1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省德江縣民族中醫(yī)院，貴州 德江 565200；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002

鉑類藥物為大部分腫瘤化療的基石[1]，而順鉑作為臨床中最常用的一種，由于經(jīng)過(guò)腎臟代謝[2]，往往出現(xiàn)嚴(yán)重的腎毒性，使得大部分腫瘤病人被迫終止治療；目前西醫(yī)針對(duì)鉑類藥物所致腎毒性主要通過(guò)充分的水化來(lái)預(yù)防[3]，由于需要長(zhǎng)時(shí)間大量液體的輸入，使患者生活質(zhì)量逐漸下降；而中醫(yī)藥在預(yù)防鉑類藥物腎毒性方面具有其獨(dú)特的手段，且往往能獲得佳效。

龍膏[4-5]為我院國(guó)醫(yī)大師劉尚義教授經(jīng)驗(yàn)方，由鹿角膠、生熟地黃、桑椹等31味藥物組成，其主要功效為補(bǔ)腎填精、養(yǎng)心安神，方中鹿膠乃血肉有情之品，其補(bǔ)腎培元為君；生熟地黃活氣血，填精益髓，滋水補(bǔ)陰，能退虛熱兼潤(rùn)燥，為補(bǔ)腎之圣藥；佐以黃柏等寧神益智、交通心腎；砂仁為使，鼓蕩脾胃之氣，用冰糖者亦有甘溫補(bǔ)中、和中緩急之功，諸藥同用，共奏補(bǔ)腎填精、養(yǎng)心安神之效。且在前期的臨床研究[5]中發(fā)現(xiàn)龍膏對(duì)鉑類藥物所致腎損傷的病人具有一定的改善作用。因此本研究希望通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明龍膏具有改善順鉑所致腎損傷的作用，初步了解其作用機(jī)制，并為臨床運(yùn)用提供更為有利的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用6～8周齡雄性清潔級(jí)BALB/c近交系小鼠40只，各小鼠體重量(18±2)g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2018-004。

1.2 藥物與試劑 龍膏由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科按原方比例制備膏劑，其由鹿角膠、生熟地黃、黃柏、砂仁等藥物組成，1 g膏方含原生藥材2.73 g，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。順鉑由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院西藥房提供，規(guī)格為10 mg/瓶，齊魯制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20073652，批號(hào)：AA1A8036A。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器 小鼠血清尿素氮(BUN)定量ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20181125)；小鼠血清肌酐(SCr)定量ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20181125)；小鼠血清胱抑素C(CysC)定量ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20181125)。Nikon-TS100型倒置相差顯微鏡(美國(guó))；HH-S2型水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司)；Xiang Yi-L600型離心沉淀機(jī)(德國(guó))；萊卡病理切片機(jī)(德國(guó))；電子分析天平(北京德賽公司)。

1.4 分組與造模

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)將40只小鼠分成5組，每組8只，空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，龍膏高、中、低劑量組，并適應(yīng)性喂養(yǎng)1周[4]。

1.4.2 建立腎損傷模型 分別給模型對(duì)照組，龍膏高、中、低劑量組，每組每只小鼠以順鉑4mg/kg單次腹腔注射制作腎損傷模型[4]，空白對(duì)照組不予處理，給藥5d(前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)順鉑給藥5天后小鼠出現(xiàn)尿素、肌酐及胱抑素C的升高，且腎小管多灶狀萎縮伴部分腎小管代償肥大，提示腎損傷模型造模成功)。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 實(shí)驗(yàn)前，將龍膏加適量蒸餾水濃縮配制成濃度分別為0.25 mg/mL、0.5 mg/mL及1 mg/mL的水溶液備用。給藥組根據(jù)動(dòng)物藥理實(shí)驗(yàn)用藥折算方法[6]，得出小鼠每日正常給藥劑量等于10 mg/kg并設(shè)為龍膏中劑量組；設(shè)龍膏高劑量組為正常劑量的兩倍為20 mg/kg/d；設(shè)龍膏低劑量組為正常劑量組的一半為5 mg/kg/d；模型對(duì)照組給予0.2 mL/10g/d蒸餾水灌胃；空白組不作任何處理；隔日稱體重1次，并根據(jù)體重變化調(diào)整灌胃劑量[4]。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察各組小鼠的精神、活躍度、飲食及毛發(fā)情況，同時(shí)注意各組小鼠是否有飲食差、腹瀉、消瘦及死亡現(xiàn)象。

1.6.2 小鼠體重變化情況 分別稱取小鼠造模前體重及小鼠處死前稱體重，觀察小鼠造模前及用藥后各組的體重變化情況[4，7]。

1.6.3 小鼠血清BUN、SCR、胱抑素C的含量 龍膏灌胃2周后，禁食24 h后稱體重，摘眼球法取血[4]，用離心管迅速接血，常溫靜置1 h后，離心，ELISA檢測(cè)小鼠血清尿素氮、肌酐及胱抑素C的含量。

1.6.4 小鼠腎臟系數(shù)及腎臟病理切片 取出雙側(cè)腎臟稱重并計(jì)算腎臟系數(shù)；將其中一側(cè)腎固定于4%多聚甲醛中[4]，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片及HE染色，染色成功后于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察腎小管上皮細(xì)胞、集合管上皮細(xì)胞及周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況和形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前各組小鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組小鼠體重相當(dāng)，實(shí)驗(yàn)具有可比性。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，空白對(duì)照組小鼠的精神狀態(tài)、活躍程度、進(jìn)食情況及毛發(fā)的光澤度均良好，且小鼠體重逐漸增加；模型對(duì)照組及龍膏高、中、低組小鼠則出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、活躍度下降、進(jìn)食減少及毛發(fā)光澤度減低且逐漸出現(xiàn)消瘦等情況，而模型對(duì)照組的癥狀最為突出，龍膏高、中、低組小鼠狀況稍優(yōu)于模型對(duì)照組。隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，模型對(duì)照組小鼠體重逐漸減輕，各龍膏組小鼠癥狀較前稍得到控制，與同期模型對(duì)照組動(dòng)物相比，活動(dòng)相對(duì)增多，反應(yīng)相對(duì)靈敏，飲食較前增加，但與空白組相比仍有不足。

2.2 小鼠順鉑干預(yù)前、處死前體重變化比較 本次實(shí)驗(yàn)初始動(dòng)物總數(shù)為40只，每組8只。順鉑干預(yù)前各組小鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。除空白對(duì)照組外其余各組小鼠體重均有明顯下降，且與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型對(duì)照組與龍膏干預(yù)組對(duì)比小鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 小鼠腎臟系數(shù)比較 模型對(duì)照組腎臟系數(shù)顯著上升，與空白對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；龍膏各劑量組與模型對(duì)照組比較腎臟系數(shù)均降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而各龍膏干預(yù)組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組小鼠體重?cái)?shù)據(jù)比較

注：與空白對(duì)照組比較,aP<0.05；與模型對(duì)照組比較,bP<0.05。

表2 各組小鼠腎臟系數(shù)比較

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型對(duì)照組比較，bP<0.05。

2.4 小鼠血清尿素氮、肌酐、血清胱抑素C含量變化 模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均明顯升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；龍膏各劑量組與空白對(duì)照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，龍膏各劑量組與模型對(duì)照組比較，其BUN、SCR和胱抑素C均有不同程度下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血清尿素氮、肌酐、血清胱抑素C比較

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型對(duì)照組比較，bP<0.05。

2.5 各組小鼠腎臟HE染色病理切片情況 空白組：腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管形態(tài)正常，且各結(jié)構(gòu)間界限清晰。模型對(duì)照組：腎小管出現(xiàn)多灶狀萎縮伴部分代償性肥大，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)大量顆粒變性，彌漫淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管內(nèi)可見(jiàn)大量蛋白管型。三組龍膏治療組：腎小管上皮細(xì)胞局灶性顆粒變性，灶狀淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)灶狀的腎小管蛋白管型。如圖1所示。

3 討論

順鉑引起腎臟的損害為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所公認(rèn)[8]，通常表現(xiàn)為尿中出現(xiàn)透明管型，血中尿素氨、肌酐及胱抑素C升高等現(xiàn)象?，F(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為鉑類藥物乃外來(lái)之邪毒[4]，瘀結(jié)于腎中致瘀毒互結(jié)，傷腎中陽(yáng)氣，腎陽(yáng)虧虛以致腎陰陽(yáng)兩虛，先天受損乃真虛，瘀毒于腎乃假實(shí)，固可標(biāo)本同治，補(bǔ)真虛，瀉假實(shí)。近年的中醫(yī)學(xué)者進(jìn)行了大量的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，運(yùn)用中醫(yī)藥針對(duì)順鉑所致腎損傷在預(yù)防和治療上都取得了巨大進(jìn)展，其減毒增效的優(yōu)勢(shì)日益顯著。根據(jù)中醫(yī)理論，各學(xué)者從不同方向闡述了其治療順鉑所致腎損傷的觀點(diǎn)如：宋燕等[9]認(rèn)為，腎為先天，脾胃乃后天，固以溫陽(yáng)利水為法用以治療順鉑所致腎損傷取得了一定的療效。楊桂染等[10]則認(rèn)為順鉑所致腎損傷乃心腎兩虛，固其以滋陰安神為法，其效亦可。劉沈林教授[11]認(rèn)為順鉑所致腎損傷乃脾腎兩虛，固其選用健脾養(yǎng)正消癥方，因其健脾益氣、補(bǔ)腎澀精、解毒消癥之功效能有效的保護(hù)化療后的腎功能。劉厚穎等[12]也認(rèn)為補(bǔ)腎乃第一要?jiǎng)?wù)。蔣小燕等[13]認(rèn)為順鉑所致腎損傷除有腎虛外，仍有邪毒瘀內(nèi)，固其采用益腎排毒的治療大法。而除了大量復(fù)方研究外，單藥治療順鉑所致腎損傷療效亦顯著，如黃芪的益氣固腎，現(xiàn)代學(xué)者利用它的提取物及其注射液在臨床上[14-16]用于順鉑所致腎損傷取得了良好的療效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)黃芪做了更為深入的研究，其大量的體外實(shí)驗(yàn)[17-18]證明黃芪的益氣固腎對(duì)順鉑所致腎損傷的保護(hù)作用明顯。

筆者認(rèn)為精藏于腎，腎精是構(gòu)成人體和維持生命活動(dòng)的基本物質(zhì)，腎精主生長(zhǎng)發(fā)育、主生殖、生髓、充腦，化生血液(精血互化)[19],根據(jù)“治未病”的理念，固采用“補(bǔ)腎填精，養(yǎng)心安神”為治療大法的龍膏治療順鉑所致腎損傷，方中鹿角膠益精血補(bǔ)腎陽(yáng)以填髓，生熟地黃滋腎陰，佐桑椹以補(bǔ)陰血，佐黃柏交通心腎、寧神益智，佐仙靈脾等補(bǔ)益元陽(yáng)，寓陽(yáng)生陰長(zhǎng)，諳合善補(bǔ)陰者必于陽(yáng)中求陰，陰得陽(yáng)生則生化無(wú)窮，佐以劉寄奴等活血化瘀、升陽(yáng)化津，補(bǔ)而不滯，砂仁為使，鼓蕩脾胃之氣，使藥力通行全身，用冰糖者亦有和中緩急、甘溫補(bǔ)中之功，諸藥同用，共奏補(bǔ)腎填精、養(yǎng)心安神之效。本方在治療順鉑所致腎損傷的同時(shí)而不影響順鉑的療效。

順鉑不僅具有腎臟毒性，且可引起消化系統(tǒng)的反應(yīng)而出現(xiàn)食欲下降、惡心、嘔吐等癥狀，通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)龍膏對(duì)順鉑所致腎損傷后的小鼠體重改善不明顯，可能與該藥物無(wú)法改善小鼠胃腸道功能有關(guān)；腎臟系數(shù)作為評(píng)價(jià)藥物性腎損傷的指標(biāo)之一，有其獨(dú)特的價(jià)值，從上述實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)龍膏對(duì)各組順鉑所致腎損傷的小鼠模型腎系數(shù)都具有一定的降低作用，提示龍膏對(duì)順鉑所致腎損傷有改善作用；臨床評(píng)價(jià)腎功能最常用指標(biāo)為血尿素氮、血肌酐及胱抑素C的含量，這些指標(biāo)的升高提示腎損傷，而龍膏能降低順鉑所致腎損傷的小鼠體內(nèi)血尿素氮、血肌酐及胱抑素C的含量，再次提示龍膏對(duì)順鉑所致腎損傷有改善作用；順鉑引起腎損傷的主要靶點(diǎn)為腎小管，使得腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，其具有一定的可逆性，而從上述實(shí)驗(yàn)中可得出龍膏能改善順鉑所引起的腎小管損傷。綜上所述，龍膏對(duì)小鼠順鉑所致的腎損傷具有一定的改善作用。然而，其具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的深入研究。