石子儀，吳云，朱月美，崔海鷗，王敏，殷洪梅，姜勇，屠鵬飛*

1.北京大學 藥學院 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，北京 100191；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222047；3.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇 連云港 222047；4.中藥提取物精制新技術重點實驗室，江蘇 連云港 222047

中藥肉蓯蓉為列當科植物肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma或管花肉蓯蓉Cistanchetubulosa(Schenk)Wight干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖。具有補腎陽，益精血，潤腸通便等功效，多用于腎陽不足，精血虧虛，陽痿不孕，腰膝酸軟，筋骨無力，腸燥便秘[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，肉蓯蓉具有提高性功能、抗老年癡呆癥和帕金森病、提高學習記憶能力、抗衰老、抗疲勞、保肝、通便等多方面的作用[2-3]。大量的研究證實，肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分具有明顯的提高學習記憶能力、抗老年癡呆癥和帕金森病等的作用[4-5]，寡糖類及多元醇類成分具有潤腸通便的作用[6-8]?！吨腥A人民共和國藥典》僅對肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量進行了測定，未對其潤腸通便作用的有效成分進行測定，難以實現(xiàn)對肉蓯蓉藥材的全面質(zhì)控。為了克服這一局限性，建立與肉蓯蓉主要功能主治相關的多指標質(zhì)量評價體系，本研究采用HPLC-ELSD[9-11]，建立了肉蓯蓉藥材中甜菜堿、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖的定量分析方法，并對58批不同產(chǎn)地的荒漠肉蓯蓉藥材和10批新疆和田地區(qū)的管花肉蓯蓉藥材進行了檢測，為今后肉蓯蓉藥材的全面質(zhì)量控制與評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Sartorius電子天平BT 25 S、BS 124 S(北京賽多利斯天平有限公司)；Agilent 1100 高效液相色譜儀；ALLTECH 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)；超聲波清洗器 KQ 250型(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品：甜菜堿(批號：110894-201604，純度：99.2%)、甘露醇(批號：10053-201304，純度：99.0%)、D-果糖(批號：111504-201703，純度：99.8%)、D-無水葡萄糖(批號：110833-201506，純度：99.9%)、蔗糖(批號：111507-201303，純度：99.8%)，均購自中國食品藥品檢定研究院。

荒漠肉蓯蓉藥材收集于內(nèi)蒙古、新疆、甘肅等地，共計58批，由北京大學藥學院屠鵬飛教授鑒定為列當科植物肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，見表3。

管花肉蓯蓉藥材收集于新疆和田地區(qū)，共計10批，由北京大學藥學院屠鵬飛教授鑒定為列當科植物管花肉蓯蓉Cistanchetubulosa(Schenk)Wight的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，見表4。

1.3 試劑

乙腈為色譜純(天津市彪仕奇科技發(fā)展有限公司)、甲醇為色譜純(天津市賽孚世紀科技發(fā)展有限公司)，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為ShodexAshaipak NH2P-50 4E 聚合凝膠柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(77∶23)；流速為0.7 mL min-1；柱溫為25 ℃；蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)：漂移管溫度為100 ℃，載氣流速為3 L min-1。

2.2 對照品溶液的制備

取甜菜堿、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含甜菜堿、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖各0.25 mg的混合溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取肉蓯蓉藥材粉末(過四號篩)約1.0 g，精密稱定，置100 mL棕色量瓶，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，浸泡30 min，超聲 (功率250 W，頻率35 kHz)處理40 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，靜置。精密吸取上清液5 mL，置25 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.2 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 測定法

分別精密吸取對照品溶液5、10 μL，供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，按外標二點法對數(shù)方程計算。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗

按2.1項下色譜條件，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，見圖1。供試品色譜圖中呈現(xiàn)與對照品色譜峰保留時間一致的色譜峰，分離度良好，色譜條件可行。

注：A.對照品；B.49號肉蓯蓉樣品；1.甜菜堿(betaine)；2.果糖(fructose)；3.甘露醇(mannitol)；4.葡萄糖(glucose)；5.蔗糖(sucrose)。圖1 對照品及49號肉蓯蓉樣品HPLC圖

2.6 線性關系考察

取甜菜堿、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖對照品適量，精密稱定，分別加水制成每1 mL含甜菜堿0.496 0 mg、甘露醇0.994 0 mg、果糖1.012 6 mg、葡萄糖1.088 2 mg、蔗糖0.992 2 mg的溶液，分別精密取甜菜堿0.099 2、0.248 0、0.4960、0.992 0、1.984 0、2.976 0 μg，甘露醇0.198 8、0.497 0、0.994 0、1.988 0、3.976 0、5.964 0 μg，果糖0.506 3、1.012 6、2.025 2、4.050 4、5.063 0、6.075 6 μg，葡萄糖0.217 6、0.544 1、1.088 2、2.176 4、4.352 8、6.529 2 μg，蔗糖0.198 4、0.496 1、0.992 2、1.984 4、3.968 8、5.953 2 μg，照2.1色譜條件進樣檢測，記錄峰面積；再分別以各對照品進樣量的對數(shù)值X(μg)為橫坐標，峰面積的對數(shù)值Y為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表1。

表1 線性關系考察結果

2.7 精密度試驗

精密吸取供試品溶液(49號樣品)，在上述色譜條件下，連續(xù)進樣6次，測定各色譜峰的峰面積，計算其RSD值。結果甜菜堿、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖峰面積的RSD分別為0.84%、2.56%、1.27%、2.62%、1.52%，表明本研究所用儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗

取肉蓯蓉樣品(49號樣品)6份，按2.3項下的方法制備供試品溶液，測定各色譜峰的峰面積，計算相應含量。結果甜菜堿、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖的平均含量(n=6)分別為7.93%、7.27%、8.74%、2.75%、4.81%，RSD分別為2.83%、1.94%、0.97%、2.60%、1.40%，表明該方法的重復性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液(49號樣品)，分別于配制后0、4、8、12、16、24 h進樣測定，計算各色譜峰的RSD值。結果甜菜堿、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖的RSD分別為0.61%、1.92%、1.34%、2.83%、0.69%，表明該供試品溶液在24 h之內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 回收率試驗

取已知含量的肉蓯蓉樣品(49號樣品)6份，精密稱定0.25 g，置50 mL棕色量瓶中，按1∶1濃度分別精密吸取混合對照品溶液25 mL(其中含甜菜堿0.790 0 mg mL-1，果糖0.723 6 mg mL-1，甘露醇0.881 2 mg mL-1，葡萄糖0.270 8 mg mL-1，蔗糖0.488 3 mg mL-1)加入樣品中，照2.3項下方法制備供試品溶液。按上述色譜條件檢測，計算其回收率，結果見表2，表明方法準確性良好。

表2 5個待測成分加樣回收率測定結果(n=6)

2.11 樣品測定

按照供試品溶液的制備方法和測定方法，對58批的荒漠肉蓯蓉樣品和10批管花肉蓯蓉樣品進行了測定，結果見表3、4，荒漠肉蓯蓉各產(chǎn)地各成分含量取均值后繪制柱狀圖見圖2。

表3 肉蓯蓉樣品5個成分含量測定結果(n=2) %

表4 管花肉蓯蓉樣品5個成分含量測定(n=2) %

注：—表示未檢出。

圖2 不同地荒漠肉蓯蓉5個成分含量均值柱狀分析圖

3 討論

3.1 指標成分的選擇

肉蓯蓉總寡糖為肉蓯蓉通便的有效部位[8]，筆者通過LC-MS及對照品對照分析該部位化學成分，確定該部位主要由甜菜堿、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖5個成分組成，因此選擇這5個成分作為肉蓯蓉藥材潤腸通便指標成分，建立含量測定方法。

3.2 色譜柱的選擇

甜菜堿、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖5個待測成分，極性比較大，在反相C18柱中不能保留，一般1～2 min即出峰，成分間無法分離，因此考察了適合于糖和多元醇分離的氨基柱Waters Bonoapar NH2(300 mm×4.6 mm,10 μm)和Phenomenex Bondclone 10 NH2(300 mm×3.9 mm,10 μm)，以及聚合物基質(zhì)的氨基柱Prevail Carbohydrate ES(250 mm×4.6 mm，5 μm)、ShodexAshaipak NH2P-50 4E(250 mm×4.6 mm，5 μm)。結果表明，聚合物基質(zhì)的氨基柱能夠有效地對這5個成分分離。

3.3 檢測器的選擇

5個待測成分均無明顯紫外吸收，無法直接使用紫外檢測器進行含量測定，因此本文采用HPLC-ELSD建立了肉蓯蓉糖醇類成分的定量分析方法，同時對ELSD檢測器的漂移管溫度、載氣流量等進行了考察，結果表明，該方法靈敏度高、重復性好、準確度高，可用于肉蓯蓉藥材及其他含甜菜堿及糖醇類成分的藥材的質(zhì)量控制。

3.4 供試品溶液的制備方法的考察

分別對不同的提取溶劑包括水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇等進行了比較，結果除70%甲醇及甲醇溶劑提取率略低外，其他溶劑無明顯差異，因此直接選擇《中華人民共和國藥典》肉蓯蓉“含量測定”項下50%甲醇作為溶劑，按照相關供試品溶液的制備方法進行制備，再稀釋5倍量測定糖醇類成分。

3.5 不同基原樣品的檢測與分析

本研究共測定了58批荒漠肉蓯蓉和10批管花肉蓯蓉藥材樣品中5個成分的含量。58批荒漠肉蓯蓉樣品中甜菜堿、甘露醇、果糖、葡萄糖和蔗糖的質(zhì)量分數(shù)分別在2.73%～17.65%、2.46%～16.34%、2.52%～22.74%、0.97%～14.06%、3.15%～27.16%；10批管花肉蓯蓉樣品中甘露醇、果糖和葡萄糖分別在1.00%～13.04%、2.98%～8.85%、1.09%～5.33%，未檢出甜菜堿及蔗糖成分。各批次間藥材成分含量差異均較大，且暫無規(guī)律可循，提示建立該含量測定標準控制藥材質(zhì)量的必要性。另外，利用該方法可有效區(qū)分2種肉蓯蓉基原植物，即管花肉蓯蓉不含有甜菜堿與蔗糖成分，而荒漠肉蓯蓉中這兩種成分含量較高。這也為分析2種肉蓯蓉藥材在質(zhì)地、生境不同提供了依據(jù)?；哪馍惾厮幉呐c管花肉蓯蓉藥材比較，質(zhì)地較軟，當?shù)乇环Q為“軟大蕓”，而管花肉蓯蓉被稱為“柴大蕓”，這是因為荒漠肉蓯蓉中含有蔗糖成分(3.15%～27.16%)。荒漠肉蓯蓉主要分布在內(nèi)蒙古的阿拉善，而管花肉蓯蓉主要分布在新疆的和田地區(qū)，氣溫較阿拉善地區(qū)高，而且在當?shù)爻２捎玫喂噙M行灌溉，但一旦氣溫降低，管花肉蓯蓉會發(fā)生嚴重的凍害，一方面和其含水量較高有一定關系，另外就和其所含成分有關。甜菜堿[12-13]是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對于植物的抗逆性增強起著重要的作用，比如抗鹽堿、抗干旱、耐低溫、抗強光。正是因為荒漠肉蓯蓉中含有了高含量的甜菜堿，使其比管花肉蓯蓉表現(xiàn)出更好的耐鹽堿、干旱和凍害的特性，而有了相對廣泛的分布。

3.6 不同產(chǎn)地荒漠肉蓯蓉樣品分析

58批荒漠肉蓯蓉藥材樣品中，產(chǎn)自內(nèi)蒙古阿拉善盟的有45批，內(nèi)蒙古王爺?shù)?磴口縣)的有3批，具體產(chǎn)地未知1批，全部49批藥材中5個成分含量各異，但無明顯差異，分析原因可能是藥材均產(chǎn)自同一片沙漠區(qū)域范圍，生態(tài)與地理環(huán)境相近，產(chǎn)品質(zhì)量較均一、穩(wěn)定。產(chǎn)自甘肅民勤縣有3批、產(chǎn)自新疆的有6批，根據(jù)圖2分析可知，與內(nèi)蒙古產(chǎn)的藥材比較，主要差異體現(xiàn)在果糖與蔗糖含量上，甘肅產(chǎn)藥材果糖含量相對最高，新疆產(chǎn)藥材蔗糖含量相對最高，但鑒于2個產(chǎn)地的樣品量低，該結論有待于收集更多樣品進行驗證。

3.7 小結

本研究建立了同時測定5種潤腸通便的活性成分的HPLC-ELSD，為肉蓯蓉藥材的質(zhì)量控制提供了更加便捷、高效、準確的方法，為提升肉蓯蓉藥材的質(zhì)量標準及進一步的開發(fā)提供了有意義的參考。