鄭沁薇,郝微微,王凱強(qiáng),吳清遠(yuǎn),王孟然,苑致維,溫紅珠

鄭沁薇,郝微微,王凱強(qiáng),王孟然,苑致維,上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市 200437

郝微微,吳清遠(yuǎn),溫紅珠,上海市中醫(yī)藥研究院脾胃病研究所 上海市200032

核心提要： NLRP3炎癥小體的作用有呈雙向性的傾向,這可能與急性期與慢性期NLRP3炎癥小體表現(xiàn)出不同的功能以及NLRP3炎癥小體同時(shí)調(diào)控T細(xì)胞免疫、固有免疫及腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用機(jī)制相關(guān).

0 引言

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)屬于慢性特發(fā)性疾病,其范疇包括潰瘍性結(jié)腸炎與克羅恩病,其發(fā)病與自身免疫內(nèi)環(huán)境改變密切相關(guān)[1].人體大多數(shù)免疫細(xì)胞位于腸道,在那里它們通過一層黏液上皮細(xì)胞與超過10萬億的微生物在空間上分離,而這層物理屏障的破壞,導(dǎo)致病原體入侵,以及機(jī)體對(duì)微生物、食物或自身抗原的無限制免疫應(yīng)答,導(dǎo)致了IBD的發(fā)生[2].先天免疫系統(tǒng)對(duì)微生物的識(shí)別依賴于稱為模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR).如今已發(fā)現(xiàn)至少四個(gè)家族的模式識(shí)別受體,其中一類位于細(xì)胞膜,如Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)和C型凝集素受體(C-type lectin receptor,CLR);另一類位于細(xì)胞漿,如核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD),即NOD樣受體(NOD-like receptor,NLR)和視黃酸誘導(dǎo)基因樣受體(retinoic acid-induced gene-like receptor,RLR)[3],在先天性免疫防御系統(tǒng)中主要識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs)和損傷相關(guān)分子模型(DAMPs)[4].而NLRs活化后可形成炎癥小體.炎癥小體被認(rèn)為介導(dǎo)宿主防御微生物病原體和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài),與炎癥性疾病的發(fā)病密切相關(guān)[5],而其中NLRP3炎癥小體是目前為止研究最為深入的炎癥小體.通過對(duì)NLRP3炎癥小體在機(jī)體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的研究,可以IBD的發(fā)病機(jī)制提供更多研究思路,并為今后IBD的可能的治療靶點(diǎn)的研究提供更多理論依據(jù).

1 NLRP3炎癥小體

NLRP3炎癥小體主要由NLRP3核心蛋白、ASC作為接頭蛋白以及Caspase-1作為效應(yīng)蛋白組成,而ASC由CARD架構(gòu)域以及PYD結(jié)構(gòu)域組成,主要連接上游的NLRP3以及下游的Caspase-1[6].而關(guān)于NLRP3炎癥小體的激活通路仍存在很多爭(zhēng)議,目前主要認(rèn)為有三種路徑：第一種是鉀離子外流,第二種是配體導(dǎo)致溶酶體破裂的物質(zhì),第三種是配體刺激產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),目前發(fā)現(xiàn)所有的NLRP3炎癥小體的配體都能誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧來激活NLRP3炎癥小體[7],觸發(fā)NLRP3炎癥小體復(fù)合物的形成,Caspase-1聚集導(dǎo)致自身活化,和Caspase-1相關(guān)促炎因子的成熟和分泌,如白介素IL-1β和IL-18,提高機(jī)體抵御內(nèi)源和外源刺激的能力,同時(shí)保護(hù)宿主[8].而同時(shí)炎性因子大量釋放,使細(xì)胞發(fā)生滲透性崩解,誘發(fā)依賴caspase-1的細(xì)胞焦亡(pyroptosis)[9].也有研究認(rèn)為NLRP3炎癥小體的激活需要2個(gè)信號(hào).第一信號(hào)由微生物分子如TLR配體或某些細(xì)胞因子提供,這些細(xì)胞因子通過NF-κB誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體.第二種信號(hào)直接觸發(fā)caspase-1激活,并且可以由多種刺激物介導(dǎo),包括細(xì)胞外ATP、顆粒物質(zhì)和某些細(xì)菌毒素.細(xì)胞外ATP通過ATP門控的P2X7受體(P2X7R)和細(xì)菌毒素以獨(dú)立于P2X7R的方式激活NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)有效的K+流出,該信號(hào)似乎是NLRP3炎癥小體激活所必需的[1].

2 NLRP3炎癥小體與固有免疫應(yīng)答

固有免疫系統(tǒng)不僅提供宿主抵抗微生物病原體入侵的第一道防線,而且激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)以持續(xù)保護(hù)其免受這種入侵[10].對(duì)于NLRP3炎癥小體在IBD中所產(chǎn)生的固有免疫反應(yīng)的復(fù)雜機(jī)制近年來也所報(bào)道.譬如嘌呤能受體P2X7相關(guān)的跨膜半通道Pannexin-1已經(jīng)被提出作用于NLRP3炎癥小體的上游,因?yàn)樗呀?jīng)證實(shí)介導(dǎo)微生物分子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),觸發(fā)NLRP3炎癥小體激活[11].有研究表明在固有免疫應(yīng)答過程中,嘌呤能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是NLRP3炎癥小體激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,這與腸和腸相關(guān)淋巴組織內(nèi)的位點(diǎn)特異性表達(dá)和調(diào)節(jié),炎癥微環(huán)境中P2X7受體的上調(diào),以及它誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)[12].

2.1 NLRP3炎癥小體與巨噬細(xì)胞 作為腸道的主要吞噬細(xì)胞,巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞與IBD的發(fā)病密切相關(guān)[13].有研究表明Gal-3的表達(dá)導(dǎo)致急性DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的發(fā)病,并通過促進(jìn)NLRP3炎癥小體的活化和巨噬細(xì)胞中IL-1β的產(chǎn)生,在結(jié)腸炎誘導(dǎo)期發(fā)揮重要的促炎作用[14].也有研究認(rèn)為,NLRP3炎癥小體在巨噬細(xì)胞中促炎癥因子的釋放作用以及對(duì)于細(xì)菌的消除作用是確定的,如大腸桿菌菌株在巨噬細(xì)胞內(nèi)具有毒性、侵襲性和存活性,在IBD中誘發(fā)難以控制的炎癥刺激.大腸桿菌菌株通過NLRP3炎癥小體介導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生,大腸桿菌對(duì)腸黏膜的侵襲性和IL-1β的產(chǎn)生可能與CD和UC的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[15].

2.2 NLRP3炎癥小體與樹突狀細(xì)胞 腸道樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)包括多方面的細(xì)胞群體,其具有抗原呈遞活性、效應(yīng)T細(xì)胞刺激和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)分化.腸道DCs通過淋巴管不斷遷移到腸系膜淋巴結(jié),從而引發(fā)免疫或耐受.如腸道DCs中,即使沒有明顯的刺激,CD103(-)CD11b(+)CX(3)CR1(int)淋巴DC誘導(dǎo)干擾素γ和IL-17產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞分化[16].腸道CD103(+)DC通過TGF-β和飲食代謝物維甲酸(RA)的作用機(jī)制促進(jìn)幼稚CD4(+)T細(xì)胞向Foxp3(+)Treg的分化[17].在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中,NLRP3炎癥小體抑制FLT3L介導(dǎo)的CD103+DC的分化,在T細(xì)胞轉(zhuǎn)移性結(jié)腸炎模型中,NLRP3炎癥小體缺乏導(dǎo)致IL－1β水平降低,Th17免疫功能下降,結(jié)腸炎的程度減輕[18].同時(shí),這種保護(hù)作用與穩(wěn)態(tài)條件下Nlrp3(-/-)小鼠中表達(dá)致耐受表型的CD103+固有層樹突狀細(xì)胞的增加有關(guān)[19].

2.3 NLRP3炎癥小體與miRNA 微小RNA(miRNAs)是非編碼的單鏈RNA,與信使RNAs(MRNAs)的3'非翻譯區(qū)相結(jié)合,在人類中已經(jīng)鑒定出超過2500個(gè)miRNAs,并且超過60%的人類基因被認(rèn)為是miRNA的靶點(diǎn)[20].巨噬細(xì)胞通過TLR配體刺激[例如LPS、CpG和Poly(I：C)]顯著地減少巨噬細(xì)胞中miR-223的表達(dá).下調(diào)的miR-223導(dǎo)致RhoB表達(dá)增加,誘導(dǎo)NF-κB和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活,促進(jìn)LPS刺激下TNF-α、IL-6和IL-1β的產(chǎn)生[21].有研究表明,miR-233通過抑制NLRP3炎癥小體的活性,降低小鼠患結(jié)腸炎的可能.在NLRP3炎癥小體中,近端誘導(dǎo)自裂解激活caspase-1,進(jìn)一步裂解IL-1β和IL-18的前體,產(chǎn)生生物活性的細(xì)胞因子.miR-233的表達(dá)上調(diào),并在Nlrp3 mRNA的調(diào)節(jié)部分與它的互補(bǔ)序列結(jié)合,這導(dǎo)致NLRP3炎癥小體表達(dá)的降低和IL-1β的減弱,從而減輕腸道炎癥反應(yīng)[22].

2.4 NLRP3炎癥小體與腸道黏膜屏障 NLRP3炎癥小體在識(shí)別腸道共生菌、維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)以及調(diào)節(jié)腸道炎性反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用,NLRP3炎癥小體的失調(diào)與UC和CD發(fā)病相關(guān)聯(lián)[23].腸道的固有免疫系統(tǒng)為機(jī)體對(duì)細(xì)菌抗原第一道防線,UC患者的固有免疫系統(tǒng)減弱,細(xì)菌抗原累積,繼發(fā)獲得性免疫系統(tǒng)瀑布式炎性反應(yīng).而NLRP3炎癥小體在免疫系統(tǒng)和腸道細(xì)菌之間發(fā)揮一定的作用[24],炎癥小體信號(hào)傳導(dǎo)的破壞將隨著病原體定殖的增加而導(dǎo)致腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失調(diào)[25].

實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)腸道病原體附著時(shí),NLRP3-/-和Asc-/-小鼠的細(xì)菌定殖增加,體重減輕更嚴(yán)重,腸道炎癥加重[26].缺乏NLRP3炎癥小體或ASC和caspase-1的小鼠對(duì)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎高度敏感,缺陷的NLRP3炎癥小體導(dǎo)致腸上皮喪失完整性,導(dǎo)致共生細(xì)菌的系統(tǒng)性分散,大量白細(xì)胞浸潤(rùn),并增加結(jié)腸中趨化因子的產(chǎn)生[27].研究發(fā)現(xiàn)NLRP3-R258W突變能夠通過分泌更多的IL-1β而非IL-18來促進(jìn)腸道局部上皮的抗菌肽的分泌,這主要是通過增加Treg細(xì)胞誘導(dǎo)的具有增強(qiáng)抗炎能力和重塑腸道微生物群的能力,增強(qiáng)小鼠腸道的內(nèi)穩(wěn)態(tài),抵御腸炎和腸癌的發(fā)病[28].而同時(shí),在腸上皮細(xì)胞損傷時(shí),腸道菌群刺激新招募的單核細(xì)胞誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體依賴性IL-1β釋放,從而促進(jìn)腸內(nèi)的炎癥.腸桿菌科,特別是致病性奇異變形桿菌,產(chǎn)生了與沙門氏菌相當(dāng)?shù)腎L-1β的釋放,奇異嗜血桿菌的定植通過NLRP3炎癥小體和IL-1受體信號(hào)產(chǎn)生溶血素促進(jìn)腸道炎癥反應(yīng)[29].

3 NLRP3炎癥小體與T細(xì)胞免疫應(yīng)答

NLRP3炎癥小體在誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫和炎癥反應(yīng)中也起到了關(guān)鍵作用[30].輔助性T細(xì)胞作為適應(yīng)性免疫的重要組成部分,已被分為Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,輔助性T細(xì)胞特異性譜系的分化主要由來源于抗原呈遞樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子信號(hào)驅(qū)動(dòng)[31].這些是由NLRP3炎癥小體激活引起的細(xì)胞因子.有研究表明,NLRP3炎癥小體是Th1適應(yīng)性免疫應(yīng)答的組成部分,NLRP3炎癥小體在CD4+T細(xì)胞中聚集,并啟動(dòng)caspase-1依賴的IL-1β的分泌,從而以自分泌方式促進(jìn)干擾素-γ的產(chǎn)生和Th1的分化.NLRP3炎癥小體組裝需要細(xì)胞內(nèi)C5活化和刺激C5a受體1(C5aR1),C5aR1由表面表達(dá)的C5aR2負(fù)調(diào)控.T細(xì)胞中異常的NLRP3炎癥小體活性影響人類自身炎癥性疾病和小鼠炎癥和感染模型中的炎癥反應(yīng)[32].慢性炎癥階段,典型的NLRP3炎癥小體被過度激活,增加IL-1β和IL-18從固有層巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的釋放,同時(shí)IL-1β和IL-18的釋放可誘導(dǎo)T細(xì)胞向致病性Th1和Th17的表型分化,從而維持炎癥反應(yīng)[33].

哺乳動(dòng)物在腸道內(nèi)有一定數(shù)量的腸道菌群的定殖,腸道菌群導(dǎo)致腸道調(diào)節(jié)性TT細(xì)胞(Treg)的激活和生成,對(duì)于Treg細(xì)胞的激活能夠在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài).而對(duì)于Treg激活的失敗則會(huì)誘發(fā)Th17和Th1細(xì)胞的應(yīng)答.因此,腸道共生菌誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞的應(yīng)答是腸道固有免疫應(yīng)答機(jī)制中重要的一環(huán),另外對(duì)于宿主-腸道菌群的T細(xì)胞共生的維持具有作用[34].實(shí)驗(yàn)表明,Dectin-1通過修飾微生物群來控制Treg細(xì)胞的分化,從而調(diào)節(jié)腸道免疫穩(wěn)態(tài)[35].從人源微生物中分離出CD4(+)FOXP3(+)調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞誘導(dǎo)菌株,因?yàn)樗鼈冊(cè)谠鰪?qiáng)Treg細(xì)胞豐度和誘導(dǎo)重要的抗炎分子的高效性,包括IL-10和誘導(dǎo)性T細(xì)胞共刺激物,口服給藥上述菌株或許能應(yīng)用到未來人類結(jié)腸炎等疾病的治療[36].而研究表明,NLRP3炎癥小體與Th17/Treg細(xì)胞平衡的調(diào)控密切相關(guān)[37].NLRP3炎癥小體的激活能迅速產(chǎn)生炎癥的主要調(diào)節(jié)因子IL-1β,IL-1β的表達(dá)導(dǎo)致Th17/Treg失衡[38].而Treg細(xì)胞和Th細(xì)胞在調(diào)控腸道炎癥和免疫反應(yīng)中的雙向機(jī)制,這也可能是NLRP3炎癥小體的作用呈雙向性的原因之一.

4 討論

目前對(duì)于IBD研究較為成熟的細(xì)胞因子有白介素家族中的IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IL-22等,而白介素家族作為炎癥細(xì)胞因子的一部分,具有介導(dǎo)炎癥因子相關(guān)通路的作用,而針對(duì)于阻斷白介素受體信號(hào)通路的靶點(diǎn)可以作為治療IBD的方法[39].IL-6、IL-22也有促進(jìn)腸上皮細(xì)胞再生的作用[40,41],如IL-22誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞中H19的表達(dá),拮抗腸上皮細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控,從而在炎癥條件下維持腸上皮再生及黏膜愈合發(fā)揮重要作用[42].而IL-1β和IL-18上游的NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)自裂解激caspase-1,裂解IL-1β和IL-18的前體,產(chǎn)生生物活性的細(xì)胞因子,從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)以及自身免疫應(yīng)答的產(chǎn)生.在DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型中,IL-1β主要以髓系細(xì)胞來源促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的愈合和修復(fù)[43].腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生的IL-18,以前被認(rèn)為是保護(hù)黏膜屏障免受炎癥的影響,對(duì)于驅(qū)動(dòng)腸屏障完整性的病理性破壞至關(guān)重要,直接抑制結(jié)腸炎發(fā)生之前杯狀細(xì)胞的成熟[44].

NLRP3炎癥小體通過調(diào)控腸道內(nèi)的巨噬細(xì)胞、腸道DCs以及T細(xì)胞,連接腸道內(nèi)的固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答.大腸桿菌菌株通過NLRP3炎癥小體介導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生,對(duì)腸黏膜的產(chǎn)生侵襲性和難以控制的炎癥反應(yīng).另外,NLRP3炎癥小體抑制FLT3L介導(dǎo)的CD103+DC的分化,誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th17分化,維持腸道炎癥反應(yīng).但同時(shí),NLRP3炎癥小體使IL-1β分泌和表達(dá),增加Treg誘導(dǎo)的具有增強(qiáng)抗炎能力和重塑腸道微生物群的能力,維持腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài).可以說NLRP3作為腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)的分子開關(guān),通過IL-1β使局部免疫細(xì)胞向炎癥表型轉(zhuǎn)變.

我們發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體的作用有呈雙向性的傾向,有研究認(rèn)為是急性期與慢性期NLRP3炎癥小體表現(xiàn)出不同的功能所致.在炎癥的急性期,NLRP3炎癥小體具有保護(hù)性的功能,有助于組織修復(fù)和維持上皮屏障的完整性.而在慢性炎癥階段,典型的NLRP3炎癥小體被過度激活,誘導(dǎo)IL-1β和IL-18產(chǎn)生,使T細(xì)胞向致病性Th1和Th17的表型分化,從而導(dǎo)致和維持炎癥反應(yīng)[33].

而也有研究認(rèn)為,NLRP3炎癥小體這種看似矛盾的作用其實(shí)與其調(diào)控T細(xì)胞免疫、固有免疫及腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用機(jī)制相關(guān).腸道菌群調(diào)節(jié)腸內(nèi)穩(wěn)態(tài),如果破壞炎癥小體信號(hào)傳導(dǎo)可導(dǎo)致病原的定植增加而導(dǎo)致腸道內(nèi)環(huán)境紊亂[25].當(dāng)排除了野生型小鼠和NLRP3-/-小鼠的糞便菌群分布差異后,仍可以觀察到NLRP3-/-小鼠中的保護(hù)型表型,這說明是NLRP3炎癥小體而非腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞,調(diào)控T細(xì)胞免疫反應(yīng)及相關(guān)固有免疫反應(yīng)[18].這或許可以解釋NLRP3炎癥小體在不同文獻(xiàn)中所表現(xiàn)出的雙向性作用.

NLRP3炎癥小體以及其細(xì)胞因子在很多慢性疾病的病因病機(jī)中都有被提到[45].而近年來,阻斷NLRP3炎癥小體活性的藥物在IBD的研究中有了一定的成果.而使用NLRP3炎癥小體依賴的pro-caspase-1、IL-1β和IL-18的抑制劑 Fc11a-2治療小鼠,能夠減輕急性結(jié)腸炎[46].NLRP3炎癥小體敲除對(duì)于DSS誘導(dǎo)的小鼠的結(jié)腸炎有改善作用,而caspase-1 拮抗劑 pralnacasan對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎有明顯治療作用,表明NLRP3炎癥小體在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中具有重要作用,是未來治療IBD有潛力的藥物靶點(diǎn)之一[47].