雜CDs，所合成的共摻雜CDs可有效提升CDs的電子傳輸和光氧化反應。摻雜型量子點除具有本征量子點所具備的極佳的光學性能外，還可以對其性能進行有效的控制和強化，如Stokes位移更大，能夠避免因自吸收而導致的猝滅現(xiàn)象發(fā)生等。

2.3.4熒光穩(wěn)定性高、抗光漂白性強

CDs通常具有熒光穩(wěn)定性高、抗光漂白性強、無閃爍現(xiàn)象等優(yōu)勢，如采用激光燒蝕法制備的CDs在被激發(fā)光照射4 h后，熒光強度幾乎不變，而有機染料在被照射幾分鐘后就已經(jīng)被光漂白。CDs的這些優(yōu)勢極大地拓展了其在生物標記和生物成像等領(lǐng)域的應用。

2.4 CDs的電化學發(fā)光(electrochemi-luminescence, ECL)性質(zhì)

隨著研究的不斷深入，CDs已被證明具有優(yōu)異的ECL性質(zhì)。Zhu等[8]報道利用微波法制備出的CDs具有良好ECL性能，可被用于ECL傳感器。

2.5 CDs的上轉(zhuǎn)換熒光性質(zhì)

CDs另一個重要的性質(zhì)就是上轉(zhuǎn)換熒光性質(zhì)。上轉(zhuǎn)換發(fā)光是指在長波長激發(fā)光的激發(fā)下體系發(fā)出短波長光子的現(xiàn)象，即輻射光子能量大于所吸收的光子能量，這屬于反Stokes現(xiàn)象。下轉(zhuǎn)換發(fā)光或Stokes現(xiàn)象，是指傳統(tǒng)的光致發(fā)光現(xiàn)象，在短波長激發(fā)源的激發(fā)下，體系發(fā)射出較長波長光子的現(xiàn)象，所有的發(fā)光材料均遵從Stokes定律。

2.6 生物相容性和低生物毒性

碳元素是構(gòu)成生物體所需的重要元素之一，具有化學惰性、良好的環(huán)境友好性和生物相容性。此外，制備CDs的反應條件溫和、步驟簡單、原料豐富且廉價。因此，CDs有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光量子點用于生物標記和生物成像。

為了考察CDs的生物毒性，很多課題組將其與癌細胞，如Hela、Hep-2等孵育。實驗結(jié)果表明，在較高的CDs濃度、較長的孵育時間下，細胞仍具有較高的存活率(大于80%)。Ray等[42]通過MTT實驗研究了碳點對肝癌細胞存活率的影響，證明一定劑量的CDs對細胞活性幾乎沒有影響。Yang等[43]考察CDs對小鼠的毒性，結(jié)果證明CDs對小鼠身體器官幾乎不產(chǎn)生影響。

3 生物成像研究進展

生物成像包含細胞成像和活體成像兩個方面，CDs在這兩方面均已被成功應用[44]。2007年，Cao等[45]初次嘗試用CDs標記乳腺癌細胞(MCF-7)，然后用雙光子熒光顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)表現(xiàn)出明亮的熒光，說明CDs能夠成功進入細胞。Chen等[46]用2-疊氮咪唑為原料，在低溫條件下合成了多色熒光CDs，在不同的激發(fā)波長下可發(fā)射藍色、藍綠色和青綠色的熒光，該CDs的氮含量達到34.48%，并且具有生物相容性好等優(yōu)點，被成功應用于多色細胞成像。Wen等[47]以豬皮為原料制備了量子產(chǎn)率為24.1%的多色熒光CDs，并成功用于鈷離子檢測和多色細胞成像。Rong等[48]將制備的N,S-CDs與乳腺癌細胞共同培養(yǎng)，成功觀察到碳點內(nèi)吞進入細胞。安佰超課題組[49]合成了熒光CDs并將其應用于標記芥子堿硫氰酸鹽，有助于揭示芥子堿硫氰酸鹽的分子作用機制。劉武等[50]合成了一種具有室溫磷光的碳量子點基復合材料，期望在磷光防偽上能有很好的應用。李迎運等[51]制備了最大發(fā)射峰位于近紅外區(qū)域的CDs探針，對生物組織具有較小的光損傷和更深的穿透性；同時，其細胞毒性較低，適用于細胞成像。

在活體成像方面，Michalet等[52]將碳量子點注入小鼠體內(nèi)，在不同波長激發(fā)光下均可進行活體成像(圖3)。到目前為止，在活體成像方面的工作尚未全面展開，主要原因在于CDs引入活體細胞機制、結(jié)合部位及其與活體細胞間的相互作用規(guī)律等問題尚不明確；再者，現(xiàn)階段，CDs用于生物在體成像的研究成果還很少，遲遲得不到突破的關(guān)鍵在于CDs的量子產(chǎn)率偏低、生物體內(nèi)源性背景噪音大等問題。然而，總體來看，CDs通常具有較好的水溶性、較低的細胞毒性、優(yōu)異的生物相容性，以及可調(diào)的發(fā)光性質(zhì)，這些優(yōu)異的特質(zhì)表明CDs在細胞成像領(lǐng)域具有巨大應用前景。

圖3 (a)不同激發(fā)波長下CDs的小鼠體內(nèi)成像圖和(b)不同pH條件下CDs傳感器傳感HeLa細胞的熒光成像圖[52](a) In vivo fluorescence images at various excitation wavelengths of a CDs-injected mice, and (b) fluorescent images of HeLa cells clamped at pH 6.0, 6.5, 6.8, 7.2, 7.5, and 8.0, respectively[52]

4 展望

目前，隨著對CDs研究的不斷深入，CDs的制備方法、修飾手段和機理研究等得到了極大的發(fā)展。CDs的制備方法完成了由復雜到簡單，并向綠色安全方向轉(zhuǎn)變，QYs亦得到大幅度提升，但是仍有以下問題亟待解決：(1)大多數(shù)方法制備的CDs，其發(fā)射波長通常在與生物體自身背景熒光十分相近的藍光區(qū)，并且顏色呈現(xiàn)為藍色或綠色，不利于其在細胞成像中的應用。發(fā)射波長在近紅外的碳點也有相關(guān)報道，但QYs卻非常低，這使得CDs在生物成像分析中的應用受到了很大的限制；(2)CDs粒徑極小，經(jīng)過化學修飾后對其分離十分困難，因此難于將CDs進行功能化，這對CDs在某些領(lǐng)域的應用造成一定的阻礙；(3)CDs存在熒光顏色難以靈活調(diào)控、發(fā)光機理尚不明確等問題；(4)CDs在植物病害病理方面的研究和探索為生命科學注入了新思想，已成為當下研究的熱點，但現(xiàn)階段的認識只是冰山一角，亟待投入更多的研究，且大有可為?？蒲泄ぷ髡邆?nèi)砸?jīng)過不斷的探索和不懈的努力才能全面了解CDs。此外，CDs生物成像研究對藥用植物病害病理研究的進步具有重大意義，將是未來藥用植物病害研究的重點領(lǐng)域。