趙佳偉,王玉剛,施 敏

趙佳偉,江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院 江蘇省鎮(zhèn)江市 212000

趙佳偉,王玉剛,施敏,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院消化內(nèi)科上海市 213300

核心提要：本文簡(jiǎn)要概述了細(xì)胞外囊泡的結(jié)構(gòu)、來(lái)源和功能,著重闡述了細(xì)胞外囊泡促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展的機(jī)制和細(xì)胞外囊泡在肝纖維化中的診斷和治療價(jià)值,并提出了對(duì)未來(lái)進(jìn)一步研究的展望.

0 引言

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)多囊泡體的納米級(jí)囊泡,能夠攜帶核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì),參與細(xì)胞間的信息交流.自發(fā)現(xiàn)以來(lái),EVs已被證實(shí)在多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-4].{van Niel,2018 #52;Tkach,2016 #49}肝纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程,其特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)或瘢痕的堆積,是由多種病因?qū)е碌穆愿螕p傷引起的,包括慢性病毒感染、酒精性肝病,非酒精性脂肪肝的進(jìn)展形式.其中肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)的激活是肝纖維化的主要原因,HSCs受到多種刺激后被激活,分泌大量ECM[5-8].EVs包含有多種活性物質(zhì),包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA和microRNA等,可以調(diào)節(jié)受體細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路,其中之一發(fā)揮主要作用的是其攜帶的microRNA,microRNA是由基因編碼的長(zhǎng)度約22-23 nt的單鏈RNA分子,參與基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控,通過(guò)與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(un-translated region,UTR)相互作用來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[9-12].EVs內(nèi)攜帶的microRNA能夠?qū)Ω卫w維化的發(fā)生發(fā)展起到了重要的調(diào)節(jié)作用,但是具體的作用機(jī)制還不明了[13-16].本文綜述了EVs對(duì)于肝纖維化的主要研究進(jìn)展其在肝纖維化發(fā)生診治中的作用.

1 細(xì)胞外囊泡的結(jié)構(gòu)、來(lái)源及功能

EVs是膜性納米級(jí)囊泡,由跨膜蛋白和包圍胞漿蛋白和RNA的脂質(zhì)雙層組成,直徑為100-1000 nm,EVs可以從細(xì)胞質(zhì)膜中以萌芽方式形成并釋放出來(lái)[17].通過(guò)透射電鏡觀察EVs通常表現(xiàn)為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形,Western blot檢測(cè)EVs中的相關(guān)蛋白,可以發(fā)現(xiàn)EVs多表達(dá)CD9、C63、Tsg101和Alix等蛋白.EVs的生物合成過(guò)程起始于多囊泡體的內(nèi)陷形成管腔內(nèi)囊泡,接著多囊泡體和質(zhì)膜融合,將管腔內(nèi)囊泡釋放到ECM,這些被釋放到細(xì)胞外基質(zhì)的囊泡就被稱為EVs.Rab家族蛋白能夠調(diào)控EVs的分泌,沉默Rab27a或者Rab27b會(huì)抑制多囊泡體與質(zhì)膜的連接位點(diǎn)[18].

科學(xué)家最初是在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了EVs,EVs從細(xì)胞中被分泌被認(rèn)為可能與細(xì)胞膜功能喪失有關(guān)[19].多年后,人們發(fā)現(xiàn)EVs是用于排泄細(xì)胞內(nèi)代謝廢物和細(xì)胞表面的廢棄蛋白[20].之后的幾年,EVs被發(fā)現(xiàn)具有抗原提呈功能,參與機(jī)體的免疫反應(yīng).近幾年來(lái),有研究表明,EVs可以由多種不同的細(xì)胞分泌,依據(jù)其不同的來(lái)源,EVs在不同的生理過(guò)程中發(fā)揮作用.人類和小鼠的B淋巴細(xì)胞都能夠分泌EVs,釋放MHC-Ⅱ類分子誘導(dǎo)T細(xì)胞的反應(yīng);樹(shù)突狀細(xì)胞也能夠分泌EVs,它們分泌的EVs含有MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ類分子,能夠抑制小鼠腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[21];間質(zhì)干細(xì)胞分泌的EVs能夠減少心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷[22];人肝干細(xì)胞來(lái)源的EVs能夠預(yù)防腎纖維化[23];除此之外,EVs還在大多數(shù)體液如血液、尿液和腹水中發(fā)現(xiàn)[24].

較為重要的是有研究表明EVs含有RNA,包括mRNA和microRNA等核酸內(nèi)容物,并且這些核酸內(nèi)容物可以被轉(zhuǎn)運(yùn)到其他細(xì)胞中,起到遺傳物質(zhì)交換的作用.現(xiàn)在,EVs的細(xì)胞間信號(hào)交流作用越發(fā)受到人們的注意,總之,EVs對(duì)于臨床疾病的的診治有著巨大的潛力,為疾病的診療提供了新的方向.

2 細(xì)胞外囊泡促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展

肝纖維化的發(fā)生發(fā)展受到多因素的影響,細(xì)胞內(nèi)蛋白和核酸信號(hào)調(diào)節(jié)著以TGF-β為主的與肝纖維化相關(guān)的信號(hào)通路.細(xì)胞分泌的EVs所攜帶的蛋白核酸分子對(duì)肝纖維化的發(fā)展起著重要的作用.肝臟損傷后,HSCs會(huì)被激活變?yōu)榧±w維母細(xì)胞,分泌更多的促纖維化的物質(zhì)如α-SMA和膠原蛋白,它們分別通過(guò)促進(jìn)傷口收縮和提供ECM來(lái)促進(jìn)修復(fù).在慢性損傷期間,膠原纖維不斷地沉積,損害正常的肝功能.減少基質(zhì)產(chǎn)生或干預(yù)HSCs降解基質(zhì)有望成為抗纖維化策略[25].

HSCs分泌的EVs攜帶有結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF/CCN2)蛋白或者CCN2的mRNA.研究人員發(fā)現(xiàn)在激活態(tài)的或者是轉(zhuǎn)染了CCN2-GFP基因的HSCs中CCN2或CCN2 mRNA的含量或升高.在用染料標(biāo)記或GFP示蹤條件下,研究人員能夠看到這些由HSCs分泌的EVs能夠被激活態(tài)和靜止?fàn)顟B(tài)下的HSCs內(nèi)吞,導(dǎo)致ECM分泌增多,繼而加速慢性肝病中的纖維化過(guò)程.從而能看出EVs內(nèi)含有的信號(hào)物質(zhì)成為了肝纖維化發(fā)病的成因之一[26].microRNA是由基因編碼的長(zhǎng)度約22-23 nt的單鏈RNA分子,參與基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控,對(duì)肝纖維化有著重要的調(diào)節(jié)作用.EVs中的microRNA依據(jù)其種類的不同對(duì)肝纖維化有不同的作用.一部分microRNA能夠抑制纖維化的發(fā)展,例如,在非損傷肝臟或靜止?fàn)顟B(tài)下的HSCs中可以檢測(cè)到高水平的microRNA-214,而在纖維化的肝臟或是激活狀態(tài)的HSCs中microRNA-214的水平大大降低.通過(guò)誘導(dǎo)肝星形細(xì)胞中CCN2的表達(dá),發(fā)現(xiàn)促進(jìn)纖維化的原因是由于microRNA-214表達(dá)的減少,而microRNA-214能夠與CCN2的mRNA的3'UTR結(jié)合抑制CCN2及其下游蛋白的表達(dá),microRNA-214表達(dá)的下降會(huì)促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展.重要的是,microRNA-214存在于肝星形細(xì)胞的EVs中,它可以通過(guò)EVs的分泌被運(yùn)輸?shù)洁徑钠渌鸋SCs中,進(jìn)而調(diào)節(jié)CCN2相關(guān)的纖維化信號(hào)通路[27].深層次地,研究人員發(fā)現(xiàn)microRNA-214是dynamin 3相反鏈(DNM3os)的產(chǎn)物,它可以直接抑制CCN2 mRNA的表達(dá).更進(jìn)一步地研究表明轉(zhuǎn)錄因子Twist1通過(guò)促進(jìn)microRNA-214的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而抑制CCN2的表達(dá).Twist1在纖維化肝臟中的HSCs或體外激活狀態(tài)下的HSCs中的表達(dá)均受到抑制.未激活狀態(tài)的的HSCs分泌的EVs含有高水平的Twist1.EVs中Twist1在鄰近的HSCs之間穿梭,抑制受體細(xì)胞microRNA-214的轉(zhuǎn)錄、CCN2及其下游效應(yīng)因子的表達(dá).此外,HSCs中的microRNA-214也受到肝細(xì)胞來(lái)源的EVs的調(diào)節(jié),表明EVs Twist1的轉(zhuǎn)移可以發(fā)生在不同類型的細(xì)胞之間.最后,來(lái)自肝纖維化小鼠的EVs中Twist1、microRNA-214或CCN2的水平反映了肝纖維化的水平,突出了這些成分作為新的肝纖維化生物標(biāo)志物的潛在用途[28].

丙肝病毒(hepatitis C virus,HCV)感染的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞能夠分泌含有microRNA-19a的EVs,這些囊泡能被鄰近的肝星形細(xì)胞內(nèi)吞激活HSCs,microRNA-19a靶向作用于HSCs中的SOCS-STAT3信號(hào)通路,激活TGF-β信號(hào)通路,增加促纖維化基因的表達(dá).并且研究人員發(fā)現(xiàn)HCV感染的肝纖維化患者血清中的microRNA-19a水平高于健康人群或非HCV感染的肝病患者血清中的水平[29].在肝損傷中,EVs介導(dǎo)TLR3活化,繼而增強(qiáng)γδ T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A而加重肝纖維化.研究人員發(fā)現(xiàn)由CCl4誘導(dǎo)的早期肝纖維化小鼠相較于TLR3敲除的小鼠,能夠分泌更高水平的白細(xì)胞介素17(IL-17).在體外實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn),用CCl4處理后的肝細(xì)胞分泌的EVs作用于HSCs,IL-17A、IL-1B和IL-23的表達(dá)都上升了,但是這一現(xiàn)象在TLR3敲除的HSCs中卻沒(méi)有出現(xiàn).因此,TLR3可能是一個(gè)新的用于治療肝纖維化靶點(diǎn)[30].棕櫚酸(PA,palmitic acid)處理能增強(qiáng)了肝細(xì)胞EVs的產(chǎn)生,并改變了它們的外顯子microRNA譜,當(dāng)HSCs與來(lái)自PA處理的肝細(xì)胞EVs培養(yǎng)時(shí),與來(lái)自對(duì)照組處理的肝細(xì)胞的EVs相比,PA處理組的纖維化發(fā)展有關(guān)的基因顯著增加.在從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎的過(guò)程中,EVs可能在肝細(xì)胞和HSCs之間的聯(lián)系起到重要的作用[31].有研究人員發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)受體α(PDGFRα)以SHP2依賴的方式富集于PDGF-BB處理的HSCs來(lái)源的EVs中,并且這些PDGFRα富集的EVs參與肝纖維化的發(fā)展.與健康人相比,肝纖維化患者血清EVs的PDGFRα水平升高.來(lái)源于PDGFRα過(guò)表達(dá)細(xì)胞的EVs促進(jìn)了體外HSCs遷移和體內(nèi)肝纖維化.最后,對(duì)四氯化碳給藥的小鼠給予SHP2抑制劑SHP099可抑制血清EVs中PDGFRα的富集并減少肝纖維化[32].

總的來(lái)說(shuō),以肝細(xì)胞和HSCs為主多種細(xì)胞分泌的EVs,能夠促進(jìn)HSCs細(xì)胞間的信息交流,激活HSCs分泌ECM等促進(jìn)肝纖維化的相關(guān)蛋白,引起或加重膠原的成績(jī),加重肝纖維化.

3 細(xì)胞外囊泡在肝纖維化診斷中的作用

基于EVs與肝纖維化之間種種關(guān)系的發(fā)現(xiàn),研究人員認(rèn)為EVs可以用于肝纖維化的無(wú)創(chuàng)性診斷.相較于肝臟活檢或是影像學(xué)檢查,利用EVs的液體活檢能夠減少對(duì)病人的創(chuàng)傷并提高準(zhǔn)確性.

有研究人員進(jìn)行了一項(xiàng)病例對(duì)照研究,發(fā)現(xiàn)血清中可溶性的CD81與慢性HCV感染的病人血清炎癥水平和肝臟纖維化程度相關(guān).慢性丙肝患者血清可溶性CD81水平明顯高于健康組和治愈患者組[33].還有研究人員將輕度丙型肝炎患者和健康對(duì)照組相比,丙型肝炎患者的血液中T細(xì)胞EVs含量升高.利用質(zhì)譜、熒光激活細(xì)胞分類分析和功能阻斷抗體等技術(shù)顯示出CD147/Emmprin作為CD81 T細(xì)胞EVs激活HSCs的候選跨膜分子.因此,循環(huán)T細(xì)胞EVs是肝纖維化新的診斷標(biāo)志物[34].慢性乙型和HCV感染與HSCs向的激活有關(guān),為了降低診斷帶來(lái)的創(chuàng)傷,提高診斷的特異性,研究人員通過(guò)收集早期肝纖維化患者的血樣本,構(gòu)建了肝纖維化病人與活化的小鼠原代HSCs的microRNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)纖維化患者EVs中microRNA的表達(dá)與肝纖維化的病程相關(guān),這些microRNAs可以用作肝纖維化早期階段的標(biāo)志物[35].除了血液之外,也有研究人員想要從尿液中的EVs中找到具有差異性的蛋白質(zhì)來(lái)對(duì)肝臟疾病作出無(wú)創(chuàng)性的診斷.他們從D-半乳糖胺處理的大鼠的尿樣中提取到了細(xì)胞外的囊泡,并進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)的分析,鑒定出28種以前未報(bào)道于這些囊泡的蛋白質(zhì).最后研究人員提出了一些蛋白質(zhì),如Cd26、Cd81、Slc3A1和Cd10,這些蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)在尿液囊泡中有不同于某些分析模型的表達(dá),作為肝損傷的潛在生物標(biāo)志物[36].

利用血液或尿液中的EVs進(jìn)行肝纖維化的無(wú)創(chuàng)性診斷具有較高的安全性和特異性,因此EVs在肝纖維化的診斷中起到了重要的作用.

4 細(xì)胞外囊泡在肝纖維化治療中的作用

在肝纖維化的治療方面,研究發(fā)現(xiàn)EVs有較好的治療潛力.隨著間充質(zhì)干細(xì)胞(embryonic stem cells-derived mesenchymal stem cell,ES-MSC)治療的不斷發(fā)展,其分泌的EVs也受到了研究人員極大的關(guān)注.利用ES-MSC的EVs對(duì)肝纖維化小鼠或大鼠模型治療也起到了與干細(xì)胞治療相似的作用.

人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell-Exosome,hucMSC-Ex)來(lái)源的EVs移植入纖維化肝臟中,可以恢復(fù)肝功能,改善肝纖維化.與對(duì)照組相比,hucMSC-Ex產(chǎn)生的EVs處理過(guò)后,肝臟質(zhì)地變得柔軟,Ⅰ型和Ⅲ型膠原水平大幅度下降,降低了血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的水平,同時(shí)血清TGF-β1的水平也顯著下降.在體外實(shí)驗(yàn)中研究人員發(fā)現(xiàn),在臍帶間質(zhì)干細(xì)胞EVs處理過(guò)后,細(xì)胞內(nèi)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)相關(guān)的蛋白E-cadherin陽(yáng)性細(xì)胞增加,N-cadherin和vimentin陽(yáng)性細(xì)胞減少,更有甚者,臍帶間質(zhì)干細(xì)胞能夠逆轉(zhuǎn)由人重組TGF-β1造成上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)[37].另一項(xiàng)研究表明絨毛膜CP-MSCs能夠在CCl4引起大鼠肝纖維化模型中取得很好的療效,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CP-MSCs分泌的EVs攜帶microRNA-125b,能夠抑制Hh(hedgehog,Hh)信號(hào)通路,從而減輕肝纖維化,促進(jìn)肝臟的再生[38].同樣的,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSC)分泌的EVs可以被利用來(lái)向HSCs遞送microRNAs.ADSC被工程化以過(guò)表達(dá)microRNA-181-5p,體外分析證實(shí),microRNA-181-5P ADSC通過(guò)分泌EVs來(lái)實(shí)現(xiàn)microRNA-181-5P的轉(zhuǎn)移,攜帶有microRNA-181-5p的EVs能夠被運(yùn)輸?shù)酱笫蟮腍SCs,被該細(xì)胞內(nèi)吞,接著microRNA-181-5p能夠下調(diào)Stat3和Bcl-2的信號(hào)通路,并且激活HST-T6細(xì)胞的自噬,繼而減少肝星形細(xì)胞產(chǎn)生的I型膠原、纖連蛋白、波形蛋白、α-SMA等致纖維化物質(zhì)的產(chǎn)生,減輕肝臟的纖維化.此外,在TGF-β1誘導(dǎo)的HST-T6細(xì)胞中,加入microRNA-181-5p-ADSC的EVs后,與對(duì)照組相比,抑制了纖維化基因的表達(dá)[39].人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的ES-MSC來(lái)源的EVs在硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)誘導(dǎo)的大鼠慢性肝損傷中顯示出與親代細(xì)胞相當(dāng)?shù)拿庖哒{(diào)節(jié)活性和并能改善肝硬化.基因表達(dá)分析還顯示,膠原酶、抗凋亡基因和抗炎細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào),主要纖維化因子、促凋亡基因和促炎細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào).因此,ES-MSC EVs可以調(diào)節(jié)TAA損傷小鼠模型中的促炎和抗炎細(xì)胞因子[40].

microR-199a-5p可以抑制野生型小鼠CCN2基因3'端UTR而抑制CCN2的表達(dá),microR-199a-5p主要表達(dá)于靜止的小鼠HSCs中,肝纖維化小鼠肝臟或活化的小鼠原代HSCs中CCN2表達(dá)上調(diào)與microRNA-199a-5p下調(diào)有關(guān),將靜止?fàn)顟B(tài)下小鼠肝星形細(xì)胞中含有microRNA-199a-5p的EVs輸送到激活狀態(tài)下的小鼠肝星形細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)CCN2 3'端UTR的活動(dòng)受到了抑制,減少了α-SMA或膠原蛋白的產(chǎn)生.因此,通過(guò)microRNA-199a-5p抑制CCN2可以部分解釋靜止HSCs中低水平的纖維原性基因表達(dá),并且在激活HSCs中導(dǎo)致抑制性基因表達(dá).這為肝纖維化的治療提供了潛在的靶點(diǎn)[41].在小鼠中,microRNA-34c、-151-3p、-483-5p、-532-5p和-687在正常小鼠中的EVs中的表達(dá)比肝纖維化小鼠中的EVs高,microRNA的模擬物能夠抑制活化了的HSCs中的纖維基因表達(dá).同樣,健康人血清EVs減輕了HSCs的激活表型,健康人群血清中分離的EVs中的microR-34c、-151-3p、-483-5p或-532-5p均高于肝纖維化患者EVs中的.因此,來(lái)自正常健康個(gè)體的血清EVs天生具有抗纖維發(fā)生和抗纖維化的特性,并且含有對(duì)活化的HSCs或損傷的肝細(xì)胞具有治療作用的microRNAs[16].

利用EVs治療肝纖維化的研究主要著圍繞ES-MSC展開(kāi),EVs擁有與其來(lái)源細(xì)胞相似的功能,ES-MSC來(lái)源的EVs能夠?qū)w維化的肝臟起到修復(fù)作用,從而減輕肝纖維化.

5 結(jié)論

EVs對(duì)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展和診治可能具有重要的意義.EVs是由細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡,其內(nèi)部包含了多種活性物質(zhì),包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA和microRNA等.EVs通過(guò)與靶細(xì)胞的融合介導(dǎo)細(xì)胞間的相互交流,并調(diào)控受體細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路,改變細(xì)胞的表型與功能.研究人員期望基于此開(kāi)發(fā)出無(wú)創(chuàng)診斷方法,不論是局部組織還是循環(huán)血液中囊泡表面標(biāo)志蛋白的表達(dá)量,或是囊泡內(nèi)包含microRNA的定量,都有望成為肝纖維化診斷新標(biāo)志物.更進(jìn)一步地,研究人員能夠利用這些特異性的標(biāo)志物設(shè)計(jì)出靶向藥物,從而對(duì)肝纖維化進(jìn)行更加精準(zhǔn)化的治療與預(yù)防.

然而,以上所討論的種種可能還存在著一些挑戰(zhàn),我們需要更好地理解EVs發(fā)揮作用的分子機(jī)制.其中一個(gè)重要的挑戰(zhàn),是需要開(kāi)發(fā)體內(nèi)控制囊泡分泌的技術(shù),以此來(lái)規(guī)避致病囊泡的產(chǎn)生,增加具有治療作用的囊泡的分泌.另一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是需要我們理解EVs的生理功能,精確地確定在體內(nèi)細(xì)胞分泌的囊泡是如何與什么類型的細(xì)胞優(yōu)先相互作用.但不管怎樣,我們?cè)絹?lái)越多地了解囊泡與肝臟細(xì)胞和組織相互作用的機(jī)制,以及它們?cè)诟鞣N條件下作為肝纖維化治療的潛在用途,為未來(lái)的研究提供了令人興奮的線索.